Name: preparing developing peripheral olfactory tissue for molecular and immunohistochemical analysis in drosophila
Uploaded: 2018-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila at JoVE.com

Bu çalışmada, Ulusal Bilim Vakfı Hibe için Pelin C. Volkan (DEB-1457690) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki iletişim kuralı Duke Üniversitesi Araştırma Etik Komitesi tarafından kurulan etik kuralları ile tutarlıdır.
1. doku hazırlık ve Drosophila melanogaster Pupa gelişimsel evreleme
<ol><li>İlk olarak, ne kadar çok sinek diseksiyon için gerekli olacaktır tanımlamak. RT-PCR ve RNAseq için 100-200 antennal diskler ve anten prepupal, 8 h APF, 40 h APF ve yetişkin aşamalarında gerekli olan bireyler toplamak. İmmünhistokimya için 10-20 kişi incelemek.</li>
	<li>Diseksiyon yastıkları ve forseps, % 70 ile mendil kullanarak da dahil olmak üzere tüm malzemeler temiz alkol. Eğer disseke malzeme RNA çekimi için kullanılan, RNase NÖTRALLEŞTİRİCİLER ile her şeyi temizlemek ve tüm çözümler nükleaz ücretsiz kullanarak yapmak için veya dietil pyrocarbonate (DEPC) su tedavi. Not: Bu protokol gruptakiler için cam yerine silikon diseksiyon yastıkları kullanır. Silikon yastıkları için ultra-ince forseps dostu olan ve hızlı ve yüksek kaliteli diseksiyonlarının teşvik.</li>
	<li>Pupa 0 h APF/prepupal sahne toplamak.<ol>
<li>En doğru evreleme, monitör larva 30 dk 1 h aralıklar sağlamak için. Not: Göçebe üçüncü INSTAR larva orta derecede kalabalık bir şişe büyük olasılıkla birkaç saat içinde YavruIar.</li>
		<li>Bir kez larvaları hareketsiz hale ve bir çok hafif (neredeyse beyaz) renkli pupa dava ile çevrili, onları içine bir küçük 2 - inç nemli bir filtre kağıdı ile Petri kabına aktarın.</li>
		<li>1-2 h için zaman zaman izleme, belirlenmesi ve prepupae transfer etme, devam edin. Not: Alternatif olarak, tüm pupa bir şişe temizleyin ve larvalar için 2 h geliştirmek izin. 2 h 0 - 2 h APF Aralık içinde olacak sonra tüm pupa toplanan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemen 3.1 prepupal antennal disk 0 h APF sahne için incelemek için adımına. Prepupa yaşlı gerekiyorsa, onları bir tabak içine toplamak, çanak kapağı ve parafin film kuruluk etkisizleştirmek için kenarlarda yerleştirin ve 25 ° C'de Petri kabına yerleştirin Not: Pupa şimdi eclosion için yaşlı.</li>
	<li>Pupa değil emin olmak için prepupae 2 h istenen çağına için 2 h aralığında toplanan pupa için yaş fazlalığı.</li>
	<li>Çok küçük ve kırılgan doku olan Ultra-ince forseps (Dumont 55) kullanın.</li>
</ol>2. doku hazırlık ve Pupa diğer Drosophila tür gelişimsel evreleme
<ol><li>Diğer Drosophila türler pupa geliştirilmesinde uzunluğunu belirlemek için optimum sıcaklık örnekleri yer, kayıt tarihleri ne zaman prepupae gözlenir, taze bir şişe sıralamak ve prepupa gün yetişkinliğe kaydedin.</li>
	<li>Non -melanogaster türler ve melanogasterzaman pupa kalkınma oranı kaydedin. Melanogaster evreleme için non -melanogaster türler yaş için saat sayısı elde etmek için kullanılan saat sayısı gelişimsel zaman oranı ile çarpın.</li>
</ol>3. D. melanogaster pupa Antennal disk diseksiyon
Not: İçin açıklanan tüm yaşlanma kez ve diseksiyon protokolleri Drosophila melanogaster. Tüm diğer türler için yukarıda açıklandığı gibi bir değişiklik species-specific gelişimsel zaman puan dayalı yaşlanma Protokolü'nün gerekli, olacaktır.
<ol><li>Pupa antennal disk gruptakiler, 50-100 0 - 2 h veya 6-8 h eski pupa bir spatula kullanarak toplar ve bunları bir diseksiyon rampasında yer.</li>
	<li>RNA izolasyon çözüm 150 µL pipet bir RNase ücretsiz 1.5 mL microfuge 200-µL pipet kullanarak tüp ve tüp buza koyun içine.</li>
	<li>1 x PBS (fosfat tamponlu tuz, nükleaz içermeyen) 150-200 µL içinde pupa incelemek. PBS (damlacık başına 150-200 µL) birden fazla damlacıkları diseksiyon altlığında yerleştirin.</li>
	<li>Diseksiyon altlığında birinde 1 x PBS damlacıkları disseke için 0 - 2 h veya 6-8 yaş arası h Pupa (damla başına bir pupa) yerleştirin. Forseps bir elinde vücut stabilize etmek için kullanın.</li>
	<li>0 - 2 h pupa prepupa en ön bölümü (ağız kancalar) üzerinde öte yandan, tutun forseps kullanarak, Yaşlı ve hem zeki hem ön pupa gövdesine yapıştırılmış Imaginal diskler ortaya çıkarmak için çıkar.</li>
	<li>8 h APF pupa için ilk yavaşça kafa vücut çevreleyen zar çuval içinde teşhir pupa, pupa olgusu en ön çeyreğinden akasındaki. Not: Vücut, bu aşamada bir degenerating larva gibi görünüyor.</li>
	<li>Boyun eklemi başında kaldırın. Not: Bu antennal diskleri kayıp, olmayacaktır sağlar ki bu aşamada için öncelikle optik loblar beyni bağlı olan.</li>
	<li>Başka bir 1 x Forseps veya 20 µL pipet kullanarak PBS damlacık doku beyin ve Imaginal diskler ile aktarın.</li>
	<li>Optik loblar, beyin bağlı göz antennal disk tanımlayın. Forseps kullanarak, göz antennal disk beyin ve pupa durumda çekin. Yeni bir 1 x Forseps veya 20 µL pipet kullanarak PBS damlacık aktarmak. Not: Prepupal göz antennal disk düz bir dokudur. Ancak, 8 h pupa tarafından göz diskler antennal diskler, çukurluğu hangi anterior merkezi beyin oturur döndürülür.</li>
	<li>Forseps kullanarak, doku ve göz antennal disk arasında bağlantı yerinde kesti. 20 µL pipet yavaşça disseke doku RNA izolasyon çözüm reaktif aktarmak için kullanın. Mümkün olduğu kadar küçük bir miktar pipetting tarafından aktarılan sıvı miktarını en aza indirmek.</li>
	<li>Tüm pupa disseke kadar yineleyin.</li>
</ol>4. diseksiyon D. melanogaster orta-pupa ve yetişkin antenler
Not: APF 40 h tarafından metamorfoz çoğunluğu tamamlandıktan ve yetişkin yapıları belli oluyor ama hala beyaz ve tanımlanamaz. Bu gelişim zamanda noktada yetişkin anten son şeklini almıştır ama hala saydamdır ve birkaç dışında koku reseptörleri çoğunluğu ifade başlamış değil.
<ol><li>Pupa antennal gruptakiler, 1. adımda açıklandığı gibi 50-100 prepupae toplar ve onları 25 ° C'de 40 h için yaş</li>
	<li>Damlalıklı 150 µL RNA izolasyon çözüm içine bir RNase free 1.5 mL microcentrifuge 200-µL damlalıklı kullanarak tüp ve tüp buza koyun.</li>
	<li>Diseksiyon altlığında içine bir PBS damlacıkları x 1'in disseke pupa yerleştirin. Forseps bir elinde vücut stabilize etmek için kullanın. Forseps diğer elinde kullanarak, yavaşça kafa vücut çevreleyen zar çuval içinde teşhir pupa, pupa olgusu en ön çeyreğinden akasındaki.</li>
	<li>Forseps kullanarak, dikkatle pupa vücudun geri kalanından kafasını forseps kümesi ile vücut tutarak ve kapalı kafa boyun forseps başka bir set ile ortak ripping kesin. Yavaşça başından başka bir 1 x forseps kullanarak PBS damlacık içine aktarın. Yukarı ve aşağı pipet (beyin, vb) gelişmekte olan Drosophila kafa çevrelemek için kullanılan açık bir membran elde etmek için baş içeriğini temizlemek için. Not: 40-50 h APF, anten membran en ön bölümüne bağlanır. Pipetting ile baş içeriğini kaldırıldığında onlar diseksiyon için belirgin hale gelecektir.</li>
	<li>Forseps kullanarak, pupa anten membran bağlantısını kesin. 3 anten 2nd parçasını kesmek sadece 3rd segment koku reseptör nöronlar evi olacak gibi forseps dilim için gelen bir segmental ortak kullanarakrd .</li>
	<li>20 µL pipet yavaşça disseke doku RNA izolasyon çözüm reaktif aktarmak için kullanın. Mümkün olduğu kadar küçük bir miktar pipetting tarafından aktarılan sıvı miktarını en aza indirmek. Tüm pupa disseke kadar yineleyin.</li>
	<li>Yetişkin antennal gruptakiler, yaklaşık 50 Yetişkin toplar ve onları bir hafta sonrası eclosion için yaş. Not: Koku reseptör gen ifade ve diğer genler bir hafta eclosion sonra zirve. Yetişkinler algılama eşik yükselmeye düşük bereket tutanaklar ile biyolojik olarak ilgili gen emin olmak bir hafta boyunca büyükseniz.</li>
	<li>Onlar bir CO2 rampasında hala hayatta iken RNA çekimi için sinekler incelemek. CO2 yastık RNase inhibitörleri ile tedavi. Confocal görüntüleme için PBS veya PBS + % 0.2 x 1'deki bir diseksiyon yastık üzerinde sinekler teşrih Triton.</li>
	<li>İlk olarak, CO2 İstasyonu panelindeki diseksiyon kapsamı altında uyumak için yetişkin koymak. Vücut, stabilize etmek bir elinde forseps kullanarak CO2 istasyonu üzerinde forseps diğer elinde yavaşça çekin/ikinci üçüncü antennal segmentten dışarı çimdik için takımını kullanın.</li>
	<li>Antenler antenleri doğrudan sıvı içine yerleştirmek için forseps kullanarak bir RNA izolasyon çözüm içine aktarın. Tüm yetişkin disseke kadar yineleyin. Not: anten RNA izolasyon çözümde batık olun. Anten yan tarafındaki tüp kalmış olur. Bu artan bir bozulma, RNA, RNA kalite ve miktar azaltılması neden olur.</li>
	<li>Doğrudan RNA ayıklama devam etmek ya da uzun süreli depolama için-80 ° C'de tüpü yerleştirin.</li>
</ol>5. RNA izolasyonu disseke dokular
<ol><li>-80 ° C depolama biriminden tüm örneklerini kaldırmak ve onları buz çözme.</li>
	<li>Kısa bir süre (5-6 sn, ~ 6.000 x g) tüp alt malzeme toplamak için her örnek spin.</li>
	<li>Her örnek için 10 autoclaved bir plastik havaneli ve bir elektrik motoru kullanarak eziyet s buz üzerinde.</li>
	<li>5.2 ve 5.3 4 numaralı adımları yineleyin.</li>
	<li>Piyasada kitleri kullanarak ve bir en iyi verim için üreticinin iletişim kuralları takip RNA çıkarma gerçekleştirin.</li>
	<li>QRT-PCR genler ilgi ve üreticinin iletişim kuralları aşağıdaki karşı belirli astar ve piyasada bulunan reaktifler kullanarak gerçekleştirin.<ol>
<li>Aşağıdaki koşullar kullanarak tüm PCR reaksiyonları taşımak: 95 ° C denatürasyon 10 dk ardından 40 devredir 15 95 ° c s, 30 55 ° C s ve 60 ° C 30 s. Not: Astar çift daldırma ile dpr gen için Tablo 1' de listelenen ve astar koku reseptör genleri için Hueston CE ve ark. içinde yer almaktadır 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Pupa Antennal diskler ve antenler immünhistokimya için fiksasyonu
Not: doku dokular için zaman aynı miktarda giderilen emin olmak için 10-20 kişilerden toplu olarak düzeltmek. Dokuların bütünlüğünü en üst düzeye çıkarmak için bir sabitleştirici aktarmadan önce PBT (PBS deterjan ile) örnekleri ikamet süresini en aza indirmek.
<ol><li>Toplamak disseke antennal diskler veya %0,2 200 µL içeren 200-µL PCR tüp içinde pupa anten PBT buz üzerinde doku bütünlüğünü korumak ve örnek--dan 200-µL PCR duvarına yapışmasını önlemek için hangi-ecek götürmek için eksik bir fiksasyon tüpleri. Not: Pupa anten ve antennal diskler oldukça şeffaf oldukları gibi görmek zor olabilir. Doku kaybı önlemek için tüm çamaşır adımları için bir diseksiyon kapsam kullanılması önerilir. Alternatif olarak, 96-de Terasaki plakaları fiksasyon için kullanılır ve boyama doku en iyi izlemek için olabilir.</li>
	<li>Saptamak disseke antennal disk ve antennal örnekleri üzerinden yaklaşık 200 µL % 4'lük içinde pupa PFA (Paraformaldehyde), oda sıcaklığında 30 dakika. Bu ve sonraki adımları, devam örnekleri tüplerini çözüm örneklerinde mix düzgün bir nutator. Adım 6,7 ilerleme.</li>
	<li>Yetişkin anten için tüm başından önce incelemek ve içinde yaklaşık 200 µL % 4'lük tamir PFA (paraformaldehyde) Oda sıcaklığında 1 h için.</li>
	<li>3 x 200 µL % 0,2 ile yıkayın PBT 10 dk için. Örnekleri üzerinde nutator kuluçka sırasında tutmak.</li>
	<li>Sabit başları diseksiyon mikroskop ikinci antennal segment bir ince diseksiyon için geri dön. Forseps kullanarak kafa dengelemek, yavaşça çekin/ikinci üçüncü antennal segmentten dışarı çimdik için.</li>
	<li>Disseke üçüncü antennal kesimleri yaklaşık 200 µL % 4'lük aktarım PFA (paraformaldehyde) ve oda sıcaklığında 30 dakika düzeltmek.</li>
	<li>3 x 200 µL % 0,2 ile yıkayın PBT 10 dk için. Örnekleri üzerinde nutator kuluçka sırasında tutmak.</li>
	<li>Örnekleri 4 ° C'de depolayın veya doğrudan bütün Dağı immünhistokimya ile devam edin. Not: antikor kullanılıyor, boyama verimliliğini değişebilir. Bu yöntem daha az bol protein Etiketler için uygun veya zayıf antikorlar olmalıdır. Ancak, zaman zaman, (kimlik veya sabitleştirici miktarı veya fiksasyon saat) protokolü bir duruma getirilmesi gerekebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barish, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+olfactory+receptor+neuron+specification+in+Drosophila.">Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).</li><li>Pan, J. W., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+development+and+evolution+of+the+insect+olfactory+system.">Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system.</a> Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).</li><li>Ramdya, P., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+olfactory+systems+on+the+fly.">Evolving olfactory systems on the fly.</a> Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).</li><li>Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Knecht, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+combinations+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+mediate+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila.">Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> eLife. 5, 44-60 (2016).</li><li>Enjin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensing+in+Drosophila.">Humidity sensing in Drosophila.</a> Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).</li><li>Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+endogenous+rotund+expression+and+function+in+developing+Drosophila.+olfactory+system+using+CRISPR-Cas9-mediated+protein+tagging.">Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).</li><li>Hueston, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modulatory+proteins+and+olfactory+receptor+signaling+in+the+refinement+and+maintenance+of+fruitless+expression+in+olfactory+receptor+neurons.">Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons.</a> PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+rules+of+precursor+specification+underlying+olfactory+neuron+diversity.">Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity.</a> Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+conserved+gene+regulatory+network+module+governing+olfactory+neuron+diversity.">A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity.</a> PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).</li><li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+transcriptional+parallelism+and+variation+in+the+developing+olfactory+system+of+Drosophila+species.">Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).</li><li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+behavioral+and+transcriptional+variation+underlying+CO2+sensory+neuron+function+and+development+in+Drosophila.">Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila.</a> Fly. 11 (4), 239-252 (2017).</li><li>Stern, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transgenic+reagents+for+Drosophila+simulans,+D.+mauritiana,+D.+yakuba,+D.+santomea,+and+D.+virilis.">Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı labs Drosophila Drosophila koku doku, hem de karşılaştırmalı analizi, bu programların geliştirilmesinde çalışma genetik ve transkripsiyon programları belirlenmesinde baktılar için yararlı bir kaynaktır bir tür. Gelecekteki çalışmaları için bir astar olarak farklı gelişim aşamalarında sistemleri düzeyi transkripsiyon profillerden gerekirse özellikle yararlıdır. Burada açıklanan protokol sahne ve dört anahtar gelişimin koku alma sistemi üzerinden ön...

Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış çalışmalar ve davranışsal evrim1,2,3 Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir, 4. Drosophila koku dokulara ek olarak hidro ve termo duyusal sinir hücreleri1,5,6uçucu kimyasal ipuçlarını bulmak koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu makale genel amacı nasıl sahne ve pupa ve yetişkin koku doku Drosophila türlerin geliştirme incelemek için göstermektir. Örnekleri farklı pupa aşamaları moleküler ve gelişimsel analizleri gibi RNAseq ve kantitatif RT-PCR, periferik koku sistem ayrıca teknikleri etiketleme vivo içinde doku oluşturmak için bu tekniği için mantığı olduğunu . Bu teknik özellikle gelişmekte olan yetişkin koku alma sistemi belirli hücre türünün tüm transgenik reaktifler var mı non -Drosophila melanogaster türlerden transkripsiyon profilleri dinamikleri tanımlamak yararlı olabilir etiketleme ve analizler. Bu makale, antennal diskler ve antenler pupa ve yetişkin Drosophila türlerden incelemek nasıl gösterir. İlk olarak, Drosophila puparium oluşumu (APF, beyaz pupa veya prepupae) gelişimsel evreleme ve species-specific yaşlanma için 0 h tanımlamak nasıl gösterir. Ardından, antennal diskler ve üçüncü antennal segment incelemek nasıl gösterir; Özellikle, nasıl onları göz disk ve ikinci antennal segment RNAseq veya RT-PCR için gereken doku saflık için ayırmak için. Bu protokol için kabaca açıklanan D. melanogaster aşamada önceden desenli antennal disk (prepupae) karşılık, öncüleri antennal üzerinden yelpazesi disk (8 h APF), ORNs (40 h APF), için terminal farklılaşma başlangıcı ve Yetişkin anten. Son olarak, örnek bir kantitatif RT-PCR için yetişkin anten istimal belgili tanımlık yöntem izole ve in vivo immünhistokimya için veriyoruz. Bu yöntem örnekleri bir RNA/DNA analizi ve koku dokulardan periferik Drosophila tür geliştirme immünhistokimya oluşturmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>10X Phosphate-buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>Dilute to 1X in RNase free water</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;tank</td><td>Air Gas</td><td>CD R200</td><td></td></tr><tr><td>Two sharp forceps (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation solutions</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small bucket with ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 and P200 micropipettes and tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL Microfuge tubes</td><td></td><td></td><td>Purchase nuclease free for best results</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder</td><td>Polysciences</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td>Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS</td></tr><tr><td>2&quot; petri dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55mm filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist</td></tr><tr><td>25 C incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>deionized H2O</td><td></td><td></td><td>Purchase nuclease free or treat with DEPC</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.</td></tr><tr><td>MicroWell Mini Trays with lids</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td>Lids can be used to make silicone dissection pads</td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP antibody</td><td>MBL international corpor</td><td>PM005</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>Mouse anti RAT CD2</td><td>AbD seroTec</td><td>MCA154RHDL</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>ADL195 (anti lamin, mouse)</td><td>Dev studies hydoma ban</td><td>ADL195-s</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>invitrogen</td><td>A11008</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Cy3 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>CALBIOCHEM</td><td>648463</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Lab Rotator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Rotator</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Growcells.com</td><td>NUPW-0125</td><td>Water</td></tr><tr><td>Light-Duty Tissue Wipers</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td>For cleaning dissection supplies</td></tr><tr><td>Superscript II</td><td>invitrogen</td><td>18064014</td><td>Reverse Transcriptase&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAshredder (50)</td><td>RNA extraction</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td></tr><tr><td>Oligo(dT)12-18 Primer</td><td>RT</td><td>life technologies</td><td>18418012</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)</td><td>RNA extraction</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td></tr><tr><td>FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04913850001</td></tr><tr><td>FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&amp;nbsp;</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>06402712001</td></tr><tr><td>LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04729692001</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td><td>qPCR</td><td>NEB</td><td>M0541S</td></tr></tbody></table>

preparing developing peripheral olfactory tissue for molecular and immunohistochemical analysis in drosophila

Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış ve davranışsal evrim Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir. Drosophila koku doku uçucu kimyasal cues hidro ve termo duyusal sinir hücreleri ek olarak algılayan koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu protokol için yetişkin Drosophila türlerin periferik koku doku geliştirme diseksiyon açıklar. İlk aşama ve Drosophila larva, antennal disk diseksiyon tarafından erken pupa aşamaları, orta-pupa aşamaları ve yetişkin anten diseksiyon tarafından takip ardından yaş nasıl açıklar. Ayrıca nerede hazırlıklar qRT-PCR, RNAseq veya immünhistokimya RNA ayıklama gibi moleküler teknikleri kullanılabilir yöntemleri gösterir. Bu yöntemler aynı zamanda diğer Drosophila türler species-specific pupa geliştirme sürelerinin ve ilgili aşamaları için uygun yaşlanma hesaplanır sonra uygulanabilir.

Disseke gelişmekte olan koku doku RT-PCR tarafından takip RNA çıkarılması için gen ekspresyonu değerlendirmek için kullanılabilir veya onun ifade deseni ve genler alt hücrede yerleşimi belirlemek için immünhistokimya iletişim kuralları üzerinden alınan faiz. Bu bölümde, her iki protokolden temsilcisi sonuçları sunmak. Şekil 1 temsilcisi kantitatif RT-yüzey hücre reseptörü ve koku reseptör Gen transkripsiyonu vahşi-türü yetişkin...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila at JoVE.com

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Burada, sahne ve koku doku Drosophila türlerden geliştirme incelemek için bir protokol mevcut. Disseke doku daha sonra kantitatif RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) veya (RNAseq), sıralama RNA gibi moleküler analizleri için in vivo analizleri immünhistokimya veya in situ gibi yanı sıra kullanılabilir hibridizasyon.

Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

preparing-developing-peripheral-olfactory-tissue-for-molecular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

5.7K Görüntüleme.  Duke University. Burada, sahne ve koku doku Drosophila türlerden geliştirme incelemek için bir protokol mevcut. Disseke doku daha sonra kantitatif RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) veya (RNAseq), sıralama RNA gibi moleküler analizleri için in vivo analizleri immünhistokimya veya in situ gibi yanı sıra kullanılabilir hibridizasyon.

Video: Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between cell types or even within a given type? What kinds of spatial rules do they follow? The answers to such fundamental questions in vivo have been hampered so far by a lack of tools for high resolution single cell labeling. Here, a detailed protocol to target single cells with a MultiColor FlpOut (MCFO) technique is provided. This method relies on three differently tagged reporters (HA, FLAG and V5) under UAS control that are kept silent by a transcriptional terminator flanked by two FRT sites (FRT-stop-FRT). A heat shock pulse induces the expression of a heat shock-induced Flp recombinase, which randomly removes the FRT-stop-FRT cassettes in individual cells: expression occurs only in cells that also express a GAL4 driver. This leads to an array of differently colored cells of a given cell type that allows the visualization of individual cell morphologies at high resolution. As an example, the MCFO technique can be combined with specific glial GAL4 drivers to visualize the morphologies of the different glial subtypes in the adult Drosophila brain.

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Cells display different morphologies and establish a variety of interactions with their neighbors. This protocol describes how to reveal the morphology of single cells and to investigate cell-cell interaction by using the well-established Gal4/UAS expression system.

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

Davranış

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Gelişim Biyolojisi

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval body wall contains several cell types that are models to study cell and tissue morphogenesis. For example tracheae are used to examine tube morphogenesis1, and the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larva have become a primary system for the elucidation of general and neuron-class-specific mechanisms of dendritic differentiation2-5 and degeneration6.
The shape of dendrite branches can vary significantly between neuron classes, and even among different branches of a single neuron7,8. Genetic studies in DA neurons suggest that differential cytoskeletal organization can underlie morphological differences in dendritic branch shape4,9-11. We provide a robust immunological labeling method to assay in vivo microtubule organization in DA sensory neuron dendrite arbor (Figures 1, 2, Movie 1). This protocol illustrates the dissection and immunostaining of first instar larva, a stage when active sensory neuron dendrite outgrowth and branching organization is occurring 12,13.
In addition to staining sensory neurons, this method achieves robust labeling of microtubule organization in muscles (Movies 2, 3), trachea (Figure 3, Movie 3), and other body wall tissues. It is valuable for investigators wishing to analyze microtubule organization in situ in the body wall when investigating mechanisms that control tissue and cell shape.

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how complex cell shapes, such as neuronal dendrites, are achieved during development, it is important to be able to accurately assay microtubule organization. Here we describe a robust immunohistological labeling method to examine microtubule organization of dendritic arborization neuron sensory dendrites, trachea, muscle, and other Drosophila larva body wall tissues.

Immünohistolojik Duyusal Nöron Dendritler Mikrotübüller Etiketleme, trakea ve kaslar Drosophila Larva Vücut Duvar

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval ...

Nörobilim

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

Yetişkin hazırlanması Drosophila Gözler İnce Kesit ve Mikroskobik Analizi

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Biyoloji

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Düşük Volatilite Kokularına Karşı Trikoid Sensilla

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Drosophila'nın Juvenil Beyninde Koku Alma Deneyimine Bağlı Sinaptik Yeniden Şekillenme

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period

Early-life olfactory sensory experience induces dramatic synaptic glomeruli remodeling in the Drosophila juvenile brain, which is experientially dose-dependent, temporally restricted, and transiently reversible only in a short, well-defined critical period. The directionality of brain circuit synaptic connectivity remodeling is determined by the specific odorant acting on the respondent receptor class of olfactory sensory neurons. In general, each neuron class expresses only a single odorant receptor and innervates a single olfactory synaptic glomerulus. In the Drosophila genetic model, the full array of olfactory glomeruli has been precisely mapped by odorant responsiveness and behavioral output. Ethyl butyrate (EB) odorant activates Or42a receptor neurons innervating the VM7 glomerulus. During the early-life critical period, EB experience drives dose-dependent synapse elimination in the Or42a olfactory sensory neurons. Timed periods of dosed EB odorant exposure allow investigation of experience-dependent circuit connectivity pruning in juvenile brain. Confocal microscopy imaging of antennal lobe synaptic glomeruli is done with Or42a receptor-driven transgenic markers that provide quantification of synapse number and innervation volume. The sophisticated Drosophila genetic toolkit enables the systematic dissection of the cellular and molecular mechanisms mediating brain circuit remodeling.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spot Işığı: Kritik Dönemlerde Deneyime Bağlı Sinaptik Budamada Glial Etkinin Araştırılması

We describe here methods for inducing and analyzing olfactory experience-dependent remodeling of antennal lobe synaptic glomeruli in the Drosophila juvenile brain.

Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller

Immünohistolojik Duyusal Nöron Dendritler Mikrotübüller Etiketleme, trakea ve kaslar Drosophila Larva Vücut Duvar

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün

Yetişkin hazırlanması Drosophila Gözler İnce Kesit ve Mikroskobik Analizi

Elektrofizyolojik Kayıt

Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi

Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi

Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi