Kalsiyum görüntüleme deneylerinden büyük miktarda veri elde etme kapasitesi, özellikle doku görüntüleme deneyleriyle büyük ölçüde artmıştır. Protokollerimiz, bu veri kümelerini ölçmek ve tanımlamak için uygun analiz tekniklerini açıklar. Protokollerimiz tüm dokularda kalsiyum sinyaline özgü bir dizi mekansal, zamansal ve yoğunluk değerleri üretir ve bu daha ilkel tabanlı analizlerde kaybedilebilir.
Görüntülemeden bir saat önce, cajal veya ICC'nin interstisyel hücreleri olan ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatını dönen disk konfokal mikroskobu aşamasına ifade eden bir fareden alınan ince bağırsağı aktarır. Ve sürekli 37 derece Santigrat Krebs-Ringer bikarbonat veya KRB çözeltisi ile doku perfüzyon. 60-100 X büyütme kullanarak ince bağırsağın dairesel ve uzunlamasına düz kas katmanları arasında stellat şekilli mienterik pleksus ICC veya ICC-MY bulun.
Daha sonra dairesel düz kas tabakası ve submukozal pleksus arasında tek bir düzlemde mil şeklinde derin kas pleksus ICC veya ICC-DMP bulmak ve TIFF görüntüleri bir yığın olarak film kaydetmek. ICC-DMP kalsiyum aktivitesinin spatiotemporal haritaları veya STM'leri oluşturmak için ImageJ'deki görüntü yığınını açın ve görüntü kalitesini değiştirmek için Resim, Tür ve 32 bit'i tıklatın. Satır tarası oluşturmak için satır seçim aracına sağ tıklayın ve parçalı satırı seçin.
Tek sol tıklamalar kullanarak, tüm hücre ana hatları ana hatları yla belirtildiğinde çift tıklatarak, tek bir ICC-DMP'nin orta erişimi boyunca bir çizgi çizin. Resim, Yığınlar ve Yeniden Dilimle'yi seçin. Açılır pencere görüntülenir.
Çizgi tonu'nu soldan sağa yönlendirmek için 90 derece döndür'ü seçin, böylece kalibrasyon yapılabilir ve x ekseninde zamana karşı okunabilir ve y ekseninde boşluk tutamaz ve Tamam'ı tıklatın. Spatiotemporal harita görünecektir. Haritadaki kalsiyum sinyallerinin genliğini doğru bir şekilde ölçmek için dikdörtgen seçimi seçin ve STM içinde en düzgün ve en yoğun floresan alanını gösteren alanın etrafına ilgi alanı çizin. Seçili ilgi alanı içindeki yoğunluğun ortalama değerini elde etmek için Analiz ve Histogram'ı tıklatın ve tüm STM'yi seçmek için Tümünü Seç'i tıklatın.
Ardından, İşlem, Matematik ve Bölme'yi tıklatın ve açılan kutuda ilgi çekici seçilen STM bölgesiyle yoğunluğun ortalama değerini girin. STM siyaha dönecek. Açılan pencerede Resim, Ayarla, Parlaklık/Kontrast ve Otomatik'i tıklatarak bunu düzeltin.
Hat tonu şimdi floresan sıfır floresan tarafından bölünmüş olarak ifade edilen floresan yoğunluğu ile genlik için kalibre edilecektir. STM, X ekseninde TIFF yığınındaki kare sayısını ve y ekseninde hücrenin uzunluğunu gösteren piksel sayısını görüntüler. Kalsiyum sinyallerinden gelen zamansal ve uzamsal verileri ölçmek için Resim ve Özellikler'i tıklatın ve açılan pencerede STM'yi uzay ve zaman için tam olarak kalibre etmek için uygun değerleri girin.
Bireysel kalsiyum olaylarını analiz etmek için Düz Çizgi'yi tıklatın ve x eksenine paralel bir kalsiyum olayının merkezinden düz yatay bir çizgi çizmek için STM'yi tıklatın ve sürükleyin. Ardından Analiz et ve Profili Oluştur'u tıklatın. Kalsiyum olayının çizim profilini gösteren bir kutu görüntülenir.
ICC-MY kalsiyum sinyal verilerinin parçacık tabanlı analizi için, film dosyasını Volumetry'de açın ve STK Filtresi, Farklılaştırma'yı seçmek için sağ tıklayın. Ayırt etmek için bir değer giriş yapmak için tekrar sağ tıklatın. Farklılaşmayı başlatmak için Enter tuşuna basın ve sol tıklatın.
Parçacıklar oluşturmak için, filmde gezinmek için orta fare düğmesini kullanarak, bir ikilik periyot içeren 20-40 karelik bir bölüm seçin, ardından bir kalsiyum geçici küme ve kümeden hemen sonra takip eden 20 ila 40 kare oluşumunu izleyin. Tüm kareler stk OPS Rampa DS parçacık bilgilerine erişmek için film penceresinde sağ tıklandığında ve eşiği en üst ten minimum yoğunluğa kademeli olarak rampalayan bir parçacık analizi yordamını çalıştırmak için tıklatın. Başarılı bir parçacık analizi sağlamak için, mümkün olduğunca çok ön-kalsiyum geçici küme non-aktivite ve çok post-kalsiyum geçici küme non-aktivite dahil emin olun.
Bu sinyal-gürültü oranını artırmak için yardımcı olacaktır. Analiz, gürültü nün çizimi olarak çizim penceresinde grafik olarak ve parçacık sayısını temsil eden yeşil iz, ortalama parçacık boyutunu temsil eden kırmızı iz ve mutlak yoğunluk eşiğini temsil eden mavi iz ile üç renk izi olarak izleme penceresinde görüntülenir. Histogram için parçacık gürültü nün çizimini klavyedeki H tuşuna basın.
Ardından, arka plan beyaz olana ve üstteki renk izleri olana kadar renk şemaları arasında geçiş yapmak için sağ ayraç tuşuna basın. Bir ölçüm aracı getirmek için klavyedeki F tuşuna bir kez basın. Ardından, renkli çizimlerin sağ tarafa kaymaya başladığı kavşaktaki çizim deki izleme penceresinin kaydırma çubuğundaki tek bir dikey çizgiyi işaretlemek için ikinci kez F tuşuna basın.
İzler penceresi içinde işaretli beyaz dikey çizgi kırmızı izleme nin dönüm noktasından kaydırmak için orta fare düğmesini kullanın. Görüntülenen Y ortalamasını kaydettikten sonra, mavi izlemeyi seçmek için izleme penceresinin içindeki orta fare düğmesini yeniden tıklatın. Film penceresinde renk çarkını getirmek için C'yi ve eşiği ayarlamak için D'yi tıklatın.
Geçerli parçacıklar şimdi kırmızı renkte gösterilecektir ve doygunluk yapanlar beyaz olacaktır. Beyaz alanlar kaldırılana kadar kaydırmak için sol fare düğmesini kullanın ve renk çarkındaki sarı sayısal değeri y ortalama değerine ayarlamak için orta fare düğmesini kullanarak her şeyi belirlenen eşik noktasında aktif kalsiyum geçici parçacık olarak kırmızı olarak atayın. Verileri koordinat tabanlı parçacık dosyası olarak kaydetmek için STK 3D'ye erişmek için sağ tıklatın, parçacık sıfırı kaydedin ve dosyayı kaydetmek için sol tıklatın.
Parçacık etkinliği ısı haritaları oluşturmak için kaydedilen parçacık dosyasını açın ve parçacık STKops, StatMap Bayrak erişmek ve analiz etmek için bayrak atamaları girmek için film penceresinde sağ tıklayın. Analiz ve kayıt boyunca yüzde oluşumu nu temsil eden farklı renklerle kayıt tüm uzunluğu için toplam parçacıkları gösteren bir ısı haritası uygulamak için tıklatın. Isı haritasını TIFF dosyası olarak kaydetmek için sağ tıklatın.
Ardından parçacık ölçüsüne erişmek için film penceresinde sağ tıklatın, parçacık istatistikleri STK eşittir ve çözümleme için bir bayrak ataması girin. İzleme penceresinde bir dizi izleme oluşturulur. STM analizi, kalsiyum sinyalinin uzamsal yayılma ve yayılma hızı gibi uzamsal özelliklerini izleme ve kaydetme olanağı sağlar.
Bu bilgiler, kendi ortamlarında hücreler deki kalsiyum sinyaldavranışlarının tam bir görünümünü sağlamak için toplanabilir. Parçacık analizi kullanılarak, kalsiyum sinyali ile ilgili nicel bilgiler parçacık alanı ve parçacık sayısı ölçülerek hesaplanabilir ve bu bilgiler, belirli bir görüş alanı içinde kalsiyum sinyali aktivasyonunun uzamsal aralıklarını belirlemek için birlikte kullanılabilir. Parçacık analizi aynı zamanda yerin incelenmesi ve kalsiyum ateşleme bölgelerinin ateşleme olasılıkları ile hücre altı kalsiyum sinyallerinin derinlemesine ölçülmesine olanak sağlar.
Parçacıkları zamansal özelliklerine göre farklı bayraklara ayırarak, başlatan parçacıklar doğru bir şekilde eşlenebilir. Ve inisiyasyon sitelerinin sayısı, piksel ve mikrometre olarak sitenin boyutu, her bir kalsiyum geçici küme sırasında bir veya birden çok kez ateş her başlatma sitesi olasılığı ve her kalsiyum geçici küme döngüsü sırasında ateş ateş siteleri yüzdesi elde edilebilir sabit veri zenginliği elde edilebilir. Tutarlılık bu protokolde başarının anahtarıdır.
Güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tüm veri kümeleri ve tüm filmler aynı şekilde ele alınmalıdır. Bu özellikle parçacık dosyaları ile ilgili doğrudur. Protokollerimiz kalsiyum sinyalinin yerinde derin bir karakterizasyonuna olanak sağlar ve uygun kullanıldığında bir dizi istatistiksel yöntem, çeşitli mekansal ve zamansal parametreler arasındaki farklılıkları değerlendirebilir.
Protokolümüzdeki bu analiz teknikleri, araştırmacıların bağırsak pacemaking ve bağırsak innervasyonu ile ilgili daha önce ele alınamayan soruların yanı sıra alt üriner sistemin nöronal kontrolünü sormalarına ve yanıtlamalarına olanak sağlamıştır.
