Bu yöntem, farklı mekanik yükleme rejimlerinin, çevre koşullarının veya kıkırdak dejenerasyonaşamalarının in situ artiküler kondrositlerin güvenlik açığı üzerindeki etkilerinin araştırılmasını sağlar. Fiziksel güçler. Diğer tekniklerden farklı olarak, bu ölçümler yerel sınır koşullarından ödün vermeden gerçek zamanlı ve tamamen bozulmamış kıkırdak içinde gerçekleştirilir.
Bu tekniğin bir diğer avantajı da, belirli genlerin mekanik yaralanmalarda in situ kondrositlerin duyarlılığını nasıl etkilediğinin test edilmesine olanak tanıyan bir fare modeli kullanmasıdır. Distal femur diseksiyonu için, supine pozisyonda fare yerleştirin ve diz ön kısmında beş milimetrelik deri kesi yapmak. Kesiyi dizinin etrafına kadar uzatın.
Ve diz eklemi ve bacak kasları ortaya çıkarmak için deri geri çekin. Femur proksimal ucundan başlayarak, distal yönde kemik boyunca kesmek için bir sayı on bir neşter bıçak kullanın. Kuadriseps kas tendon ünitesi ve femoral şaft ön tarafı arasında bıçak konumlandırma.
Kesiyi patellanın ötesine uzat. Kuadriseps kas tendon ünitesi kaldırmak için patellar tendon ortasındakesme. Daha sonra, femur proksimal ucundan başlayarak, hamstring kas tendon ünitesi ve femoral şaft arka tarafı arasında neşter bıçak pozisyon ve distal yönde kemik boyunca kesti.
Kesi diz eklemine yaklaştığında, yumuşak dokuyu kesin ve diz eklemini geçerek kesmeyi tamamlayın. Femur ortaya çıkarmak için kuadriseps ve hamstring kasları geri çekin. Ve kemiğin lateral ve medial taraflarındaki fazla kasları kes.
Proksimal tibianın arka tarafındaki baldır kasını kesin. Ve uyluk arka tarafı görselleştirmek için bacak çevirin. Femur distal kondilve proksimal tibia posterior yüzeyi ortaya çıkarmak için diz eklemi etrafında aşırı doku çıkarın.
Femoral kondiles uzak anterior ve posterior çapraz bağları kesin. Ve tibia'yı uyluk kemiğinden uzaklaştırın, alt bacağı femurdan ayırmak için tüm bağları kes. Standart diseksiyon makası kullanarak, lateral taraftan tibiofemoral eklem yaklaşık sekiz milimetre yukarıda kemiğin proksimal ucunda femur ile kesti.
Ve uyluk çevresindeki yumuşak dokuları kaldırmak için kuyumcu's forceps kullanın. Sonra femur distal ucunda her iki kondyles üzerinde kıkırdak ortaya çıkarmak. Eklem yüzeyini HBSS ile periyodik olarak nemlendirin.
Humerus diseksiyon için, supine pozisyonda fare yerleştirin. Ve dirseğin arka tarafında beş milimetrelik bir kesi yapmak için mikro makas kullanın. Dirsek çevresindeki kesiği uzatmak ve kol ve omuzdaki kasları ortaya çıkarmak için deriyi geri çekmek.
Humerusproksimal ucundan başlayarak, triceps kas tendon ünitesi ve humerus posterior tarafı arasında bir sayı on bir neşter bıçak konumlandırın. Ve kemik boyunca distal yönde kesilmiş. Üçlü tendonun içinden humerusun distal ucuna doğru kesiyi uzatın ve trisepsihumun proksimal ucuna doğru çekin.
Eklem yüzeyine dokunmadan humeral başının etrafındaki bağ dokusunu kesin. Ve uzvunu vücuttan çıkar. HBSS ile humeral başın eklem yüzeyini nemlendirin.
Humerusun koldan bağlantısını kesmek için, ulnanın ön ucunu kırmak için forceps kullanın. Ve humerusun distal ucundaki bağ dokusunu kesip kemikteki fazla dokuyu çıkartın. Sonra humerus arka tarafında deltoid tuberosity kaldırmak için standart diseksiyon makas kullanın.
Ve parçalanmış numuneyi HBSS içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Örneklerin Calcein boyama için, HBSS 10.05 mikromolar Calcein 500 mikrolitre içeren 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine kemikleri aktarın. Ve tüpü ışıktan korunan, 800 rpm'de 37 derecede bir termo miksere yerleştirin.
Otuz dakika sonra numuneyi taze HBSS'de on dakika yıkayın. Ve numuneyi özel bir mikroskopa monte edilmiş mekanik test cihazının cam kaydıranına aktarın, örneğin posterior femoral konilerin veya humeral kafanın eklem yüzeyi camın üzerinde duruyor. Numuneyi HBSS ile nemlendirin ve numuneyle birlikte cihazı floresan mikroskop aşamasına yerleştirin.
4x büyütme altında yük uygulamasından önce Calcein ile boyanmış eklem kondrositlerini görüntüleyin. Görüntü kalitesini en iyi duruma getirmek için edinme ayarlarını ayarlayın. Statik mekanik yükleme uygulamak için, numunenin üzerine, eklem kıkırdağının yükü çıkarmadan önce kapak camına beş dakika sıkıştırılması için öngörülen statik yükü tutun.
Bir mekanik yük uygulamak için, bilinen ağırlığın silindirik bir darbecisini öngörülen yükseklikten numuneye bırakın ve yükü çarpışmadan beş saniye sonra bırakın. Her iki yük de çıkarıldıktan hemen sonra, numuneyi bir mililitre HBSS'de yeni hazırlanmış 60 mikro molar propridium iyodür içinde kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca, daha sonra floresan mikroskopi ile eklem kondrositleri yeniden görüntüleyin.
Uygulanan mekanik yükleme rejimi nedeniyle yaralı ve ölü hücrelerin alanını ölçmek için, öncelikle ImageJ'de mekanik yükün uygulanmasından önce ve sonra elde edilen eklem yüzeyinin mikrograflarını açın. Görüntüleri bir yığın halinde birleştirin. Görüntülerin ölçeğini görüntü çözünürlüğüne göre ayarlayın.
Ardından, hücrelerin Calcein negatif ve PI pozitif olduğu alanı tanımlayın. Bu hücrelerin yaralı ya da ölü olarak kabul edilir. Daha sonra ölçüm aracını kullanarak yaralı ölü hücrelerin alanını belirleyin.
En az altı test femoral ve humeral kıkırdak sekiz ila on haftalık kapak C fareler elde hücre yaralanması tekrarlanabilir lokalize alanlarda yükleme protokolleri uygulandı. Test edilen tüm yükleme protokollerinde, daha yüksek yük büyüklükleri ve daha yüksek darbe yoğunlukları hem uyluk hem de humeri deki hücre hasarının alansal derecesini önemli ölçüde arttırdı. Diseksiyonları yaparken eklem kıkırdağına cerrahi aletlerle temas etmemeyi unutmamak önemlidir, çünkü bu örneklerin yeteneği ile taban çizgisini tehlikeye atabilir.
Hastalık kolayca genetik, diyet veya cerrahi manipülasyonlar yoluyla farelerde indüklenen gibi bu aynalama modelinin kullanımı osteoartrit araştırma kolaylaştırabilir. Platformumuz aynı zamanda temel bilim sorularını sorgulamak ve kondrositlerin mekanik hassasiyetini hedef alan terapötik müdahaleleri taramalariçin bir araç da sağlamaktadır.
