接触気泡二重層法は、従来の脂質二重層の代替技術である。そしてこの方法は膜を通してより多目的な振動を可能にする。CBB法は平面脂質二重層およびパッチクランプ方法の利点を統合する。
脂質二重層技術として、任意の脂質組成を有するCBBを形成することができる。高い信号対ノイズ比を持つ単一チャンネル電流記録用のCBBを開発しました。この方法は、膜振動の品種を可能にし、チャネル膜インターフェースに広大なタイプのプラットフォームを提供しています。
誰もがシャボン玉を吹く経験があります。同様の操作は、口で吹くのではなく、適用される圧力を手動で微調整することによってCBB形成のために取られる。練習し、CBBをお楽しみください。
この手順であることに、丸底フラスコで所望の濃度でクロロホルム中のリン脂質を分散させる。窒素ガスボンベに接続された回転エバポレーターにリン脂質溶液を置きます。薄いリン脂質フィルムが現れるまで、室温で窒素流でフラスコを回転させます。
次に、開いたフラスコを真空ポンプに接続されたデシケータに入れなさい。真空ポンプを使用して、デシケータの内部を数時間吸引し、クロロホルムを完全に除去する。続いて、適量の電解質溶液をフラスコに加え、リン脂質を懸濁して、1ミリリットルのリン脂質懸濁液当たり2ミリグラムを得る。
バスソニテーターを使用して20〜30秒間懸濁液をゾンシエートし、多層ベシクル懸濁液を得る。イオンチャネルタンパク質を含むプロテオリポソームの調製のために、多層ベシクル懸濁液にタンパク質溶液を加える。そして、バス超音波処理器を使用して数秒間超音波処理します。
大きなボアガラスピペットを準備するには、ピペットプーラーにガラスキャピラリーを入れ、2ステップの引っ張りで細かい先細りの先端でマイクロピペットを製造します。次にマイクロフォージにマイクロピペットをセットし、直径30~50マイクロメートルのテーパー部分の白金フィラメントにマイクロピペットの先端を接触させます。フィラメントを短時間加熱し、すぐに消します。
蒸留水とエタノールを使用して、浅い井戸でガラススライドの表面をきれいにします。次に、シリコン化試薬をガラススライドに塗布し、試薬を空気中で完全に乾燥させます。次に、ガラススライドを反転した顕微鏡のステージに置きます。
シリコン化ガラススライドの浅い井戸に100マイクロリットルの六方デカンを加えます。ツベルクリンシリンジを用いて、マイクロピペットの長さの半分まで電解液を充填する。次に、マイクロピペットを圧力ポート付きのマイクロピペットホルダーにセットし、銀/塩化銀のワイヤ電極をピペット電解質溶液に浸します。
マイクロピペットホルダの1つをパッチクランプアンプのヘッドステージに接続し、もう1つを電気的な地面に接続します。その後、マイクロインジェクターをマイクロピペットホルダーの圧力ポートに接続します。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを反転顕微鏡のステージより上の適切な位置に調整します。
電極オフセット電位を調整するには、ガラススライドの浅いウェルの周りの平らな表面にマイクロピペットを充填するために使用される同じ電解質溶液の1マイクロリットルを置き、電解質ドームを作成します。両方のマイクロピペットの先端を電解質ドームに浸します。その後、パッチクランプアンプの電極オフセット電位を調整します。
先端からリポソーム溶液を引き出すために、スライドガラスの浅いウェルの周りの平らな表面に1マイクロリットルのリポソーム溶液を加える。次に、ドームを含むリポソームにマイクロピペットの先端を置きます。マイクロインジェクターを用いてリポソーム含有溶液を吸引する。
チャネル再構成リポソームの他のミコピーペットについても手順を繰り返します。今、浅い井戸の六角にマイクロピペットのを置きます。気泡が所望の大きさになるまで圧力を上げることで、ゆっくりと水泡を吹き、その後同じ圧力を維持します。
気泡の大きさを安定に保つのが難しい場合は、オイル空気界面を通してチップを通過して、泡を捨てます。2つの安定した気泡が形成されるまで手順を繰り返します。2 つの気泡の間に接触を確立します。
気泡の大きさを維持するために圧力を微調整し、一定の気泡内圧力でもサイズが徐々に変化する可能性があるため。パッチクレームアンプを使用して膜電位を適切な値に設定し、チャネル電流が出てくるのを待ちます。安定した脂質二重層形成のためには、ブロッターを洗浄することが不可欠である。
ガラスキャピラリーやピペットの調製は、十分に洗浄し、洗浄剤分子による汚染を避けるべきです。CBBが水溶液またはリポソームのいずれかでチャネル分子を形成すると、数〜数十分のスパン内で二重層に自発的に挿入された。チャネルの挿入は、適用された膜電位の下での現在の振幅のステップの賢明な増加によって確認された。
CBB法によって形成された二重層は、2つの単層に崩壊させることができる。pTBチャネル電流は、2つの単層を取り付けた直後に現れました。そして、接触が増加するにつれて電流が大きくなり、CBBのデタッチアタッチ操作と同期した電流の振幅が増加した。
気泡の吹き出量が多くなると水溶液中の脂質濃度が低下し、単層が形成されない。その後、リポソームセクションの圧力を緩和してみてください。CBBの形成とチャネルの再構成が確立されると、水溶液および膜の組成を、拡散または親水性または疎水性物質を注入することによって変化させることができます。
CBB法はチャネル膜インタープレイを探索する多目的な方法を開いた。
