Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области аналитической химии, биохимии и биотехнологии. Такие, как, какие изменения происходят в биосинтезе кофеина. Основным преимуществом этой техники является то, что она может быть применена к моделям растений invitro, которые производят кофеин.
Для начала добавьте 10 миллилитров ацетона в лиофилизированные клетки и запечатайте колбу перед смешиванием с миксером вихря в течение 30 секунд. Затем смешайте образец при 100 об/мин с ротатором в течение пяти часов при комнатной температуре. После этого повторно приостанавливаем образец с 25 микролитров ацетона.
Во-первых, нанесите один микролитер ранее подготовленного экстракта кофеина на пластины кремнеземного геля. Затем разработайте TLC в хроматографической камере с 10 миллилитров мобильной фазы, циклохексан ацетон. Визуализуйте полосы кофеина в коротковолновом ультрафиолетовом диапазоне с компактной УФ-лампой.
После этого количественно уровень кофеина по денситометрии составляет 273 нанометров. Используя фильтровальную бумагу, вакуумный фильтр предварительно подготовленную подвеску ячейки. Затем используйте фарфоровый раствор для мацератации образца клетки с жидким азотом и реагентом изоляции РНК, пока он не будет гомогенизирован.
Затем перенесите 500 микролитров образца в стерильную микро центрифугу. Затем добавьте 300 микролитров хлороформного изоамилового спирта и 300 микролитров равноотрещенного фенола. Смешайте образец с вихревой смеситель и центрифуга его на 20000G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию.
После этого перенесите 300 микролитров верхней фазы в чистую микро центрифугу. Затем добавьте 200 микролитров изопропанола и инкубировать трубку в течение одного часа при отрицательном 20 градусов по Цельсию. Добавьте в гранулы один миллилитр этанола.
Затем центрифуга трубки при 12 000 Г в течение 10 минут и декантировать жидкую фазу. Затем высушите образец в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Затем повторно приостанавливаем экстракт РНК с 25 микролитров воды, обработанной DEPC.
Во-первых, добавьте два микрограмма общего экстракта РНК в стерильную микро центрифугу. Затем добавьте один микролитер буфера реакции 10X и один микролитер DNase. Довнесите окончательный объем реакции до 10 микролитров с помощью воды, обработанной DEPC.
Затем смешайте образец и центрифугу при 2000 Г в течение одной минуты. Затем инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. После этого добавьте один микролитр из 50 микромолярной этилен диамин тетраацетат, чтобы остановить реакцию.
Инкубировать образец при 65 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Затем нанесите 100 нанограмм РНК на гель агарозы и запустите гель. Визуализуйте целостность РНК с помощью системы фотодокументарной документации геля.
Во-первых, добавьте 2,5 микрограмма общей РНК в микро центрифугу трубки. Затем добавьте один микролитр олиго деокситимидин грунтовки и заполните трубку до конечного объема 13 микролитров с нуклеазной водой. Смешайте образец и центрифуга его на 2000G в течение одной минуты.
Инкубировать образец при 65 градусах по Цельсию в течение пяти минут. А потом при четырех градусах по Цельсию в течение двух минут. Затем добавьте в образец четыре микролитера буфера реакции 5X, два микролитров смеси dNTP и один микролитер обратной транскриптазы.
Затем аккуратно смешайте образец и центрифугу при 2 000 г в течение одной минуты. После этого инкубировать образец при 45 градусах по Цельсию в течение 50 минут, а затем при 70 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Добавьте 7,5 микролитров полимеразы ДНК 2X Taq и 0,1 микромолета RAX в микро центрифугу ПЦР.
Затем добавьте 0,75 микролитров каждый из вперед и обратной грунтовки, чтобы усилить ген CCS1. После этого добавьте 600 нанограммов шаблона CDNA. Предварительноформировать реакцию усиления в ПЦР в режиме реального времени, как описано в текстовом протоколе.
Затем проанализируйте данные с помощью программного обеспечения PCR. Взвесь один грамм клеточного материала и упаковать его в алюминиевую фольгу. После мацерации образца перенесите его в стеклянный флакон и добавьте 2,5 миллилитров буфера извлечения.
Далее, центрифуга образца на 20000G в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите 500 микролитров алицитов в криогенные флаконы. С помощью спектрофотометра, измерить концентрацию белка образца на 562 нанометров с помощью анализа бицинхониновой кислоты, с бычьим серическим альбумином в качестве стандарта.
Во-первых, подготовить реакционной смеси в микро центрифуге трубки, в соответствии с текстовым протоколом. Затем увеличьте общий объем до 200 микролитров со 100 миллимолярной тройкой HCL. Помните, что для вашей собственной безопасности необходимо соблюдать надлежащие меры предосторожности при подготовке реакционной смеси с радиоактивным материалом.
Держите трубку микро центрифуги на льду и добавьте объем растворимой фракции, содержащей от семи до девяти миллиграммов белка. Затем вихрь смеси и инкубировать при 30 градусов по Цельсию в течение 30 минут. После этого центрифугировать образцы на 11 000G в течение пяти минут.
Затем тщательно восстановите объем в 900 микролитров и перенесите образцы в сцинтилляционный флакон. Далее испаряется хлороформ для полной сухости в капюшоне при комнатной температуре. Добавьте пять миллилитров сцинтилляционной жидкости во флакон.
Наконец, проанализировать радиоактивность включены в кофеин с помощью счетчика сцинтилляции. В этом протоколе, картина поглощения кофеина была проанализирована с помощью TLC денситометрии, через видимый спектр света, и чтение в максимальном поглощении на 273 нанометров. Кривая разделения кофеина на пластине TLC показала РФ между 0,34 и 0,39.
РНК, полученная из подвесных клеток, демонстрирует четкое разделение подразделений 28-х, 18-х и 5-х РРНК, что свидетельствует о высоком качестве образцов. Наконец, кривая расплава была получена из анализа ПЦР, показывающего один продукт усиления гена синтазы кофеина. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области биотехнологии и биохимии для изучения вторичной метаболизации культуры тканей из кофе, чая и кокоса.
Не забывайте, что работа с радиоактивностью и молекулярной патологией может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда принимаются меры предосторожности, такие как использование перчаток, очков и специального оборудования для радиоактивного материала.
