Disregulated redoks sinyalizasyonu çeşitli hastalıkların patogenezinde yer almaktadır. Redoks biyolojisi çalışması, farklı hücresel ve doku bölmelerinde reaktif oksijen türlerinin doğru bir şekilde saptanmasıdır. EPR spektroskopisi serbest radikalleri kesin olarak ölçen tek yöntemdir.
Bu protokol, EPR spektroskopisi için biyolojik numunelerin işlenmesi ve saklanması için pratik bir yöntem göstermektedir. Bu protokoller, iki temsili modelde EPR ve spin problarının kullanımını göstermektedir. Her ne kadar diğer biyolojik ortamlarda aktif türleri değerlendirmek için adapte edilebilir.
Deneyin tasarımı ve numunenin işlenmesi, denemenin tekrarlanabilirliği açısından çok önemlidir. Hücre yoğunluğunu göz önünde bulundurmanızı ve uygun zaman uyumlu kontrolleri sağlamanızı öneririz. Yavaşça iyi başına Krebs-Henseleit Tampon veya KHB bir mililitre ile ham 264,7 hücreleri yıkama ile başlayın.
Ve 500 mikrolitre KHB ile hücreleri tedavi, iyi başına 100 mikromil DTPA ile desteklenmektedir. Süperoksit dismutaz ile pretreat için, süperoksit dismutaz stok, ya da araç 15 mikrolitre ekleyin, her kuyu, ve 10 dakika boyunca 37 derece santigrat plaka yerleştirin. Süperoksit dismutaz ön işlem sonunda, 10 milimolar CMH 12,5 mikrolitre ve uygun kuyulara 125 mikromolar PMA çalışma çözümü 40 mikrolitre ekleyin ve 50 dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka.
Hemen buz üzerine plakaları yerleştirin ve buz üzerinde ayrı 1,5 mililitre tüpler içine her kuyudan tampon toplamak. Daha sonra, her iyi taze KHB artı DTPA 100 mikrolitre ekleyin ve yavaşça her kuyunun altından hücreleri kazıyın. Daha sonra pipetleme ile hücre süspansiyonları resuspend ve buz üzerinde bireysel 1,5 mililitre tüpler içine hücreleri aktarın.
Oda sıcaklığında süperoksit tespiti için, ilk olarak bir tampon veya hücre örneğinin 50 mikrolitresini kılcal bir tüpe yükleyin ve tüpü kapatın. Tüpü hemen elektron paramanyetik rezonansına veya EPR spektrometresine yerleştirin ve oda sıcaklığı ölçümleri için EPR kazanım parametrelerini ayarlayın. Her zaman bir kontrol olarak aynı deneysel koşullar altında tedavi prob aynı konsantrasyoniçeren tampon boş bir örnek test edin.
77 derece Kelvin'de süperoksit tespiti için, bir numunenin 150 mikrolitresini bir ucunda kauçuk durdurucu ile bir ila iki inçlik düz politetrafloroetilen veya PTFE parçasına yükleyin. Tüpün diğer ucunu ikinci bir stoperle kapatın ve numuneyi sıvı nitrojenle dondurun. Daha sonra hızlı bir şekilde stoperleri çıkarın ve ptfe tüpünü sıvı nitrojen depolaması için etiketli bir kriyotube yerleştirin.
EPR ölçümleri için, EPR spektrometresinin parmak dewar'ını sıvı nitrojenle doldurun ve numuneyi içeren PTFE boruyu sıvı nitrojene yerleştirin. Parmak dewar'ı EPR spektrometresine yerleştirin ve Ölçümler için EPR kazanım parametrelerini 77 derece Kelvin olarak ayarlayın. Dondurulmuş akciğer dokusunda ROS algılama için, kuru buz üzerinde doku yerleştirin ve kuru buz üzerinde flaş dondurulmuş doku stabilize etmek için cımbız kullanın.
Beş 15 miligram parçalar halinde örnek kesin ve bir katranlı 1.5 mililitretüp parçaları tartmak. Numuneye 196 mikrolitre KHB artı DTPA ve dört mikrolitre CMH ekleyin ve kısa bir santrifüj ile doku parçalarını peletleme den önce 37 derece santigrat su banyosunda bir saat boyunca akciğer örneğini kuluçkaya yatırın. Daha sonra sadece gösterildiği gibi EPR ölçüm hazırlanmasında flaş dondurma için PTFE boru bir parça içine supernatant 150 mikrolitre aktarmadan önce buz üzerinde örnek yerleştirin.
Gösterildiği gibi PMA ile uyarılmış ham 264,7 hücrelerde toplam süperoksit üretiminin değerlendirilmesi, hem hücre süspansiyonu hem de PMA ile tedavi edilen hücrelerin tampon azot konsantrasyonunun, geçirilebilir doğası ve spin probunun hızlı dengesi nedeniyle benzer olduğunu ortaya koymaktadır. Nitroksit radikalleri sinyal ham artar 264.7 PMA ile uyarılmış hücreler, kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, ama hücre geçirimsiz süperoksit dismutaz ile önceden tedavi hücrelerde. PMA ile uyarıldıktan sonra ham 264.7 hücrelerde düşük sıcaklıklarda elde edilen nitroksit konsantrasyonu da oda sıcaklığı verileri ile tutarlı süperoksit dismutaz varlığında zayıflatılır.
Nitroksit konsantrasyonu kan ve bleo fareler ve tedavi farelerin bronkoalveolar lavaj sıvısı artar, yanı sıra bleo fareler ve yaralı hayvanlardan hasat akciğer dokusu parçalarının supernatants içinde, PBS tedavi kontrolleri ile karşılaştırıldığında. Ayrıca, retro-orbital spin prob enjeksiyonundan sonra, bleo fareler ve tedavi edilen hayvanlar kontrollere göre daha yüksek bir spin sonda sinyali gösterirler. Bu pratik protokoller, araştırmacıların düşük sıcaklık ölçümleri de dahil olmak üzere farklı hücresel bölmelerde ve biyolojik numunelerde serbest radikal üretimini EPR ile test edebilmelerine olanak sağlayacaktır.
