Bu yöntem analitik kimya, biyokimya ve biyoteknoloji alanlarında ki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Kafein biyosentezinde meydana gelen değişiklikler nelerdir gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, kafein üreten invitro bitki modellerine uygulanabilmektir.
Başlamak için, lyophilized hücrelere aseton 10 mililitre ekleyin ve 30 saniye girdap karıştırıcı ile karıştırmadan önce şişe mühür. Daha sonra, oda sıcaklığında beş saat boyunca bir rotator ile 100 rpm örnek karıştırın. Bundan sonra, aseton 25 mikrolitre ile numuneyi yeniden askıya alın.
İlk olarak, silika jel plakaları için önceden hazırlanmış kafein ekstresi bir mikrolitre uygulayın. Daha sonra, mobil faz, sikloheksane aseton 10 mililitre ile kromatografi odasında TLC geliştirmek. Kafein bantlarını kompakt bir UV lambası ile kısa dalga boyu ultraviyole ile görselleştirin.
Bundan sonra, 273 nanometre densitometri ile kafein düzeylerini ölçmek. Filtre kağıdı kullanarak, vakum filtresi önceden hazırlanmış hücre süspansiyon. Daha sonra, hücre örneğini sıvı nitrojen ve RNA izolasyon reaktifi ile homojenize olana kadar kullanmak için porselen harç kullanın.
Daha sonra, numunenin 500 mikrolitresini steril mikro santrifüj tüpüne aktarın. Sonra, kloroform izoamyl alkol 300 mikrolitre ekleyin ve dengeli fenol 300 mikrolitre. Bir girdap karıştırıcı ile karıştırın ve santrifüj 20, 000G dört derece santigrat 15 dakika için.
Bundan sonra, temiz bir mikro santrifüj tüpü üst faz300 mikrolitre aktarın. Sonra, 200 mikrolitre isopropanol ekleyin ve tüpü negatif 20 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Pelet etanol bir mililitre ekleyin.
Daha sonra tüpü 12,000G'de 10 dakika santrifüj edin ve sıvı fazı ayırın. Daha sonra, oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca numune kuru. Daha sonra, DEPC ile işlenmiş su 25 mikrolitre ile RNA ekstresi yeniden askıya.
İlk olarak, steril bir mikro santrifüj tüp toplam RNA ekstresi iki mikrogram ekleyin. Daha sonra, 10X reaksiyon tampon bir mikrolitre ve DNase bir mikrolitre ekleyin. DEPC ile işlenmiş su ile 10 mikrolitre reaksiyonun son hacmini getirin.
Sonra, bir dakika için 2, 000G örnek ve santrifüj karıştırın. Sonra, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca örnek kuluçka. Bundan sonra, reaksiyonu durdurmak için 50 mikromkare disodyum etilen dimine dilamin tetraasetat bir mikrolitre ekleyin.
Numuneyi 65 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra, bir agarose jel için RNA 100 nanogram uygulayın ve jel çalıştırın. Bir jel fotoğraf dokümantasyon sistemi kullanarak RNA bütünlüğünü görselleştirin.
İlk olarak, bir mikro santrifüj tüpüne toplam RNA 2,5 mikrogram ekleyin. Sonra, oligo deoksitimidin astar bir mikrolitre ekleyin ve nükleaz içermeyen su ile 13 mikrolitre son hacmine tüp doldurun. Karışımı örnek ve santrifüj 2, 000G bir dakika için.
Numuneyi 65 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Ve sonra dört derecede iki dakika lığına. Daha sonra, numuneye dört mikrolitre 5X reaksiyon tamponu, iki mikrolitre dNTP karışımı ve bir mikrolitre ters transkriptaz ekleyin.
Daha sonra, bir dakika için 2, 000G hafifçe örnek ve santrifüj karıştırın. Bundan sonra, 45 santigrat derecede 50 dakika, sonra 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübül. PCR mikro santrifüj tüpüne 7,5 mikrolitre 2X Taq DNA polimeraz ve 0,1 mikromol RAX ekleyin.
Daha sonra, CCS1 genini yükseltmek için her biri ileri ve ters astar 0,75 mikrolitre ekleyin. Bundan sonra, 600 nanogram CDNA şablonu ekleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi gerçek zamanlı PCR amplifikasyon reaksiyonu Preform.
Ardından, verileri PCR yazılımıyla analiz edin. Hücresel malzeme bir gram tartmak ve alüminyum folyo içinde paketi. Numuneyi aldıktan sonra, cam bir şişeye aktarın ve 2,5 mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin.
Sonra, 20, 000G dört santigrat derece 20 dakika için örnek santrifüj. 500 mikrolitre aliquot'u kriyojenik şişelere aktarın. Bir spektrofotometre ile, standart olarak sığır seric albumin ile, bir bicinchoninic asit tsay kullanarak 562 nanometre de numunenin protein konsantrasyonu ölçün.
İlk olarak, metin protokolüne göre, bir mikro santrifüj tüp reaksiyon karışımı hazırlayın. Daha sonra, 100 milimolar tris HCL ile 200 mikrolitre toplam hacmini artırmak. Unutmayın, kendi güvenliğiniz için radyoaktif madde ile reaksiyon karışımı hazırlanması sırasında uygun önlemleri takip etmek zorunludur.
Mikro santrifüj tüpünü buzda tutun ve yedi ila dokuz miligram protein içeren çözünür fraksiyonun hacmini ekleyin. Sonra, karışımı girdap ve 30 derece santigrat 30 dakika kuluçka. Bundan sonra, beş dakika için 11, 000G de numuneleri santrifüj.
Daha sonra, dikkatle 900 mikrolitrelik bir hacim kurtarmak ve bir Scintillation vial örnekleri aktarın. Daha sonra, oda sıcaklığında kaputun kuruluğu tamamlamak için kloroform buharlaşır. Şişeye beş mililitre sintilasyon sıvısı ekleyin.
Son olarak, bir sintillation sayacı kullanarak kafein dahil radyoaktivite analiz. Bu protokolde kafein emiciliği, TLC densitometrisi, görünür ışık spektrumu ve 273 nanometrede maksimum emilim de okunarak analiz edildi. TLC plaka kafein ayırma eğrisi, 0.34 arasında bir RF gösterdi, ve 0.39.
Askıda hücrelerden elde edilen RNA, 28'ler, 18'ler ve 5'ler RRNA alt birimlerinin açık ayrımlarını sergileyerek örneklerin yüksek kalitede olduğunu gösterir. Son olarak, kafein synthase geni için tek bir amplifikasyon ürünü gösteren QPCR analizinden bir erime eğrisi elde edildi. Bu teknik, geliştirildikten sonra biyoteknoloji ve biyokimya alanlarındaki araştırmacıların kahve, çay ve cocodan ikincil metabolize doku kültürünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.
Radyoaktivite ve moleküler patoloji ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven, gözlük ve radyoaktif madde için özel ekipman kullanımı gibi önlemler her zaman alınacaktır.
