Bu yöntem, doğrusal oligonükleotid, DAS kaynak malzemelerden DNA nanoteknoloji genişletir, biraz daha dairesel DAS içine. Bu teknik ana avantajları basit, sağlam ve en laboratuvarları için uygun olmasıdır. Dairesel DNA arınması için, karıştırma ile 140 mikrolitre son hacmine, taze hazırlanmış, bozulmamış dairesel DNA çözeltisine 20 mikrolitre formamid ekleyin.
Yedi ila dokuz denaturing PAGE jel kuyularının her birine 16 ila 20 mikrolitre dairesel DNA Çözeltisi yükleyin. İki mikrolitre yükleme boyasını ilgili öncül doğrusal DNA'nın sekiz mikrolitresiyle karıştırın ve karışımı ayrı bir referans kuyusu içine enjekte edin. Sonra xylene cyanol FF jel aşağı yaklaşık üçte iki gözlenebilir zaman çalıştırmak durdurma, santimetre başına 10 volt yaklaşık iki saat boyunca jel çalıştırın.
Lastik eldiven ve gözlük giyen, floresan ince katmanlı kromatografi plaka üzerine jel transfer, ve uv ışınlama gölgesinde olarak hedef jel bantları kesmek için bir jilet kullanın. Kurutma için iki mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine jel bantları yerleştirin, sonra bir hamur içine kurutulmuş jeller püre, ve jel iki katı hacimde de-iyonize su ekleyin, oda sıcaklığında gece sallayarak için. Ertesi sabah, karışımı iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne süzün, ilk tüpün kenarlarını küçük bir iyotlu su hacmiyle durulayın ve artık DNA'yı geri almak için tekrar filtreuygulayın.
Sonra dairesel DNA'yı etanol çökeltisi ile arındırın ve DNA'yı eksi 20 derecede saklayın. Bir pot tavlama için, 10 kat Tris asetat EDTA magnezyum tampon iki mikrolitre karıştırın, eşit molar oranlarda doğrusal ve dairesel iplikçikler bir dizi her 10 mikromolar DNA stok çözeltisi bir mikrolitre, ve ek Tris EDTA tampon 200 mikrolitre lik son hacmine. Sonra 48 saat içinde, 95 ila 25 santigrat derece bir termal şişe de montaj çözeltisi anneal.
Sonsuz kafeslerin iki aşamalı tavlama için, 10 kat Tris asetat EDTA magnezyum tampon iki mikrolitre karıştırın, eşit molar oranlarda doğrusal ve dairesel iplikçikler bir dizi her 10 mikromolar DNA stok çözeltisi bir mikrolitre, ve ek Tris EDTA tampon 200 mikrolitre PCR test tüpü, 20mikrolitre son hacmine. İlk alt karo annealing adımında, bir PCR termocycler'da her öncül alt karo çözeltisi, 95 ila 25 santigrat derece arasında, iki buçuk saatten fazla hızlı bir doğrusal soğutma yöntemi kullanarak anneal. Montaj çözeltisini hazırlamak için, dört sonsuz kafesin her biri için, karşılık gelen iki alt döşeme çözeltisinin her birinin 10 mikrolitresini, her iplikçik için 0,25 mikromolar nihai konsantrasyona karıştırın.
İkinci kafes tavlama adımında, yavaş soğutma yöntemi kullanarak 20 mikrolitrekarışımı bir PCR termocycler'da karıştırın. İki sonlu dikdörtgen kafesin iki adım annealing için, 10 kat Trisat EDTA magnezyum tampon bir mikrolitre karıştırın, eşit molar oranlarda doğrusal ve dairesel iplikçikler bir dizi her 10 mikromolar DNA stok çözüm 0.5 mikrolitre, ve ek Tris EDTA tampon 200 mikrolitre PCR test tüpü, 10 mikrolitre son hacmine. İlk annealing adımda, 95 ila 25 santigrat derece, iki buçuk saat içinde, hızlı doğrusal soğutma yöntemi ni kullanarak, PCR termocycler her öncül alt karo çözüm, ve annealed 32 alt karo çözümleri karıştırın, her 2 mikrolitre ile, birlikte 200 mikrolitre PCR test tüpü, 64litre son hacmi.
Daha sonra, ikinci annealing adımda, anneal 64 mikrolitre karışımı termocycler, yavaş soğutma yöntemi kullanarak, gösterildiği gibi. Sonlu kafeslerin elektroforez arınması için, yerli bir 2% agarose jel hazırlamak ve her kuyuya sonlu kafes çözeltisi 20 mikrolitre yük, birlikte 100 ila 3000 baz çifti DNA merdiveni 5 mikrolitre ilave, ayrı bir kuyuda. Bir buz suyu banyosunda 5 volt santimetre de jel iki saat çalıştırdıktan sonra, UV ışığı altında 1000 baz çifti marker düzeyinde hedef jel bantları kesti, gösterildiği gibi, ve ince parçalar halinde jel bantları dilim.
Ezilmiş jelleri bir filtre sütununa yerleştirin ve kafesleri çıkarmak için sütunu santrifüj edin. Sonra, atomik kuvvet mikroskobu görüntüleme için çözüm toplamak. Polyethalen glikol veya PEG tarafından sonlu kafes saflaştırması için, sonlu kafes çözeltisinin 50 mikrolitresini %15 PEG 8000 tampon eşit hacimle karıştırın, çözeltiyi santrifüj edin ve ek bir santrifüj için 100 mikrolitre PEG tamponunda peleti yeniden askıya alın.
İkinci santrifüjden sonra, tris asetat EDTA magnezyum tampon pelet askıya, atomik kuvvet mikroskobu görüntüleme için. Sonsuz 2D kafes atomik kuvvet mikroskop görüntüleme için, mika taze bir tabaka kapalı cleave, ve temiz yüzeye annelik örnek iki mikrolitre mevduat. DNA kafesleri mika yüzeyine emmek için iki dakika bekleyin, iki kez yüzeyi yıkamadan önce, yıkama başına de-iyonize su 100 mikrolitre ile, ikinci yıkama dan sonra basınçlı hava ile yüzey kurutma.
Havadaki sonsuz DNA kafeslerinin atomik kuvvet mikroskop görüntülerini elde etmek için, görüntüleme yazılımındaki dokunma modunu açın ve tetkik boyutunu 0,5 ila beş mikrometreye, tarayın çözünürlüğünü 512 satıra ve tetkik hızını 1 ile 3,5 Hertz arasında ayarlayın. Daha sonra mika yüzeyini üçgen atomik kuvvet mikroskop probları ile tazbim. Sonlu DNA kafesleri görüntüleme için, mika taze bir tabaka kapalı cleave, gösterildiği gibi, ve bir kat Tris asetat EDTA magnezyum tampon 80 mikrolitre temiz mika yüzeyine yatırmak.
Daha sonra, tampon içine sonlu örneklerin beş mikrolitre ekleyin ve DNA kafesleri mika yüzeyine emmek için iki dakika izin, tris asetat EDTA magnezyum tampon başka eklemeden önce. Daha sonra, tarama boyutunu 0,5 ila bir mikrometreye, tarama çözünürlüğünü 256 satıra ve tarama hızını 1,5 Hertz'e ayarlayın ve yüzeyi üçgen problarla taramayı n için izleyin. Dairesel DNA, denaturing PAGE'deki öncül doğrusal DNA'dan biraz daha yavaş hareket eder, çünkü dairesel DNA'nın içindeki gözenek jel lifleri tarafından nüfuz edilir ve geridir.
Dairesel 64 nükleotit montaj ailelerinin her bir montaj için tek bir net ve temiz bandı vardır ve bu da monomer motiflerinin stabilitesini doğrular. Dairesel 84 nükleotit montaj karolar, ancak, kendi ana bantları etrafında smear var, küçük yan ürünlerin varlığını gösteren. Yanlış ortakların ürünleri tarafından minör ne olursa olsun, yüksek verim ile mükemmel kafesler hedef monomer motifleri monte edilebilir.
Her montaj, nanowires, nanotüpler, nanospiraller, nanoribbons ve nanorectangles gibi mikrometre ölçeğinde kendi morfolojik özelliklere sahiptir. Bu yordamı çalışırken, özellikle, adımlar sırasında veya dışında enkaz kirlenmesini önlemek için hatırlamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik DNA nanoteknolojisi alanında yapılan araştırmaların önünü açmış ve daha dairesel DNA nanoteknolojisinin yeni aile üyelerini keşfedilmiştir.
