Bu yöntem, amino asit fazla üreticilerinin elde edilmesinde geleneksel analog temelli yaklaşıma etkili bir alternatif sağlar. Bu teknik, doğruluk, hassasiyet ve yüksek iş elde etme sağlayarak geleneksel analog tabanlı yöntemden daha iyi bir şekilde rekabet eder. Bu yöntem, amino asit aşırı üretim güçlü yönlerini anlama ve nadir kodon çeviri anlama yeni bir ışık tutuyor ve teorik olarak, tüm mikroorganizmalara uygulanabilir.
Bu protokol çoğunlukla takip etmesi kolay olan ancak uygun gergin sicim seçimini elde etmek için birden fazla deneme gerektirebilecek temel moleküler deneysel operasyonlara dayanır. Bu tekniğin görsel bir gösteri seçim performansı ve amino asit üreticileri belirlenmesinde bir tarama sistemi doğrudan takdir sunuyor. Bu yordamı başlatmak için, işaretleyici parçaları vektör ekleyin, buz üzerinde, bir ila yedi nokta beş mikrolitre montaj karışımı bir molar oranı on mikrolitre toplam hacmine.
Bir saat liğine 50 derecede kuluçkaya yat. Montaj ürününün beş mikrolitresini 42 santigrat derecede 30 saniye boyunca 50 mikrolitre bileşen hücresine dönüştürün. Bir saat boyunca 37 santigrat derece Katabolit baskı ortamı ile Super Optimal suyu hücreleri kurtarmak.
Sonra, LB Agar orta ve 37 santigrat derece gecede kuluçka onları plaka. Ertesi gün, plazmid izole etmek için tercih edilen bir ticari kiti kullanın. İlk olarak, yabani tip KanR taşıyan plazmid bir mikrolitre ile yetkili hücrelerin 50 mikrolitre dönüştürün.
KanR RC 29 içeren plazmid ile yetkin hücrelerin ikinci bir dizi dönüştürmek tüm lösin kodonları nadir kodon CTA ile değiştirilir. Metin protokolünde belirtildiği gibi hücre kültürünü plakalayın ve kuluçkaya yatırın. Daha sonra, nadir kodon açısından zengin türev yabani tip seçim marker geni barındıran koloniler mililitre başına 50 mikrogram konsantrasyonda kanamisin içeren beş kat seyreltilmiş LB orta beş mililitre içine bireysel olarak aktarın.
250 rpm sallayarak 37 santigrat derece bir shaker örnekleri kuluçka. Daha sonra, hücre kültürlerinin her birinin 200 mikrolitresini tanımlanmış zaman noktalarında triplicate olarak 96 kuyu plakasına aktarın. OD600 ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
KanR RC 29 marker genini barındıran lekeleri, L-lösin kaynağı olan veya olmayan kanamisin içeren 0,2 x LB ortamının beş mililitreiki setinde inoküle. Litre başına bir gram son konsantrasyoniçin medya birine L-lösin ekleyin. 250 rpm sallayarak 37 santigrat derecede bir shaker örnekleri kuluçka ve tanımlanan zaman noktalarında her kültür için OD600 ölçmek.
Başlamak için, yabani tip GFP veya yabani tip PPG taşıyan plazmid bir mikrolitre ile mutagenez için kullanılan ebeveyn suşu 50 mikrolitre dönüştürmek. Metin protokolünde belirtildiği gibi hücre kültürlerini plakalayın ve kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kolonileri tek tek, düzgün seyreltilmiş LB ortamının beş mililitresine aktarın.
Örnekleri 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda 250 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın. Floresan belirteçleri için, hücre kültürlerinin 200 mikrolitresini tanımlanmış zaman noktalarında triplicate olarak 96 iyi temiz alt arka plakaya aktarın. Floresan OD600'i ölçün ve floresan yoğunluğunu hesaplayın.
Kromojenik belirteçler için hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçün. Daha önce açıklandığı gibi besleme tayini yapın ve floresan yoğunluğunu veya renk gelişimini tanımlanan zaman noktalarında ölçün. İlk olarak, seçim marker KanR RC 29 taşıyan plazmid bir mikrolitre ile mutant hücrelerin 50 mikrolitre dönüştürmek, veya tarama işaretleri GFP RC veya PPG RC. Sonra, hücre kültürlerini 4000 kez G'de beş dakika santrifüj edin.
Seçim için, supernatant atın ve seçim işareti taşıyan hücrelere kanamisin içeren 0,2 x LB orta beş mililitre ekleyin. Numuneyi bir gecede 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıya kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 12 saat boyunca 37 santigrat derecede kanamisin ve kuluçka içeren 0.2 x LB agar orta üzerine gece kültürü plaka.
Tarama için, uygun antibiyotik içeren LB agar orta üzerine tarama marker barındıran hücrelerin uygun sayıda plaka. 8 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bundan sonra, plaka her tek koloni ile uygun antibiyotik içeren LB orta inoculate.
250 rpm sallayarak 37 santigrat derece bir shaker örnekleri kuluçka. GFP RC kullanılırsa OD600 ve floresan ölçün ve floresan yoğunluğunu hesaplayın. PPG RC kullanılırsa hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçün.
Aday suşların amino asit verimliliğini doğrulamak için, her aday suşları ile LB orta beş mililitre aşılayarak tohum kültürü hazırlamak ve hücrelerin bir shaker bir gecede 250 rpm ve 37 santigrat derecede büyümesine izin. Ertesi gün, hücre kültürünün bir mililitresinden hücreleri iki dakika boyunca 4000 kez G'yi santrifüj ederek hasat edin. Supernatant atın ve steril su bir mililitre ile palet ilike askıya.
20 000 mikrolitre hücre süspansiyonu ve 250 mililitrelik shaker'da 250 mililitrelik bir çalkalama da 24 saat boyunca 37 derece santigrat ile %4 glikoz içeren 20 mililitre M9 ortamı aşılayın. Ertesi gün, 4000 kez G beş dakika için kültür ortamının bir mililitre santrifüj. 200 mikrolitre süpernatantı temiz bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın.
Burada gösterilen konsantrasyonlarda L-lösin standart çözeltileri hazırlayın. Bir duman başlık olarak, bir milimolar trietilamin 100 mikrolitre ve bir molar fenil izotiyosiyanat 100 mikrolitre hem supernatant ve standartlara ekleyin. Çözeltileri hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, aynı tüp e 400 mikrolitre n-heksane ekleyin ve on saniye girdap. Alt faz amino asit türevleri içerir ve HPLC analizi için kullanılır. Alt fazı 0,2 mikrolitre politetrafloroetilen membranlar üzerinden süzün.
Bundan sonra, dakikada 0,42 mililitre akış hızına sahip c18 sütunu yla donatılmış ultra HPLC'de numunenin bir mikrolitresini ve 40 santigrat derece lik kolon sıcaklığında çalıştırın. Hedeflenen amino asitleri 254 nanometrede tespit etmek ve standart eğrinin altındaki tepe alanlarının haritasını koyarak konsantrasyonlarını hesaplamak için bir diyot dizi dedektörü kullanın. Bu çalışmada, amino asit overproducers aynı anda doğruluk, duyarlılık ve yüksek iş elde etmek için nadir kodon açısından zengin belirteçleri kullanılarak tespit edilmiştir.
Seçim sistemi için, nadir kodon açısından zengin antibiyotik direnci geni barındıran suşlar için OD600 keskin bir azalma yabani türü barındıran suş ile karşılaştırıldığında gözlenmelidir. Protein ekspresyonunda nadir kodonun inhibisyonu çoğunlukla aç koşullarda gerçekleşir. Karşılık gelen amino asit ekstra besleme sonra, nadir kodon açısından zengin antibiyotik direnci geni barındıran suşu için OD600 önemli ölçüde artar.
Tarama sistemi için floresan hücre sayısındaki floresan yoğunluğu, nadir kodon açısından zengin olan gendeki floresan proteini yabani tip genden daha fazla ifade eden zorlanma için önemli ölçüde daha düşüktür. Karşılık gelen amino asit besleme nadir kodon açısından zengin genlerden protein ifadeleri geri yükleyecek. Mor protein imal edilirken, nadir kodon açısından zengin PPG'den geliştirilen renk, yabani tip genden daha hafiftir.
Seyreltilmemiş LB orta ifade mor protein L-lösin besleme olmadan nadir kodon açısından zengin PPG yavaş ifade sağlar hücreler peleted kez görünür hale gelir. Ancak, bu nadir kodon açısından zengin PPG gen ekspresyonunun L-lösin ile beslenerek geliştirilmiş olduğu gerçeğini gizlemez. Nadir kodon bazlı strateji mutasyon kütüphanesinden hedeflenen amino asitlerin aşırı üreticileri tespit edebilir ve bu mutantlar ana suşları daha hedeflenen amino asitlerin daha yüksek miktarlarda üretmek gerekir.
Bu yordamı denerken, yabani tip belirteçleri barındıran hücreler ve nadir kodon açısından zengin türevleri barındıran hücreler arasında OD veya renk net bir ayrımcılık elde etmek için nadir kodon frekansı ayarlamak önemlidir. Transkripsiyon analizi ve genom dizilimi, amino asit üretimleri ile ilgili mekanizmayı araştırmak için seçilen suşlara uygulanabilir. Bu tekniği kullanarak, amino asit overproducers verimli bir şekilde tespit edilebilir ve genetik bilgilerin analizi amino asit aşırı üretim arkasındaki mekanizmaları içine yeni anlayışlar sunacak.
Amino asit türevi zararlı olabilir. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve bir duman başlık bu adımları gerçekleştirmek emin olun.
