Yazarlar aşağıdaki finansman kaynağı kabul: Magic bu konularda Fonu kardiyovasküler araştırma için.

1. Cardiomyocytes hazırlanması
<ol><li>Kat 6-şey pilakalar ve membran matris ve kültür insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSCs) daha önce17açıklandığı gibi.</li>
	<li>HiPSCs hiPSC-CMs içine önceden açıklanan yöntemleri18kullanarak ayırt etmek.</li>
	<li>16-18 d sonrası farklılaşma cardiomyocytes her şey 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 2 mL ile durulama tarafından kalsiyum ve magnezyum, kuluçka 1 mL/tripsin veya hücre ayrılma reaktif (bakınız tablo, bir de tarafından takip olmadan askıya alma Malzemeler) Oda sıcaklığında 5 min için.</li>
	<li>Tripsin veya hücre ayrılma reaktif nötralize ( Tablo malzemelerigörmek) B-27 (RPMI/B-27 hücre medya) ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) hücre medya eşit bir birim için. Yukarı ve aşağı pipet yapıştırılır hücreler gevşetmek için.</li>
	<li>10 mL serolojik pipet ile askıya alınmış cardiomyocytes toplamak ve 50 mL konik tüp aktarabilirsiniz.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 250 x g bir hücre Pelet elde etmek için oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Pelet 10 mL RPMI/B-27 hücre medya resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon, 20 µL % 0,4 Trypan mavi çözüm eşit miktarda ile birleştirmek ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>El ile bir hemasitometre ve hücre süspansiyon konsantrasyon ve hücre canlılık elde etmek için kullanın.</li>
</ol>2. fibroblastlar hazırlanması
<ol><li>Bir insan kalp fibroblast (HCF) (yetişkin ventrikül türü) hücre kültürünü daha önce16açıklandığı gibi kültürünü başlatın.</li>
	<li>HCFs onları tripsin veya hücre ayrılma reaktif uygun miktarda kuluçka tarafından askıya alma ( Tablo malzemelerigörmek) Oda sıcaklığında165 min için. Bir T175 şişesi için tripsin veya hücre ayrılma reaktif 10 mL kullanılmıştır.</li>
	<li>Tripsin veya hücre ayrılma reaktif nötralize ( Tablo malzemelerigörmek) orta eşit bir birimi kullanımı, sonra örnek 50 mL konik tüp aktarmak ve hücre süspansiyon 250 x g almak için oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi bir Pelet.</li>
	<li>Pelet fibroblast büyüme orta 10 mL resuspend (bkz. Tablo malzeme).</li>
	<li>HCF hücre süspansiyon 20 µL % 0,4 trypan mavi çözüm eşit miktarda ile birleştirmek ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç veya el ile hemasitometre ve yeni hücre süspansiyon konsantrasyon ve hücre canlılık elde etmek için kullanın.</li>
</ol>3. endotel hücreleri hazırlanması
<ol><li>17daha önce açıklandığı gibi bir insan göbek damar endotel hücre (HUVEC) çizgi kültürünü başlatın. HUVECs onları tripsin veya hücre ayrılma reaktif uygun miktarda kuluçka tarafından askıya alma ( Tablo malzemelerigörmek) Oda sıcaklığında173 dk için. Tripsin veya hücre ayrılma reaktif nötralize ( Tablo malzemelerigörmek) orta eşit bir birim için o zaman 50 mL konik tüp transferi ve hücre süspansiyon 250 x g bir Pelet elde etmek için oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Not: 10 mL tripsin veya hücre ayrılma reaktif bir T175 şişesi için kullanıldı.</li>
	<li>Pelet endotel hücre büyüme orta 10 mL resuspend (bkz. Tablo malzeme).</li>
	<li>HUVEC süspansiyon 20 µL birleştirmek ve % 0,4 Trypan mavi çözüm eşit miktarda leke ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç veya el ile hemasitometre ve hücre süspansiyon konsantrasyon ve hücre canlılık elde etmek için kullanın.</li>
</ol>4. açılan pulcuklarının asılı oluşturma
<ol><li>Asılı koyun steril 6-şey kalıplara 850 micropores (her çapı 350 µm) içeren açılan aygıt.</li>
	<li>Yukarıda açıklandığı gibi hücreleri üç tür izole: hiPSC-CMs, HCFs ve HUVECs. Onları RPMI/B-27 hücre medya mL başına 2,475,000 hücre bir konsantrasyon ile oranında % 70 IPSC-CMs, %15 HCFs ve % 15 HUVECs 50 mL konik tüp içinde birleştirir.</li>
	<li>Her şey bir 6-şey tabak içinde oturmuş damla sistemi (350 µm micropore çaplı) asılı Ultra düşük ek için hücre süspansiyon (mL başına 2,475,000 hücre) 4 mL dağıtmak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon içine asılı dağıtım 12 h içinde kendiliğinden pulcuklarının oluşturacak damla aygıt. Kültür toplam 72 h (3 d) 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem pulcuklarının olgunlaşma için devam ediyor.</li>
	<li>Kültür 72 h sonra asılı dibinde gözenekler yoluyla pulcuklarının hasat bırak sistem aygıt ile orta bir çanak içine yerleştirip yavaşça pulcuklarının asılı üzerinden yayın için dönen damla aygıt.</li>
</ol>5. 3-b yama oluşturma roman Net kalıp kullanarak
<ol><li>Kaidenin alt kare plaka alt net ve 10 katmanlı yan ağları bir çift steril forseps yardımıyla roman kalıp oluşturmak için monte edilir. İlk olarak, yığını hizalamak Bankası, alt kare plaka ve köşe mesaj kullanarak net alt. O zaman, yığını ve ince paslanmaz çelik dişleri bir ağ oluşturmak için talimatları dönüşümlü olarak 10 yan ağlar katman.</li>
	<li>PBS veya orta yüzey gerilimi azaltmak ve daha sonra birleştirilmiş kalıp doldurma Bankası üzerine aktarmak için temel dolgu floş.</li>
	<li>Net kalıp boşluğu ile PBS ya da aynı yöntemi ortamda ıslak. Yavaş yavaş pulcuklarının istediğiniz boyuta presupposed boşluğuna doldurun (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm veya 6 x 6 x 1 mm). Not: %120 pulcuklarının beklenen hacmi böylece hücre toplamları sıkı bağlantısı ve statik kalmak boşluğuna besleniyor emin olun.</li>
	<li>Üst net ve üst kare plaka köşe mesaj üzerine montajı ve stoper ve holding tüpler pulcuklarının fiyasko önlemek için güvenli.</li>
	<li>Dolgulu net kalıp sistemi 6-şey plaka ile 6 mL RPMI/B-27 hücre medya veya tüm birleştirilmiş kalıp karşılamak için yeterli orta ile steril bir kaba aktarın.</li>
	<li>6-şey plaka dolgulu kalıp sistemi üzerinde sallanan bir shaker ile 3.000-4.000 x g7-10 gün için kuluçkaya. Not: Kuluçka süresi kardiyak yamalar boyutu tarafından belirlenir. Daha büyük yamalar ile kuluçka süresi kardiyak yama olgunlaşma için arttırılması gerekecektir.</li>
</ol>6. düzeltme roman Net kalıp üzerinden kaldırılması
<ol><li>Kalıp sistemini medyadan kaldırıp steril işleme mat steril bir 10 cm tabak yerleştirin.</li>
	<li>Holding Metro, stoper, üst kare plaka ve üst net kaldırın. Dikkatle steril forseps ile bir çift katmanlı yan ağlar tek tek kaydırın. Decannulation sonra sağlam bir kalp yama belgili tanımlık dip net elde edilir.</li>
	<li>Net tabandan steril forseps kullanarak yama ile almak ve net alt 5 mL RPMI/B27 medya ile bir 35 mm çanak içine aktarın. Yavaşça yama net alttan yavaş yavaş yemek veya steril hücre sıyırıcı ile net dönen gevşetin. Net alttan dekolmanı sonra kalp dokusu ile RPMI/B27 medya kültürlü.</li>
	<li>35-mm çanak içinde yüzen 3-b kardiyak yama kuluçkaya devam'i tıklatın. Fonksiyonel zaman uyumlu dayak 24 h gibi erken kalıp kaldırılması sonra görülebilir.</li>
	<li>Yama net kalıp çıkarmadan sonra şekli bütünlüğü ve zaman ile zaman uyumlu dayak artar şiddeti ile korunur gözlemlemek. Not: Bileşen cardiospheres elektrik entegrasyon decannulation sonra 3-b net kalıp tabanlı kardiyak yamaları sergiledi. Biz 60 80 dakikada 60 günden fazla kalıcı arasında değişen bir dayak frekans gözlenen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like,+High-Resolution,+3-Dimensionally+Printed+Scaffold.">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li><li>Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Microscale+Devices+to+3D+Printing:+Advances+in+Fabrication+of+3D+Cardiovascular+Tissues.">From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues.</a> Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).</li><li>Tandon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+systems+for+cardiac+tissue+engineering.">Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering.</a> Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).</li><li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Medicine/Cardiac+Cell+Therapy:+Pluripotent+Stem+Cells.">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li><li>Lux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+maturation+of+large-scale+cardiac+patches+based+on+a+perfusable+starter+matrix+by+cyclic+mechanical+stimulation.">In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation.</a> Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).</li><li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstitution+of+embryonic+cardiomyocytes+in+a+collagen+matrix:+a+new+heart+muscle+model+system.">Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system.</a> The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).</li><li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting.">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).</li><li>Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+cardiac+patch+seeded+with+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+promoted+the+regeneration+of+host+cardiomyocytes+in+a+rat+model.">Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163 (2016).</li><li>Caspi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+vascularized+cardiac+muscle+from+human+embryonic+stem+cells.">Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells.</a> Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).</li><li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-Free+Three-Dimensional+Bioprinting+of+Cardiac+Tissue+using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocytes.">Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4566 (2017).</li><li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).</li><li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease.">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+for+cardiac+cells.">3D culture for cardiac cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).</li><li>Langenbach, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+differentiation+of+microtissues+from+multipotent+precursor+cells+for+use+in+tissue+engineering.">Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering.</a> Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+adult+human+heart+fibroblasts+in+culture:+a+comparative+study+of+growth,+proliferation+and+collagen+production+in+human+and+rabbit+cardiac+fibroblasts+and+their+response+to+transforming+growth+factor-beta1.">Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1.</a> Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).</li><li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li><li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network.">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li><li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick,+vascularized+myocardial+tissues.">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li><li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering.">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li><li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting.">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids.">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li><li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration.">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li><li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes:+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents.">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yöntem önemi, tekrarlanabilirlik ve sonuç çok katmanlı kalp doku etkinliğini yatıyor. Kalp doku mühendisliği alanında, geçerli gol atan, çok katmanlı ve fonksiyonel 3-b kardiyak yamalar oluşturmak için bir yöntem belirlemektir. Biz cardiomyocytes, endotel hücreleri ve fibroblastlar içerebilen bir roman net kalıp içine oluşan pulcuklarının, doğrudan el ile tohum tarafından çok katmanlı kalp dokuları oluşturmak verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem raporu. Bu yöntemde kullanılan net kalıp çeşitli 6 x 6 x 1 mm için 2 x 2 x 1 mm arasında değişen dokular oluşturmak için farklı boyutları vardır. Biz anlatmıştık teknikleri de farklı kalıp şekilleri ve sistemleri bağlı olarak istenilen doku geometri için değiştirilebilir. Açıklanan hücre konsantrasyonları ve oranları daha önce hiPSC-CMs için optimize ve farklı hücre tipi değişiklikler ek değerlendirme gerektirir.
3-b kalp dokuları bioprinter teknolojisini kullanarak vitro oluşturulması tedavi ve teşhis modeller geliştirme umutla keşfedilmeyi. Ancak, geçerli bioprinting yöntemleri hantal ve önemli zaman ve iğneler veya İskele malzemeleri gibi yardımcı destek yapıların kullanımını gerektirir. Bu yardımcı varlığı destek yapıları azalır difüzyon besin ve oksijen18. Bu nedenle, merkezi nekroz kılcal oksijen ve besin19sağlamak için eksikliği nedeniyle geçerli 3-b kardiyak yapıları içinde büyük bir sorundur. Sakaguchi vd odaklı sandviç yöntemi uygulanan hücre çarşaf ve vasküler yatağın Biyoreaktörler endotel ağ20geliştirmek için kullanma. Burada sunulan net kalıp sisteminde kalıp boşluğuna yeterli difüzyon besin ve oksijen, herhangi bir destekleyici yapılar veya iskele zorunluluğu olmadan izin verebilirsiniz. Ayrıca, net kalıp tabanlı yöntemi etkilidir ve her iki pulcuklarının kalıp ve sonraki yama bakım tohum için özel beceri gerektirmez. Bu nedenle, hızlı ve ucuz bir şekilde zaman uyumlu olarak yenerek elde etmek için ve fonksiyonel kalp yamalar olduğunu.
Küresel çapı ve her pulcuklarının sayısını optimize etmek için açılan aygıt asılı, biz sorun giderme ve hücre tipleri ve miktarları ile ilgili değişiklikler gerçekleştirdi. Bu net kalıp tabanlı yöntem için küresel çapı ve kullanılan pulcuklarının sayısı yeterli büyüklükte bir fonksiyonel kalp doku oluşturmak için büyük önem... Kalp doku oluşturma için en iyi küresel boyutunu optimize etmek için farklı hücre konsantrasyonları denedik. Üç tip hücre tarafından asılı kardiyak pulcuklarının oluşturmak için kullanılan % 70 IPSC-CMs, %15 HCFs ve % 15 HUVECs dahil damla aygıt. Işık mikroskobu altında her micropore kendiliğinden oluşan pulcuklarının kolayca 72 h sonra döverler için tespit edildi. Biz pulcuklarının çapı asılı hücre konsantrasyon ile artış gözlenen damla aygıt. Farklı konsantrasyonları pulcuklarının, cihaz her 300 pulcuklarının için 100 pulcuklarının üzerinden 4 mL RPMI/B27 orta ile denedik. Çok sayıda denemeler ile sonuç pulcuklarının en uygun bir çapı vermiştir mL başına 2,475,000 hücre konsantrasyonu bulduk. Pulcuklarının en iyi duruma getirilmiş çapı ile zahmetsiz toplama ve net kalıp tabanlı yöntem çok katmanlı kalp doku oluşturma için önemli adımlar olan pulcuklarının yığılmış net kalıp, tohum deneyimli.
Protokolü'nün en önemli adım optimizasyonu küresel boyutta olduğunu. Bu yöntemde kullanılan pulcuklarının diğer bioprinting teknikleri21' kullanılan küresel organlarının boyutundan küçük kayda değer olduğunu. Daha büyük pulcuklarının beslenme ve oksijen22yetersiz difüzyon nedeniyle merkezi nekroz var tespit edilmiştir. Daha küçük çaplı pulcuklarının ile besin ve oksijen her küresel ortasına yeterli difüzyon daha kolay, hücresel canlılık sonuç yama her alanda artan gerçekleştirilir. Burada sunulan iletişim kuralında, küresel çapı 350 µm bırakmak için Gelişmiş hücre canlılığı ve daha fazla kişi yüzey alanı pulcuklarının arasında inandığımız bu net kalıp kullanarak kalp doku başarılı yaratılmasına katkıda bulunur. Bu nedenle, bu tarif yöntembilim kritik bir adımdır. Diğer hücre tipleri iletişim kuralına uyum için ek küresel boyut optimizasyonu deneyler gereklidir.
Bu yaklaşımın sınırlamaları yetersizlik tam pulcuklarının Yığınlama kontrolü için içerir. Bu elde edilen doku yamalar ile hànzú kalınlığının tekdüzelik alanlarında sonuçlanır. Ayrıca, pulcuklarının tohum için gerçek eller zaman derece düşük olsa da, büyük çok katmanlı yamalar oluşturulmasını pulcuklarının fusion için izin veren bir genişletilmiş kültür zaman gerektirir.
Gelecekteki uygulamalar gelince bu roman net kalıp tabanlı en az el ile çaba ile 3-b, iskele-free kalp doku oluşturma bir verimli ve tekrarlanabilir yöntemidir. Elde edilen çok katmanlı dokuları yuvarlak pulcuklarının tatmin edici yapısal bütünlüğü ve zaman uyumlu dayak davranış oluşur. Bu net kalıp tabanlı yöntem bir düşük maliyetli ve ölçeklenebilir için geçerli alternatif biyo-imalat yöntemleri mühendislik dokuların sunar ve hedefi ile kalp yetmezliği tedavisi için klinik olarak uygulanabilir kalp doku oluşturma potansiyeline sahiptir iskemik ya da işlevsel olmayan cardiomyocytes23yerine. Ayrıca, bu yöntem-ebilmek var olmak kullanmak-potansiyel yeni ilaç tedavileri24hastanın özel gösterimleri için kalp doku oluşturmak için.

Geçerli kalp doku mühendisliği amacı değiştirebilir veya yapısı ve fonksiyonu yaralı miyokard doku1tamir için bir terapi geliştirmektir. 3-b kalp doku modelleri yerli kalp dokusunun önemli contractile ve elektrofizyolojik özellikleri sergileyen oluşturmak için yöntem hızla2,3genişletilmesi. Çeşitli stratejileri keşfedilmeyi ve çalışmalar4,5' te kullanılan. Bu yöntemler belirli sentetik ve doğal biyoaktif hydrogels, jelatin, kolajen, fibrin ve peptidler6gibi kullanımı ile arasındadır biyo-mürekkep ifade teknolojileri2 ve bioprinting teknolojileri7.
Bu iskele ücretsiz yöntemleri yabancı iskele malzeme8birleşmeyle dezavantajları olmadan biomaterial tabanlı yöntemi olarak karşılaştırılabilir doku üretebilir gösterilmiştir. Oren Caspi vd. , hücre türleri ortaklığın son derece bozukluklarına insan mühendislik kalp dokusu9nesil sağlar gösterdi. Çene ve ark. pulcuklarının kardiyak yama oluşturulması için 3-b bir yazdırma yöntemi geliştirdi. Sonuçta ortaya çıkan yamalar cardiomyocytes, fibroblastlar ve 70:15:15 oranı10endotel hücreleri oluşur. Pulcuklarının etkili "yapı taşları" İskele ücretsiz kalp doku yaratılış olarak onlar hipoksi karşı dirençli olması ve yeterli mekanik bütünlük implantasyon11,12sahip gösterilmiştir. Önceki çalışmalarda küresel oluşturmak için çeşitli imalat yöntemleri göstermiştir, idam kullanımı da dahil olmak üzere bırakma yöntemi, spinner şişeler13, mikrosıvısal sistemleri14ve yapışık olmayan kültür yüzeyler kaplamasız veya ile kaplı özel mikro-kalıpları15. Bu protokol için kullandığımız asılı pulcuklarının yüzlerce aynı anda yoğuşmalı için micropores içeren açılan aygıt.
Bu çalışmada bir roman ve el ile bir kare kalıp boşluğuna pulcuklarının tohum ve olgunlaşma için doku üzerinde bir shaker kuluçka içerir kalp doku oluşturmak için verimli iskele ücretsiz yöntemi sunar. Her zamanki gibi statik kültür koşullar altında oksijen difüzyon dış yönleri merkezi nekroz kaynaklanan doku yapısı ile sınırlıdır. Ancak, net kalıp ile medya için besin ve oksijen difüzyon artan sağlayan bir sürekli sıvı hareket ile kalıp içine seribaşı pulcuklarının daldırılır. Ayrıca, bu kalıp tabanlı yöntem farklı boyutta doku yamalar en az el ile çaba ile eşzamanlı oluşturulması için izin verir ve sonuç doku kalıptan kolayca kaldırılabilir. Bu roman yöntemi iskele-free, çok katmanlı kardiyak yamalar verimli ve tekrarlanabilir oluşturulması için izin verir.

<table><tbody><tr><td>Human Cardiac fibroblasts (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 Consists of Basal Medium</td><td>Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF culture medium</td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>HUVEC culture medium</td></tr><tr><td>E8 media&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>HiPSC culture medium</td></tr><tr><td>Geltrex&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>Trypsin and Cell dissociation reagent</td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium</td></tr><tr><td>B-27 supplement (50x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Novel net mold&amp;nbsp;</td><td>TissueByNet Co.,Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>Hanging drop plate</td><td>Kuraray Co.,Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>6 well plates&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

a net mold-based method of scaffold-free three-dimensional cardiac tissue creation

Bu iletişim kuralı bir roman ve üç boyutlu (3-D) kalp dokuları ek iskele malzeme olmadan oluşturmak için kolay net kalıp tabanlı yöntemini açıklar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı cardiomyocytes (IPSC-CMs), insan kalp fibroblastlar (HCFs) ve insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) izole ve hücre süspansiyon ile %70 IPSC-CMs, %15 HCFs ve % 15 HUVECs oluşturmak için kullanılır. Onlar aynı anda yüzlerce pulcuklarının yoğuşmalı için micropores içeren bir ultra düşük eki "asılı damla" sisteminde ortak kültürlenir. Hücreleri toplamak ve kendiliğinden dayak pulcuklarının ortak kültür 3 gün sonra oluşturur. Pulcuklarının roman kalıp boşluğuna tohumlari, hasat ve bir shaker kuluçka kültürlü. Pulcuklarının olgun fonksiyonel mendil tohum sonra yaklaşık 7 gün haline. Sonuç çok katmanlı dokuları yuvarlak pulcuklarının tatmin edici yapısal bütünlüğü ve zaman uyumlu dayak davranış oluşur. Bu yeni yöntem gelecekte kalp yetmezliği tedavisi için tasarlanmış dokular oluşturmak için tekrarlanabilir ve düşük maliyetli bir yöntem olarak umut verici potansiyeli var.

Bizim deneylerde % 70 IPSC-CMs, %15 HCFs ve % 15 HUVECs RPMI/B-27 hücre medya bir konsantrasyon mL başına 2,475,000 hücre, bir hücre süspansiyon kullanılmaktadır. Hücre süspansiyon oluşturduktan sonra biz protokol 4.3. adımında açıklandığı gibi her de açılan sistem, asılı Ultra düşük ek hücre süspansiyon 4 mL reçete. İdam kullanımı açılan sistem pulcuklarının 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem kültürünün 3 gün sonra dayak yüzlerce kendiliğinden oluşumu sonuçlandı. Pulcuklarının kolayca 4 X ve 10 X büyütme ile bir ortalama çapı 350 µm Kültür (Şekil 1) 72 h sonra ışık mikroskobu altında döverler tespit edildi.
Adım 6.5 pulcuklarının hasat sonra iletişim kuralı, sonunda kalıp kolayca basit pipetting yöntemleri ile seribaşı. Pulcuklarının bir füzyon için izin kalıp kültür; kalıp sonraki kaldırma mekanik bütünlüğü bozulmamış bir kardiyak yamasıyla sonuçlandı. Kalıp ve kültürünün 24 saat sonra kaldırılması, işlevsel ve zaman uyumlu atan kalp dokusunun pulcuklarının (Şekil 2, sol) mekanik entegrasyonu teyit gözlendi. Biz de pulcuklarının çok katmanlı kendiliğinden ışık mikroskobu (Şekil 2, sağ) üzerinde koordineli bir biçimde dayak gözlenen.
3-b kardiyak yama kalıp tabanlı Ayrıca kardiyak marker troponin t Confocal görüntüleme ile gerçekleştirilen net bir immunohistokimyasal analizini gösterdi ki iyi hizalanmış cardiomyocytes tüm sergilenen troponin T ifade (Şekil 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58252/58252fig1.jpg"> Resim 1 : Damla pulcuklarının asılı Yaratılış. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı cardiomyocytes (hiPSC-CMs), insan kalp fibroblastlar (HCFs) ve insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) izole ve % 70 IPSC-CMs, %15 HCFs ve % 15 HUVECs, hücre süspansiyon, oluşturmak için kullanılan bir mL başına 2,475,000 hücre konsantrasyonu. 72 saat sonra her micropore kendiliğinden oluşan pulcuklarının kolayca ışık mikroskobu altında döverler için tespit edildi. Ölçek çubuğu sol bölmedeki 1000 µm; = ölçek çubuğu sağ bölmedeki 400 µm. = <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58252/58252fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58252/58252fig2.jpg"> Resim 2 : Oluşturma bileşeni pulcuklarının entegrasyonunu görüntüleme çok katmanlı bir kalp doku. Dekolmanı net kalıp üzerinden sonra 3-b kardiyak yama şeklini muhafaza ve zaman uyumlu dayak, sol panelde gösterildiği gibi pulcuklarının, mekanik entegrasyonu gösteren gösterdi (nerede ölçek çubuğu = 1000 µm). Pulcuklarının yığılmış multilayers ışık mikroskobu ile sağ panelde gösterildiği gibi denetlendi (nerede ölçek çubuğu = 400 µm) ve kendiliğinden dayak için gözlenen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58252/58252fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58252/58252fig3.jpg"> Şekil 3 : Kalp doku değerlendirilmesi ayirt. Ayirt analiz, net kalıp tabanlı 3-b kalp doku bulundu troponin T ifade ile iyi hizalanmış cardiomyocytes oluşur. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58252/58252fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation at JoVE.com

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

Bu iletişim kuralı tatmin edici yapısal bütünlüğü ve zaman uyumlu dayak davranışı ile üç boyutlu iskele ücretsiz kalp doku oluşturmak için net bir kalıp tabanlı yöntemini açıklar.

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

a-net-mold-based-method-scaffold-free-three-dimensional-cardiac

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.8K Görüntüleme.  The First Hospital of Jilin University. Bu iletişim kuralı tatmin edici yapısal bütünlüğü ve zaman uyumlu dayak davranışı ile üç boyutlu iskele ücretsiz kalp doku oluşturmak için net bir kalıp tabanlı yöntemini açıklar.

Video: A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Biyomühendislik

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which are developed towards the goal of clinical use. HiPSC-derived cardiomyocytes, endothelial cells, and vascular mural cells are mixed with gel matrix and then poured into a polydimethylsiloxane (PDMS) tissue mold with rectangular internal staggered posts. By culture day 14 ECTs mature into a 1.5 cm x 1.5 cm mesh structure with 0.5 mm diameter myofiber bundles. Cardiomyocytes align to the long-axis of each bundle and spontaneously beat synchronously. This approach can be scaled up to a larger (3.0 cm x 3.0 cm) mesh ECT while preserving construct maturation and function. Thus, mesh-shaped ECTs generated from hiPSC-derived cardiac cells may be feasible for cardiac regeneration paradigms.

The present protocol generates mesh-shaped engineered cardiac tissues containing cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells to allow the investigation of cell implantation therapy for heart diseases.

In Vivo Miyokardiyal Onarım için İnsan iPS Hücrelerinden Elde Edilen Örgü Şekilli Mühendislik Kardiyak Dokuların Hazırlanması

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, structures, phenotypes, and performance depending on each specific perfused tissue. The field of tissue engineering, which aims to repair or replace damaged or missing body tissues, relies on controlled angiogenesis to create a proper vascularization within the engineered tissues. Without a vascular system, thick engineered constructs cannot be sufficiently nourished, which may result in cell death, poor engraftment, and ultimately failure. Thus, understanding and controlling the behavior of engineered blood vessels is an outstanding challenge in the field. This work presents a high-throughput system that allows for the creation of organized and repeatable vessel networks for studying vessel behavior in a 3D scaffold environment. This two-step seeding protocol shows that vessels within the system react to the scaffold topography, presenting distinctive sprouting behaviors depending on the compartment geometry in which the vessels reside. The obtained results and understanding from this high throughput system can be applied in order to inform better 3D bioprinted scaffold construct designs, wherein fabrication of various 3D geometries cannot be rapidly assessed when using 3D printing as the basis for cellularized biological environments. Furthermore, the understanding from this high throughput system may be utilized for the improvement of rapid drug screening, the rapid development of co-cultures models, and the investigation of mechanical stimuli on blood vessel formation to deepen the knowledge of the vascular system.

Engineered tissues heavily rely on proper vascular networks to provide vital nutrients and gases and remove metabolic waste. In this work, a stepwise seeding protocol of endothelial cells and support cells creates highly organized vascular networks in a high-throughput platform for studying developing vessel behavior in a controlled 3D environment.

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In particular, 3D models can play an important role in the field of cardiology, where complex congenital heart diseases occur. While many 3D printers can provide anatomically correct and detailed models, existing 3D printing materials fail to replicate myocardial tissue properties and can be extremely costly. This protocol aims to develop a process for the creation of patient-specific models of complex congenital heart defects using a low-cost silicone that more closely matches cardiac muscle properties. With improved model fidelity, actual surgical procedural training could occur in advance of the procedure. Successful creation of cardiac models begins with the segmentation of radiologic images to generate a virtual blood pool (blood that fills the chambers of the heart) and myocardial tissue mold. The blood pool and myocardial mold are 3D printed in acrylonitrile butadiene styrene (ABS), a plastic dissolvable in acetone. The mold is assembled around the blood pool, creating a negative space simulating the myocardium. Silicone with a shore hardness of 2A is poured into the negative space and allowed to cure. The myocardial mold is removed, and the remaining silicone/blood pool model is submerged in acetone. The described process results in a physical model in which all cardiac features, including intra-cardiac defects, are represented with more realistic tissue properties and are more closely approximated than a direct 3D printing approach. The successful surgical correction of a model with a ventricular septal defect (VSD) using a GORE-TEX patch (standard surgical intervention for defect) demonstrates the utility of the method.

Patient-specific models improve surgeon and fellow confidence when developing or learning surgical plans. Three-dimensional (3D) printers generate adequate detail for surgical preparation, but fail to replicate tissue haptic fidelity. A protocol is presented detailing the creation of patient-specific, silicone cardiac models, combining 3D printing precision with simulated silicone tissue.

Ameliyat Öncesi Planlarda ve Uygulamalı Eğitimde Uygulamalarla Hastaya Özgü Silikon Kardiyak Modellerin Oluşturulması

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...