Senza protocollo, è possibile indagare il processo dinamico di differenziazione dei mioblasti e di formazione della miofibra, in particolare il posizionamento nucleare sfruttando l'imaging a cellule vive. L'imaging a cellule vive di mioblasto con nuclei cellulari estranei consente lo studio della differenziazione dei mioblasti nelle cellule viventi e il tracciamento automatico dei nuclei. La dimostrazione visiva aiuta a capire come combinare l'isolamento delle cellule primarie con l'imaging dal vivo e l'analisi dell'imaging.
A dimostrare la procedura con Frederica Colombo, sarà Giorga Careccia, dottoranda nel nostro laboratorio. Inizia raccogliendo i muscoli tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadricipite e tricipiti da entrambi gli arti posteriori di un topo adulto in una piastra di Petri di PBS sul ghiaccio. Utilizzare forbici sterili e pinzette per rimuovere con cura i tendini e il grasso da ogni muscolo e trasferire i muscoli in una piastra di Petri vuota.
Utilizzando forbici curve sterili tagliare e tritare i muscoli fino a ottenere una massa uniforme e trasferire i pezzi muscolari in un tubo da 50 millilitri. Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo di digestione ai pezzi muscolari per un'incubazione di 30 minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius a 250 rotazioni al minuto. Alla fine della digestione enzimatica, interrompere la reazione con 10 millilitri di mezzo di blocco.
E spin giù il campione per centrifugazione. Posizionare il tubo sul ghiaccio e trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 50 millilitri. Centrifuga di nuovo il supernatante.
E sospendere di nuovo il pellet in un millimetro di DMEM. Completalo con il dieci per cento di siero bovino fetale, o FBS, sul ghiaccio. Digerire il pellet riservato in 10 millilitri di mezzo di digestione fresco come appena dimostrato e combinare il pellet digerito con la sospensione della cella di riserva, sul ghiaccio.
Filtrare le cellule estratte attraverso un filtro da 70 micrometri, seguito da un filtro da 40 micrometri. E lavare le cellule in 15 millimetri di DMEM fresco, integrato con fbs al 10%. Al termine della centrifugazione, sospendere di nuovo il pellet in tre millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi a temperatura ambiente.
Fermare la llisi dopo cinque minuti con 40 millilitri di PBS e un'ulteriore centrifugazione. Sospendere nuovamente il pellet in 20 millilitri di DMEM integrati con FBS al 10% e pre-placcare le celle in una piastra di Petri non patinato. Dopo un'ora a 37 gradi celsius e il 5% di anidride carbonica raccolgono la cellula satellitare contenente supernatante.
E pre-piastra la sospensione cellulare altre due volte come dimostrato. Dopo l'ultima placcatura, raccogliere le cellule satellitari per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in 40 millilitri di mezzo di proliferazione fresco. La divisione delle cellule tra due piastre petri rivestite di collagene da 150 millilitri con un microgrammo per millilitro di doxiciclina per piatto per indurre l'espressione di H2BGFP.
E riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per due o tre giorni. Quando i mioblasti hanno raggiunto l'appropriata densità sperimentale, lavare le cellule in ogni piatto con cinque millilitri di PBS e staccare le cellule dai fondi della piastra con due millilitri di triptina per piatto a 37 gradi celsius per cinque minuti. Confermare il distacco tramite microscopia ottica e interrompere la reazione con cinque millilitri di DMEM più il dieci per cento fbs per piastra.
Per l'imaging di cellule vive, la piastra due volte dieci alla quinta cella in ogni pozzo di una piastra di 12 pozzaggi rivestita con 350 microlitri di mezzo di differenziazione, integrata con matrice di membrana basale per pozzo per due ore. Quando le cellule hanno aderito alla parte inferiore della piastra, posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi celsius e cinque per cento su uno stadio di microscopio confocale e utilizzare un obiettivo 20 volte asciutto per ottenere campi visivo con centinaia di celle per acquisire immagini a 16 bit con 1024 per 1024 pixel per fotogramma ogni sei minuti per 16 ore. Per ogni posizione acquisita, generare un file tif a punti multi frame e scaricare ed estrarre il software dot zip fornito in una cartella selezionata.
Aprite l'esempio della cartella di rilevamento della segmentazione e fate clic su do segmentation dot M per aprire la finestra di comando in Matlab. Modificare gli script dot M di segmentazione dovuti in modo che la traccia del nome file variabile sia il nome del file tif e la traccia di input del percorso sia la cartella in cui è contenuto il punto tif. Fare clic su Esegui per eseguire lo script.
Il risultato della segmentazione verrà salvato come un tappetino punto file, mentre la segmentazione dei nuclei può essere visualizzato nella figura di output. Per generare le tracce, fare doppio clic su genera tracce punto M nella stessa cartella di lavoro. Quindi, modificate il nome del file in nome file, puntate il file Mat punto appropriato per i nuclei segmentati.
Fare clic su Esegui per eseguire lo script. Il risultato del tracciamento verrà salvato come un altro file di tappetino punto e le tracce generate verranno tracciate. Per valutare la qualità delle tracce.
Fare innanzitutto doppio clic sul punto di rilevamento dei controlli M e modificare il nome del file con il nome tif del punto appropriato. Quindi fare clic su traccia nome file per utilizzare il file del tappetino punto delle tracce e fare clic su Esegui. Nella finestra della figura utilizzare la barra di scorrimento inferiore per selezionare il nucleo.
Il nucleo selezionato verrà cerchiato in rosso e la traiettoria della cella selezionata può essere seguita nel tempo utilizzando la barra di scorrimento superiore. Le croci verdi indicano i nuclei rilevati. La proliferazione e la differenziazione sono fortemente compromesse nei mioblasti coltivati con Hoechst.
Rispetto al mioblasto isolato dai topi H2BGFP e coltivato con doxiciclina o tipo selvatico, miosina pesante catena etichettata mioblasti. L'imaging di cellule vive con mioblasti primari che esprimono la proteina H2BGFP consente il tracciamento dei nuclei durante la differenziazione. Le immagini unite di trasmissione nei canali GFP nei punti iniziali e finali del periodo di differenziazione, consentono l'identificazione di miotubi e di conseguenza nuclei che finiscono per integrarsi in miotubi o che non si fondono in miotubi.
Dopo l'imaging mediante microscopia a fluorescenza confocale, i nuclei possono essere segmentati come dimostrato e la trasformata spartiacque può essere utilizzata per separare gli oggetti vicini. Con questo approccio, la maggior parte dei nuclei sono identificati nell'immagine, permettendo al movimento dei nuclei di essere tracciato come dimostrato. Ad esempio, sembra che la lunghezza totale delle traiettorie sia leggermente più alta per le celle macchiate con Hoechst.
Anche se la differenza non è significativa. Tuttavia, il calcolo dello spostamento totale durante un time lapse rivela che lo spostamento totale delle celle macchiate di Hoechst è significativamente inferiore a quello delle cellule non macchiate. Come previsto, la variazione annuale totale per le cellule non macchiate è significativamente più piccola rispetto alle cellule macchiate di Hoechst.
È importante seguire il protocollo esattamente come dimostrato in particolare quando si combinano le competenze tecniche dei passaggi biologici con il microscopio confocale e il software utilizzato. Per studiare la differenziazione del mioblasto e il posizionamento nucleare in un altro modello muscolare di interesse è possibile trasferire mioblasti isolati con proteine nucleari fluorescenti. Questa tecnica ha spianato la strada all'esplorazione della dinamica cellulare e nucleare durante la differenziazione muscolare e all'ulteriore indagine dei difetti in questi processi.
In varie condizioni patologiche come distrofie muscolari.
