Bu yöntem sitoprotektif yollar, oksidatif stres ve yara iyileşme yanıtı arasındaki ilişkiler hakkında doku onarımı ve rejenerasyon alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu güçlü tekniğin en büyük avantajı, doku yenilenmesi üzerindeki etkilerini belirlemek için bir yaradaki reaktif oksijen türlerini gerçek zamanlı olarak ölçebilmektir. Prosedürü benimle birlikte göstermek Jennifer Kwong, laboratuvarımda araştırma görevlisi olacak.
Her anestezi sekiz ila 12 haftalık diyabetik fare kan şekeri ölçmek için bir glucometer kullanın. Ve ilk hayvan dan dorsal saç kaldırmak için bir saç düzeltici ve tüy dökücü krem kullanın. Maruz kalan cildi temizlemek için iki kez alkol mendil kullanın ve sadece cerrahi alan maruz böylece hayvan drape.
Alkol kuruduğunda, panniculus karnosus boyunca uzanan iki, 10 milimetrelik tam kalınlıkta yaralar oluşturmak için steril 10 milimetre biyopsi yumrukları kullanın iyi kurulmuş bir eksizyonel yara iyileşme tekniğine göre. Yaraları açmak ve 4/0 ipek dikişlerle sabitlemek için 10 milimetrelik dairesel kesiklere sahip 0,5 milimetre kalınlığında silikon levha kullanın. Daha sonra fareleri tam iyileşmeye kadar izleyerek bir ısı yastığına yerleştirin, kendi kafesine dönmeden önce, iki hafta boyunca ek yuvalama malzemesi olarak kağıt havlu lar temin edin.
Ertesi gün, ya kontrol saçma küçük müdahale RNA jel veya deneysel küçük müdahale Keap1 jel her hayvanın yaranın üstüne ve şeffaf film pansuman ile her gövde sarın yerde jel tutmak için uzuvları serbest bırakarak uygulayın. Deneyin üçüncü gününde, taze hazırlanmış L-012 çözeltisi ile 27 kalibrelik bir iğne ile donatılmış bir milimetrelik şırınga yükleyin ve çözümü ışıktan korumak için şırıngayı sarın. Yaraları görüntülemek için, yaraları rahatsız etmeden farelerin her birinden şeffaf film pansumanı nazikçe çıkarın ve fareleri biyolüminesans görüntüleme sisteminin görüntüleme odasına yerleştirin.
Görüntüleme sistemi girişini ve indüksiyon odası oksijen seviyelerini dakikada bir litreye ayarlayın ve fareleri biyolüminesans ve parlak alan ile temel olarak görüntüleyin. Daha sonra, alkol mendilleri ile karınları silin sonra alkol kuruduktan sonra her fare içine 200 gram vücut ağırlığı, IP başına Beş miligram L-012 çözeltisi enjekte edin. Sırt derisindeki yaraları bozmadan L-012 çözeltisinin enjekte edilmesi çok önemlidir, çünkü herhangi bir bozulma yara iyileşme yörüngesini ve veri yorumlanmasını etkileyecektir.
Enjeksiyondan önce hayvanın güvenli bir şekilde dorsal recumbency olduğundan emin olun. Enjeksiyondan hemen sonra, fareleri görüntüleme odasında kendi konumlarına yerleştirin ve 60 dakikalık bir görüntüleme süresi boyunca her dört dakikada bir hayvanları görüntüleyerek 10 milimetrelik yarayı reaktif oksijen türlerinin seviyesini belirlemek için ilgi alanı olarak tanımlayın. Sonra kendi kafeslerine hayvanları geri dönmeden önce tam iyileşme kadar izleme ile bir ısı yastığı üzerinde fareler yerleştirin.
Belirlenen eksizyonel yara modeline göre bilateral yaralar oluşturulduktan üç gün sonra L-012 enjeksiyonundan önce biyolüminesans gözlenmez. İntraperintoneal L-012 solüsyonu sonrasında yaranın reaktif oksijen türlerinin saptandığı bölgelerde biyolüminesans gözlenir. 60 dakika boyunca her 4-5 dakikada bir biyolüminesans kaydı, yaklaşık 50 dakikada gözlenen tam L-012 doygunluğuna ulaşmak için en uygun görüntüleme süresi ile, zaman içinde ilgi bölgenin biyolüminesans doygunluk gösterir.
L-012 enjeksiyonundan önce ve sonra ilgi çeken her yara bölgesinde biyolüminesans, tedavi edilen küçük küçük müdahaleci RNA veya Keap1 küçük müdahaleci RNA tedavi edilen farelere enjekte edilerek, toplam ışık yoğunluğu sayısının alana bölünmesi ile hesaplanabilir. H&E boyama ile reaktif oksijen türlerinin seviye ölçümünün doğruluğunu doğrulamak için 10. Yara dokusu bölümlerinde protein makrofaj belirteci olan F4/80'in immüno-reaktivitesinin analizi, küçük müdahale cihetli Keap1 tedavi edilen yaralarda makrofaj sayısının azaldığına işaret ederek, bu yöntemin geçerliliğinin altını çizer.
Bu yordamı denerken, L-012'nin süresinin dolmadığını doğruladığınızdan emin olun ve çözümü ışıktan korunan bir yerde karıştırın. Bu prosedürü takiben, reaktif oksijen türlerinin ve bunların korelasyonlarının alt hücresel lokalizasyonunu incelemek için hedefli problar ve immünosit tabanlı yöntemler kullanılabilir ve yaraların redux istatistiklerini etkileyen müdahalelerin ve mekanizmaların hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
