Protokol olmadan, canlı hücre görüntülemesi nden yararlanılarak miyoblast farklılaşması ve miyofiber oluşumunun dinamik sürecini, özellikle nükleer konumlandırmayı araştırmak mümkündür. Yabancı hücre çekirdekleri ile miyoblast Canlı hücre görüntüleme canlı hücrelerde miyoblast farklılaşması ve çekirdeklerin otomatik izleme çalışma sağlar. Görsel gösteri, birincil hücre izolasyonu ile canlı görüntüleme ve görüntüleme analizinin nasıl birleştirilebildiğini anlamada yardımcı olur.
Frederica Colombo ile prosedürü gösteren, Giorga Careccia, bizim laboratuvarda bir doktora öğrencisi olacaktır. Tibialis soleus, ekstansör digitorum longus, gastroknemius, kuadriseps ve yetişkin bir farenin her iki arka ekstremitesinden triceps kasları buz üzerinde PBS bir Petri kabına hasat ile başlayın. Her kastendinin tendonu ve yağını dikkatlice çıkarmak ve kasları boş bir Petri kabına aktarmak için steril makas ve cımbız kullanın.
Tek tip bir kitle elde edilene kadar kasları kesip kıyasve karmayı steril kavisli makas kullanarak ve 50 mililitrelik bir tüp kas parçaları aktarın. Sonra dakikada 250 rotasyonlar bir 37 derece santigrat su banyosu nda 30 dakikalık bir kuluçka için kas parçaları sindirim orta 10 mililitre ekleyin. Enzimatik sindirim sonunda, bloke orta 10 mililitre ile reaksiyonu durdurun.
Ve örneği santrifüjle aşağı çevirin. Tüpü buza yerleştirin ve süpernatant'ı 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Yine süpernatant santrifüj.
Ve bir milimetrelik DMEM'de peleti yeniden askıya alın. %10 fetal büyükbaş serumu ya da FBS ile buz üzerinde tamamla. Sadece gösterildiği gibi taze sindirim ortamı 10 mililitre ayrılmış pelet sindirin ve rezerv hücre süspansiyon ile sindirilmiş pelet birleştirmek, buz üzerinde.
Çekilen hücreleri 70 mikrometrelik bir filtreden geçirin ve ardından 40 mikrometrelik bir filtre uygulayın. Ve hücreleri 15 milimetre taze DMEM'de yıkayın, yüzde 10 FBS ile tamamlayın. Santrifüj sonunda, oda sıcaklığında kırmızı kan hücre lisis tampon üç mililitre pelet yeniden askıya.
40 mililitre PBS ve ek bir santrifüj ile beş dakika sonra lysis durdurma. DMEM 20 mililitre pelet yeniden askıya 10 yüzde FBS ile desteklenir ve ön plaka hücreleri kaplamasız Petri çanak. 37 derece santigrat ve yüzde beş karbondioksit bir saat sonra supernatant içeren uydu hücresi toplamak.
Ve ön plaka hücre süspansiyonu gösterildiği gibi iki kez daha. Son kaplama sonra, santrifüj ile uydu hücreleri toplamak ve taze çoğalma orta 40 mililitre pelet yeniden askıya. H2BGFP ekspresyonu indüklemek için iki kollajen kaplı 150 mililitre Petri yemekleri arasında hücreleri bölünmüş yemek başına doksisiklin başına bir mikrogram ile.
Ve hücreleri iki ya da üç gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Miyoblastlar uygun deneysel yoğunluğa ulaştığında, her tabaktaki hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın ve hücreleri tabak diplerinden, tabak başına iki mililitre Trypsin ile 5 dakika boyunca 37 derece santigrat derecede ayırın. Işık mikroskobu ile kopmayı onaylayın ve plaka başına beş mililitre DMEM artı %10 FBS ile reaksiyonu durdurun.
Canlı hücre görüntüleme için, plaka iki saat boyunca iyi başına bodrum membran matris ile desteklenen, farklılaşma orta 350 mikrolitre ile kaplanmış bir 12 iyi plaka her kuyu içine beşinci hücrelere iki kez on. Hücreler plakanın altına yapıştığında, plakayı konfokal mikroskop aşamasına 37 derece ve yüzde beş karbondioksit kuvöze yerleştirin ve 16 saat boyunca her altı dakikada bir 1024 ile 16 bit görüntü elde etmek için yüzlerce hücreyle görüş alanlarını elde etmek için 20 kat kuru bir hedef kullanın. Edinilen her konum için, çok kareli nokta tif dosyası oluşturun ve seçili bir klasörde sağlanan nokta zip yazılımını karşıdan yükleyin ve ayıklayın.
Segmentasyon izleme klasörü örneğini açın ve Matlab'daki komut penceresini açmak için segmentasyon nokta M'yi tıklatın. Değişken dosya adı parçasıtif dosyasının adı ve yol giriş parçası nokta tif'in bulunduğu klasör olacak şekilde son bölümlendirme nokta M komut dosyalarını değiştirin. Komut dosyasını çalıştırmak için çalıştır'ı tıklatın.
Segmentasyon sonucu bir dosya nokta paspas olarak kaydedilir, çekirdeklerin segmentasyonu çıkış şeklinde görselleştirilmiş olabilir. Parçaları oluşturmak için, ilk çift tıklatma aynı çalışma klasöründe nokta M parçalarını oluşturur. Ardından, dosya adını, parçalı çekirdekler için uygun nokta Mat dosyasını işaret etmek için değiştirin.
Komut dosyasını çalıştırmak için Çalıştır'ı tıklatın. İzleme nin sonucu başka bir nokta paspas dosyası olarak kaydedilir ve oluşturulan parçalar çizilir. Parçaların kalitesini değerlendirmek için.
Önce onay izleme nokta M'yi çift tıklatın ve dosya adını uygun nokta tif adı ile değiştirin. Ardından parçaların nokta mat dosyasını kullanmak için dosya adı parçasını tıklatın ve çalıştır'ı tıklatın. Şekil penceresinde çekirdeği seçmek için alt kaydırma çubuğunu kullanın.
Seçili çekirdek kırmızı daire içine alınacak ve seçilen hücrenin yörüngesi üst kaydırma çubuğu kullanılarak zamanında izlenebilir. Yeşil haçlar tespit edilen çekirdekleri gösteriyor. Hoechst ile kültürlü miyoblastlarda proliferasyon ve farklılaşma güçlü bir şekilde bozulur.
Miyoblastın H2BGFP farelerinden izole edilmesiyle karşılaştırıldığında ve doksisiklin veya yabani tipile kültürlenmiş miyozin ağır zincir miyoblastlar olarak etiketlenmiştir. H2BGFP proteinini ifade eden primer miyoblastlar ile canlı hücre görüntülemesi farklılaşma sırasında çekirdeklerin izlenmesine olanak sağlar. Farklılaşma döneminin ilk ve son zaman noktalarında GFP kanallarında iletimin birleştirilmiş görüntüleri, miyotüplerin ve dolayısıyla miyotüplere entegre olan veya miyotube'lara kaynaşmayan çekirdeklerin tanımlanmasına olanak sağlar.
Konfokal floresan mikroskopisi ile görüntüleme den sonra, çekirdekler gösterildiği gibi bölünebilir ve havza dönüşümü yakındaki nesneleri ayırmak için kullanılabilir. Bu yaklaşımla, çekirdeklerin çoğu görüntüde tanımlanır ve çekirdek hareketinin gösterildiği gibi izlenmesine izin verilir. Örneğin, yörüngelerin toplam uzunluğu Hoechst ile boyanmış hücreler için biraz daha yüksek görünür.
Aradaki fark önemli olmasa da. Ancak, bir zaman atlamalı sırasında toplam deplasman hesaplama Hoechst ile lekeli hücrelerin toplam yerinden lekesiz hücrelerin önemli ölçüde daha küçük olduğunu ortaya koymaktadır. Tahmin edildiği gibi lekelenmemiş hücreler için toplam yıllık varyasyon Hoechst ile lekeli hücrelere göre önemli ölçüde daha küçüktür.
Biyolojik adımlardaki teknik becerilerin konfokal mikroskop ve kullanılan yazılımlarla birleştirilmesinde protokolün özellikle gösterildiği gibi takip etmek önemlidir. İlgi başka bir kas modelinde miyoblast farklılaşması ve nükleer konumlandırmayı incelemek için izole miyoblastı floresan nükleer protein ile aktarmak mümkündür. Bu teknik, kas farklılaşması sırasında hücresel ve nükleer dinamikleri keşfetmenin ve bu süreçlerdeki kusurların daha da araştırılmasının yolunu açmıştır.
Kas distrofileri gibi çeşitli patolojik koşullar altında.
