Temas Kabarcık Bilayer yöntemi geleneksel Lipid Bilayers için alternatif bir tekniktir. ve bu yöntem membran üzerinden daha çok yönlü titreşim sağlar. CBB yöntemi Düzlemsel Lipid Bilayer ve yama kelepçe yönteminin faydalarını entegre eder.
Bir lipid çift katmanlı teknik olarak rasgele lipid bileşimi ile bir CBB oluşturulabilir. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip tek kanallı akım kayıtları için bir CBB geliştirdik. Bu yöntem membran titreşim çeşitleri sağlar ve kanal membran arayüzü için geniş bir tip platform sunuyor.
Herkes sabun köpüğü üfleme yi yatmıştır. Benzer manevralar ağızdan üfleme yerine uygulanan basıncı manuel olarak ince ayarlayarak CBB oluşumu için alınır. Pratik ve CBB keyfini çıkarın.
Bu işlem olmak için yuvarlak bir alt şişede istenilen konsantrasyonda kloroform fosfolipidler dağıtmak. Fosfolipid çözeltisini bir azot gazı silindirine bağlı bir döner evaporatörüzerine yerleştirin. İnce bir fosfolipid film görünene kadar oda sıcaklığında azot akışı altında şişedöndürün.
Sonraki yerde bir vakum pompası bağlı bir kurutucu içine açık şişe. Vakum pompası kullanarak iyice kloroform kaldırmak için birkaç saat için kurutucu iç aspire. Daha sonra şişeye uygun miktarda elektrolit çözeltisi ekleyin ve mililitre fosfolipid süspansiyon başına iki miligrmas elde etmek için fosfolipid askıya alın.
Çok katmanlı vezikül süspansiyon elde etmek için bir banyo sonicator kullanarak 20 ila 30 saniye için süspansiyon sonciate. Iyon kanal proteinleri içeren proteolipozomların hazırlanması için, çok katmanlı vezikül süspansiyon bir protein çözeltisi ekleyin. Ve banyo sonicator kullanarak birkaç saniye sonicate.
Büyük delikli cam pipetler hazırlamak için, bir pipet çekmecebir cam kılcal yerleştirin ve iki adım çekerek ince konik ucu ile mikro pipet imal. Daha sonra mikro pipeti mikro bir forge üzerine ayarlayın ve mikropipetin ucunu 30 ila 50 mikrometre çapında konik kısımdaki platin iplikle tulaşın. Filamenti kısa bir süre ısıtın ve hemen kapatın.
Distile su ve etanol kullanarak sığ bir kuyu ile cam slayt yüzeyini temizleyin. Daha sonra cam kaydırak üzerine silikonlaştırıcı reaktif uygulayın ve reaktif tamamen havada kurumasını bekleyin. Sonra ters bir mikroskop sahnesine cam slayt yerleştirin.
Silikonlu cam slayt sığ kuyuiçine heksadecane 100 mikrolitre ekleyin. Bir tüberkülin şırınga kullanarak mikropipetin yarısına kadar elektrolit çözeltisi doldurun. Daha sonra mikropipeti basınç portlu mikropipet tutucuya ayarlayın ve gümüş/gümüş klorür telelektrotun pipet elektrolit çözeltisine batırMasını sağlar.
Mikropipet tutuculardan birini yama kelepçesi amplifikatörünün baş aşamasına, diğerini de elektrik zeminine bağlayın. Daha sonra mikropipet tutucunun basınç portuna bir mikroenjektör bağlayın. Mikropipeti, mikromanipülörü kullanarak ters bir mikroskop un sahnesinin üzerinde uygun bir konuma ayarlayın.
Elektrot ofset potansiyelini ayarlamak için, bir elektrolit kubbe oluşturmak için cam slayt sığ kuyu etrafında düz yüzeyüzerinde mikropipet doldurmak için kullanılan aynı elektrolit çözeltisinin bir mikrolitre yerleştirin. Her iki mikropipetin ucunu elektrolit kubbesinde ıslatın. Daha sonra yama kelepçesi amplifikatörünün elektrot ofset potansiyelini ayarlayın.
Ucundan lipozom çözeltisi çizmek için, slayt cam sığ kuyu etrafında düz yüzeye lipozom çözeltisi bir mikrolitre ekleyin. Sonraki yer lipozom kubbe içeren mikropipet ucu. Mikroenjektör kullanarak lipozom içeren çözeltiyi aspire edin.
Kanal yeniden lipozomlar yeniden spirating için diğer mircopipette için prosedürü tekrarlayın. Şimdi sığ kuyuda heksadecane içinde mikropipet yerleştirin. Kabarcık istenilen boyuta ulaşana kadar basıncı artırarak yavaş yavaş bir su kabarcığı darbe ve bundan sonra aynı basıncı korumak.
Kabarcığın boyutunu sabit tutmak zorsa, yağ-hava arabiriminden ucu geçirerek kabarcığı atın. İki kararlı kabarcık lar oluşana kadar yordamları tekrarlayın. Iki kabarcıklar arasında bir temas kurun.
Boyutu yavaş yavaş sabit kabarcık içi basınç bile değişebilir, çünkü kabarcık boyutunu korumak için basınç ince ayar. Yama talep amplifikatörü kullanarak membran potansiyelini uygun değere ayarlayın ve kanal akımının ortaya çıkmasını bekleyin. Kararlı lipid çift katmanlı oluşumu için lekeleri temizlemek için gereklidir.
Cam kılcal damar veya pipet hazırlama iyice yıkanmalı ve deterjan molekülleri tarafından kontaminasyon önlenmelidir. CBB kanal moleküllerini oluşturduktan sonra ya sulu çözeltide ya da lipozomda birkaç ila düzinelerce dakika içinde çift katmanlı içine kendiliğinden yerleştirildi. Kanalların eklemeleri, uygulanan membran potansiyeli altında mevcut genliğin adım adım artması yla doğrulandı.
CBB yöntemi ile oluşturulan bir çift katmanlı iki tek katmanlı parçalanabilir. PTB kanal akımı iki tek katmanlı taktıktan hemen sonra ortaya çıktı. Ve temas genliği arttıkça akım daha büyük oldu akım CBB'nin detach eklemek manipülasyonu ile senkronize edildi.
Kabarcıkların sayısı patlarsa sulu çözeltideki lipid konsantrasyonu azalır ve monolayer oluşmaz. Sonra lipozom bölümünde baskıyı hafifletmeye çalışın. CBB oluşumu ve kanal reconstitution kurulduktan sonra profüzyon veya hidrofilik veya hidrofobik maddeler enjekte yoluyla sulu çözelti ve membran bileşimlerini değiştirmek için deneyebilirsiniz.
CBB yöntemi kanal membran interplays keşfetmek için çok yönlü yollar açmıştır.
