Cette méthode peut aider à produire de grandes quantités d’ARN recombinants d’intérêt pour l’application dans la recherche ou l’industrie. Le principal avantage est que l’ARN recombinant est produit à Escherichia coli dans un processus bon marché qui peut être facilement mis à l’échelle. Fait important, l’ARN est produit sur un échafaudage circulaire d’ARN, qui facilite la purification à l’homogénéité.
Contrairement à l’ADN ou aux protéines, les ARN d’intérêt ne sont pas facilement produits en grandes quantités dans les systèmes biofactoriels, une telle culture d’Escherichia coli. Notre méthode est basée sur la co-expression de l’ARN d’intérêt inséré dans un échafaudage circulaire hautement stable et l’application d’une ligase qui médie la circularisation de l’ARN. L’échafaudage circulaire d’ARN dérive d’un viroïde breveté.
Les viroïdes sont des ARN circulaires relativement petits, non ensilants et hautement appariés à base qui sont infectieux pour certaines plantes plus élevées. Nous pouvons produire des dizaines de milligrammes de l’ARN recombinant par litre de culture bactérienne dans des conditions de laboratoire régulières. Pour commencer cette procédure, amplifiez l’ADNC par PCR tel qu’il est décrit dans le protocole de texte.
Ensuite, ajoutez 100 nanogrammes du pLELVd-BZB plasmide à un tube de 0,5 millilitre. Ajouter 10 U de l’enzyme de restriction IIS de type BpiI et suffisamment de tampon G pour créer une réaction de 20 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour digérer le plasmide.
Après cela, séparez le PCR et les produits de digestion par électrophoresis dans un gel d’agarose d’un pour cent dans le tampon de TAE. Tacher le gel en le secouant en bromure d’éthidium de 200 millilitres à une concentration de 0,5 microgramme par millilitre. À l’aide d’un transilluminateur UV, visualisez l’ADN.
Utilisez un scalpel pour découper les bandes correspondant à l’ADNC amplifié et au plasmide digéré BpiI. À l’aide de colonnes de gel de silice, élitez les ADN des fragments de gel. Quantifier la concentration de l’ADN par analyse spectrophotométrique.
Configurer une réaction Gibson Assembly à l’aide de l’ADND amplifié et du plasmide digéré. Incuber à 50 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, utilisez une colonne de gel de silice pour purifier la réaction.
Après avoir électroporé les cellules E.coli DH5-Alpha compétentes, choisissez plusieurs colonies blanches et transférez-les au milieu liquide LB. Cultivez les colonies pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un kit miniprep pour purifier les plasmides, et d’analyser leurs tailles par électrophoresis dans un gel agarose d’un pour cent dans tae tampon.
Tout d’abord, co-électroporer la souche E.coli sélectionnée avec à la fois le dérivé pLELVd-BZB qui contient l’ADNC correspondant à l’ARN d’intérêt et le plasmide P15LTRNISM pour co-exprimer la ligase d’ARN tRNA aubergine. Transférer le milieu liquide SOC dans la cuvette d’électroporation pour récupérer les cellules, et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, plaquez les bactéries sur le milieu solide LB contenant 50 microgrammes par ampicilline millilitre, et 34 microgrammes par chloramphénicol millilitre.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez 250 millilitres de liquide tb medium, contenant 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline, et 34 microgrammes par chloramphénicol millilitre, à un flacon Erlenmeyer déconcerté d’un litre. Récupérez l’E.Coli incubé, puis cueillez une colonie et inoculez le milieu dans le flacon.
Incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses vigoureuses à 180 RPM pendant 12 à 16 heures avant de récolter la bactérie. Versez la culture E.Coli récoltée dans une bouteille de centrifugeuse de 250 millilitres et faites tourner les cellules à 14 000 G pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 30 millilitres d’eau.
Transférez cette suspension dans un tube de centrifugeuse et faites tourner à nouveau les cellules en utilisant les conditions précédentes. Jetez le supernatant et ajoutez 10 millilitres de tampon de chromatographie à la pastille cellulaire. Vortex pour résuspendre les cellules dans le tampon.
Ajouter un volume de phénol: chloroforme et vortex vigoureusement pour briser les cellules. Puis, centrifugeuse à 12 000 G pendant 10 minutes. Récupérer la phase aqueuse, ajouter un volume de chloroforme, et vortex vigoureusement.
Centrifugeuse à 12 000 G pendant 10 minutes. Après cela, filtrer la préparation de l’ARN à l’aide d’un filtre à seringues de 45 micromètres. Purifier l’ARN à l’aide d’une colonne d’amine d’éthanol d’un millilithe reliée à un système de chromatographie liquide.
Ajustez le débit à un millilitre par minute et équilibrez la colonne avec 10 millilitres de tampon chromatographie. Ensuite, chargez l’échantillon et lavez la colonne avec 10 millilitres de tampon de chromatographie. Elute l’ARN avec 20 millilitres de tampon d’élitution, et de recueillir un milliliter aliquots.
À l’aide d’électrophoresis en gel polyacrylamide bidimensionnel, séparez les ARN circulaires de leurs homologues linéaires. Tout d’abord, préparer un gel de polyacrylamide de cinq pour cent dans le tampon TBE et contenant huit urée molaire comme décrit dans le protocole de texte. Mélanger 20 microlitres des préparations arn avec un volume de tampon de chargement.
Incuber à 95 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant 1,5 minutes, puis se rafraîchir sur la glace. Chargez les échantillons dans le gel polyacrylamide et exécutez l’électrophorèse aux conditions appropriées pour la dimension gel. Après cela, tacher le gel en 0,5 microgramme par bromure d’éthidium millilitre pendant 15 minutes.
Laver le gel taché avec de l’eau, puis visualiser l’ARN sous la lumière UV. L’analyse électrophoretic de plusieurs plasmides recombinants dans lesquels différents CDNAs sont insérés montrent différentes migrations par rapport à pLELVd-BZB. Notez que pLELVd-BZB contient le marqueur lacZ, qui est remplacé par l’ADNC correspondant à l’ARN d’intérêt, de sorte que si la migration dépend de la taille de l’ADNC inséré, les plasmides recombinants migrent généralement plus rapidement que le plasmide de contrôle.
La production de l’ARN recombinant dans les cultures bactériennes co-électroporées est surveillée en cassant les cellules et en analysant l’ARN en dénaturant PAGE. Des bandes fortes peuvent être vues qui correspondent à des ELVd vides et à des formes chimériques d’ELVd, dans lesquelles différents ARN d’intérêt ont été insérés. Fait intéressant, une fraction importante de l’ARN recombinant est considérée comme une forme circulaire.
La circularité de la fraction principale est observée en utilisant une combinaison de deux PAGE dans des conditions de dénaturation à haute et basse résistance ionique. La préparation de l’ARN peut être encore purifiée par la chromatographie d’échange d’anion. Comme on le voit ici, l’ARN E.Coli est efficacement conservé à faible résistance ionique, et par la suite élucidé à haute résistance ionique, avec la plupart de l’ARN étant recueilli en fractions deux et trois.
L’ARN recombinant peut être encore purifié à l’homogénéité par électrophorèse 2D. Ce protocole permet la production facile de grandes quantités d’ARN recombinant dans Escherichia coli et la purification à l’homogénéité grâce à la circularité du produit final. Rappelez-vous que l’ARN d’intérêt résulte intégré dans un échafaudage circulaire d’ARN dérivé d’un viroïde végétale.
Si vous souhaitez séparer les deux moieties, vous devez utiliser une stratégie standard, comme ribozymes, DNAzymes, ou RNase H.Le rendement de ce protocole dépend de l’ARN particulier d’intérêt, car les petits ARN sont susceptibles d’être produits en quantités plus élevées que les plus grandes. Pour les expressions à plus grande échelle, prenez en considération que le temps optimal pour récolter les bactéries dépend de nombreux facteurs, y compris la souche E.Coli, le milieu de culture et les conditions de croissance. Nous vous recommandons un test de cours préliminaire pour trouver la fenêtre de production optimale dans vos conditions particulières.
Rappelez-vous que les ARN recombinants s’accumulent dans les cellules bactériennes de façon transitoire, et qu’ils disparaissent complètement à la phase de croissance tardive.
