Name: simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection at JoVE.com

Yazarlar büyük ölçüde Bogdan Osadchiy ve Evgenii Protasov (Irkutsk State University, Rusya) yardımıyla video Protokolü hazırlanmasında kabul etmiş oluyorsunuz. Bu araştırma için temel araştırma (#15-29-01003) Rus Bilim Vakfı (#15-14-10008) ve Rus Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel yordamlar AB Direktifi 2010/63/AB hayvan deneyleri için uygun olarak yapılmıştır ve hayvan konularda araştırma komitesi, Enstitüsü biyoloji Irkutsk State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Microcapsules imalatı
Not: bir floresan boya taşıyan Microcapsules ters şarj edilmiş polyelectrolytes7,8katman katman Meclisi kullanarak hazırlanır. Tüm yordamları oda sıcaklığında yapıldı.
<ol><li>Gözenekli CaCO3 microcores floresan boya kapsayan sentezlemek için 2 mL (çoğu polimer bağlı floresan boya FITC-BSA gibi kullanılabilir) SNARF-1-dextran çözeltisi ~ 2 mg/mL konsantrasyonu 0.6 mL ile her biri 1 mol/L çözümleri CaCl2, mix ve Na2CO3 hızlı karıştırma altında. Not: floresan boyalar farklı hassasiyetleri photobleaching için dikkat; bir ışığa duyarlı floresan sonda (gibi SNARF-1) kullandıysanız, işleme ve depolama microparticles ile mümkün olduğunca az ışık olarak gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Sonra 5-10 s ajitasyon, süspansiyon 2 mL microcentrifuge tüpler ve santrifüj 15 transfer 10.000-12.000 CaCO3 microcores cips için g, s.</li>
	<li>Süpernatant atmak, çekirdek ~ 2 mL deiyonize su ile yıkayın ve Pelet sallayarak resuspend.</li>
	<li>Toplamda üç kez Santrifüjü yıkama yordamı yineleyin. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.</li>
	<li>Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya. Dikkat: kulak kulaklık ile korumak unutmayın.</li>
	<li>İlk polimer katman şablonlar yatırmak için ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik poly(allylamine hydrochloride) (PAH) 1 mol/L NaCl içinde çekirdek resuspend.<ol>
<li>Microcores ~ 5 dakika sürekli sallayarak ile çözüm unutmayın.</li>
		<li>15 sonra Santrifüjü, s süpernatant ilişkisiz PAH ile atmak. Kapalı microcores en az 3 kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü ve adımları yıkama deiyonize su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.</li>
		<li>Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya. Not: Uygulamalı floresan boya katyonik ise, poli (sodyum 4-styrenesulfonate) başlatma (PSS) ın 1 mol/L NaCl (bkz. Adım 1.7).</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.6 ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik (Ayrıca 1 mol/L NaCl içeren) PSS ile ikinci polimer tabaka şablonlar yatırmak için adımları yineleyin.</li>
	<li>12 polimer kat yatırmak için 1,6 ve 1.7 altı kez adımları yineleyin. Not: Bu uzun bir aradan (~ 12 saat veya daha fazla) almak için tavsiye edilmez çünkü CaCO3 microcores kapsama olmadan Li2 eğilimi ~ 3-5 kadar yordamdaki katmanları yatırılan. Not PSS kapsama microcores daha yüksek bir toplama neden olur ve uzun sessizlik (PLL-g-PEG) sadece PAH veya poli-L-lizin Polietilen glikol ile aşılı dıştaki katman olduğunda önerilir.</li>
	<li>Kapalı microcores 2 mg/ml PLL-g-PEG (~ 1 mL microtube başına) en az 2 h için kuluçkaya.<ol>
<li>Microcores sıralı Santrifüjü ve resuspension adımları üzerinden su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İçi boş microcapsules elde etmek için CaCO3 şablonlar 2 mL (pH 7.1 NaOH ile düzeltilmiş) 0,1 mol/L ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltisi ekleyerek kapalı microcores geçiyoruz.<ol>
<li>Microcapsules 45 s ve atma, kuluçka ~ 5 dk sonra santrifüj kapasitesi süpernatant EDTA ile.</li>
		<li>1.10-1.10.1 adımları iki kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microcapsules % 0,9 NaCl üç kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü adımlar içinde 45 ile yıkayın s takip adımlar yıkayarak. Son Santrifüjü adımdan sonra süpernatant atmak. Not: Son microcapsule çözüm enjeksiyon için (örneğin ampisilin, 0.1 mg/mL ekleyerek) steril tutulmalıdır ve medya araştırma (izotonik ortam nötr pH ile) ile biyouyumlu olmalıdır.</li>
	<li>Bir hemasitometre bir floresan mikroskop altında hazırlanan microcapsules konsantrasyonu tahmin ediyoruz. Microcapsules resimleri bir dizi, çapı yüz microcapsules ImageJ9 veya eşdeğer yazılım kullanma hakkında ölçmek ve bir çubuk grafik kullanarak boyutu dağıtım araştırmak.</li>
	<li>Mağaza elde edilen karanlıkta prob kapsüllenir. Not: sonra birkaç yıkama steril % 0,9 NaCl, microcapsules ay 4 ° C'de depolanan Tam microcapsules depolama sırasında kurutma tavsiye edilmez.</li>
</ol>2. Optik Kurulum ve kalibrasyon mikroenkapsüle SNARF-1'in hazırlanması
Not: Kaba pH ölçümleri mikroenkapsüle SNARF-1 ile floresan mikroskop7iki kanallarında görüntüleri kullanılarak yapılabilir, ancak tek kanallı floresan mikroskop fiber spektrometre için bağlı bu protokolü uygulandı.
<ol><li>Floresan filtre uygulanan floresan boya özelliklerine göre floresan mikroskop için gerekli kümesi yerleştirin ve floresan lamba açmak.<ol>
<li>Kolu göz mercekleri için çekin. Uyarı: Aşırı ışık Spektrometre matris zarar verebilir. Böylece, spektrometre kullanılmadığında kolu "mercek" modunda olduğundan emin olun.</li>
		<li>Fiber optik bir ucunu Spektrometre ve bir kolimatör diğer ucunu bağlayın. Bağdaştırıcıları kullanarak, Kolimatör kamera tüpü odak veya floresan mikroskop diğer kullanılabilir bağlantı noktası ekleyin.</li>
		<li>Spektrometre üzerinde açın. Spektrometre denetim programını çalıştırıp Spektrometre ölçümleri için hazırlamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microcapsule toplu kalibrasyonunun ~ 5 µL microcapsule süspansiyon (~ 10 000 microcapsules µL deiyonize su başına), mikroskop slaytta yer ve karanlık bir yere (örneğin, bir termostat 35 ° c) içinde belgili tanımlık damla kuru.<ol>
<li>Microencapsulated SNARF-1 spektral özellikleri ayarlamak için bir dizi arabellekleri ~ 6-9 aralığındaki farklı pH değerleri kullanın. ~ 10 µL SNARF-1-dextran ile kurutulmuş microcapsules üzerine bir arabellek bırak ve bir coverslip ile kaplayın.</li>
		<li>Cam slayt mikroskop sahnesinde yerini. × 40 amacı istimal microcapsules bulun.</li>
		<li>Mikroskop kolu kamera bağlantı noktasına çevirin. Onların Floresans Spektrometre ile kayıt. Göz mercekleri başa kolu çevirin. Not: spektral sinyal çok arka plan düzeyinin sağlayın ve görüş alanı içinde microcapsules bir balonun içinde (daha düşük bir boyuta gerekirse geçiş yaparak) olmadığından emin olun. Aynı microcapsules uzun süreli aydınlatma kaçının. SNARF-1 için photobleaching duyarlıdır.</li>
		<li>2.2.3 farklı microcapsules için 10 - 15 kez yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan en yüksek oranları (örneğin, R veya Scilab kullanarak) hesaplamak için tüm kayıtlı spectra ve medyan oranı (için her arabellek) ve aşağıdaki formülü kullanarak orta pH arasındaki regresyon çizgisini belirler: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> Not: SNARF-1 ile iki doruklarına protonated ve deprotonated boya emisyon için karşılık gelen bir spektrum vardır ve tepeler arasındaki oran orta pH cevap veriyor. Bu çalışmada, 605 ve 660 nm floresan yoğunluğu arasındaki oranı kullanılır. Bu dalga boyu kullanılan filtre kümesini bağlı olarak seçilir. a ve b (örneğin, R kullanarak) doğrusal olmayan regresyon belirlenecek katsayıları vardır. 0,15 ve 1.1 değerlerdir, sırasıyla, minimum ve maksimum değerlerini ben605/i660 kalibrasyon sırasında gözlenen.</li>
	<li>Balık kan yaklaşık 10 µL yaklaşık 5 Yetişkin hayvanlardan toplamak. Yer balık Petri kabına 1 µL/mL ile içine su karanfil yağı anestezi için süspansiyon ve hayvan yan döner ve fin pinch için yanıt vermiyor kadar bekleyin (genellikle ~ 2-3 dk). Balık bir cam slayt üzerinde aktarın. Balık kuyruğu lanset ile kesti ve kuyruk damar yaklaşık 2 µL balık kan toplamak. Not: kan pıhtılaşma önlemek için heparin (5000 U/mL) ile belgili tanımlık kesme tedavi ve heparinized cam kılcal damarlar ve microcentrifuge tüpler kan toplamak için kullanın.<ol>
<li>Yaklaşık 10 µL kan elektrot ucunu üzerine bir pipet ile damla ve pH pH-metre kullanarak belirleyebilirsiniz.</li>
		<li>Kan kurutulmuş microcapsules ile bir slayt üzerine bırakın ve kalibrasyon arabelleklerini (adım 2.2 2.3) açıklandığı gibi floresan yoğunluğu oranı kayıt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eğri (için daha fazla ayrıntı bkz: Borvinskaya ve ark. 20175) balık kanı ölçümlerde maç yapmak için kalibrasyon eğrisi doğrusal katsayısı ayarlayın.</li>
</ol>3. hazırlık enjeksiyon için
<ol><li>Çelik iğne ucu keskin lanset ile plastik kaldırarak insülin kalem (veya şırınga) yayın. Not: Herhangi bir ince iğne (Ø0.33 mm veya daha az) veya cam kılcal (genellikle Ø1 mm) mikroenjeksiyon10,11için hazırlıklı ol.</li>
	<li>İğneyi yarıya kadar cam microcapillary yerleştirin; hızlı ve yavaş bir gaz meşale kullanarak lehim.</li>
	<li>Cam microcapillary için microinjector bağlamak ve üç kez steril su ile yıkayın. Sıvı iğne akar emin olun.</li>
	<li>Sistem distile su ile doldurun. Not: sistemde hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.</li>
</ol>4. enjeksiyon
<ol><li>Microcapsules hazırlanan süspansiyon resuspend (steril % 0.9 NaCl veya diğer medya kullanılan 0.5 ila 6 milyon microcapsules microliter başına bir konsantrasyon ile enjeksiyonlar için) için 1 dk ultrasonik banyo kullanarak. Not: microcapsules, aşağıdaki enjeksiyon sırasında çökelti eğilimindedir bu yana şişeyi microcapsules ile mekanik sallamak (bir rotor kullanarak) veya el ile her birkaç dakikada onları resuspend ve onların toplama önlemek için.</li>
	<li>~ 2-3 için bir petri anestezi (0.1 mL/L karanfil yağı suya askıya) ile içine balık yer dk. kadar bekleyin balık yan döner ve fin hafif bir tutam yanıt vermiyor.</li>
	<li>Bir kaşık kullanarak, anestezi çıkmış balık aktarmak ve yavaşça (sağ elini kullanan kişi için) sola doğru veya (sol elli kişi için) sağa doğru kafa ile yanal bir konumda nemli bir sünger üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Sadece enjeksiyon önce 1-2 mm cam kılcal damar içine hava microinjector ile bağlı emmek. O zaman, dağınık microcapsules yaklaşık 2 µL ile yük. Not: enjeksiyon önce microcapsule çözüm hangi balık tutulur sıcaklık ayarlanması gerekir.</li>
	<li>Yavaşça sigara dominant el ile sünger balık gövdesini stabilize etmek.<ol>
<li>Sonradan içini kaplamak balık bulmak. Zihinsel genişleten bir kesimi operculum karın boşluğu sonuna kadar seçer. Bu segmentteki ortasını bulmak. İğne 1 mm daha düşük ventral yönde koymak.</li>
		<li>Kazıma bir hareketi, yavaşça balık bir kenara ölçekler ve bir delik yapmak hareket. Tablo yüzeye 45 ° açılı ve vücuda iğne yerleştirin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde buna karşı aittir kadar iğne omurga doğru itin.</li>
		<li>Microcapsules süspansiyon yaklaşık 1 µL böbrek bırakın ve yavaş yavaş iğne tutar. Not: uygun delik site bulmak için daha kolay, pratik Şekil 2A ve 2B'yigösterildiği gibi bir alt ışık kullanarak balıklar transilluminating tarafından gövde böbrek bulmak için yararlıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjeksiyon yerinde dökülmüş herhangi bir microcapsules kaldırmak için su akışı ile kuyruk başından balık durulayın.</li>
</ol>5. içinde Vivo görselleştirme
<ol><li>Balık baştan gill kapağını çıkarın ve balık solungaçları denude için diseksiyon makası kullanın. Solungaçları su ile durulayın.</li>
	<li>Bir kaşık kullanarak, balık mikroskop slayda aktarmak ve floresan mikroskop sahnesinde yerini. Not: balık solungaçları ardışık işlemler sırasında kurumasına olduğunu emin olun. Bunu önlemek için düzenli olarak onları nemlendirin su Pasteur pipet (yaklaşık her 1-2 dk) kullanarak.</li>
	<li>Odayı karartmak ve düşük büyütme (x 10 amaç) kullanarak floresan microcapsules bulmak için solungaçları inceleyin. Not: balık dolaşım sistemi içine bazı floresan parçacıkların giriş için yordam kullanıldığında, solungaçları, birkaç bireylerin enjeksiyonları önce beklenmedik floresan parçacıklar için incelemek için önerilir. Vahşi-türü zebra balığı solungaçları autofluorescence yok ama bazı durumlarda sporadik floresan parçacıklar (gıda parçaları veya tek hücreli simbiont) solungaçları üzerinde mevcut olabilir. Gerekli, bu tür parçacıklar belirli şekilleri göre kabul edilebilir eğer (örneğin, gıda adet düzensiz şekli, küresel microcapsules aksine var) veya floresan spektrum (Yani, renk).<ol>
<li>Objektifin daha yüksek bir büyüklük (× 40 amaç) geçin ve bir microcapsule veya microcapsules bir grup görüş alanı ortasına yerleştirin.</li>
		<li>Yandaki bağlantı noktasına bağlı bir Spektrometre ile açmak. Spektral sinyal kaydedebilir.</li>
		<li>Mercek için geri kolu çevirin.</li>
		<li>Ölçümler için farklı microcapsules birkaç kere tekrar edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Balık akvaryum kurtarma için uygun havalandırma ile aktarın. Not: en az uygulama ile enjeksiyon ve 2-3 dk balık başına yaklaşık bir oranda kayıt sinyal yapmak mümkündür. Ölçüm bir bireysel birkaç kez anestezi tekrarlanan zararsız, düşük doz veya başka bir yöntemi fiksasyon kullanımı ile tekrar edilebilir. Uzun vadeli gözlem için bir sistem ile sürekli anestezi12kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+and+microparticles+of+polymers+and+polysaccharides+to+administer+fish+vaccines.">Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines.</a> Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).</li><li>Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+polyelectrolyte+microcapsules+as+a+contrast+agent+for+photoacoustic+imaging+in+blood.">Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood.</a> J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).</li><li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish.">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).</li><li>Gurkov, A., Shchapova, &. #. 1. 0. 4. 5. ;., Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+stress+assessment+of+aquatic+animals+with+microencapsulated+biomarkers+for+environmental+monitoring.">Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring.</a> Sci. Rep. 6, e36427 (2016).</li><li>Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+in+vivo+monitoring+of+pH+in+gill+capillaries+and+muscles+of+fishes+using+microencapsulated+biomarkers.">Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers.</a> Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).</li><li>Diep, C. Q., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+cells+directly+into+the+kidney+of+adult+zebrafish.">Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).</li><li>Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+microcapsules+as+mobile+local+pH-sensors.">Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors.</a> J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).</li><li>Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+bio-markers+for+assessment+of+stress+conditions+in+aquatic+organisms+in+vivo.">Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo.</a> Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide - Version 1.44. , (2012).</li><li>Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+brain+microinjection+to+study+molecular+substrates+of+motivated+behavior.">Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior.</a> J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+serial+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+mouse.">A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).</li><li>Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+brain+of+intact+adult+zebrafish.">Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney.">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).</li><li>McKee, R. A., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+renal+pathology:+Emerging+models+of+acute+kidney+injury.">Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury.</a> Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).</li><li>Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., M&#246;hwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+hollow+polymer+shells+by+colloid-templated+assembly+of+polyelectrolytes.">Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).</li><li>Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., M&#246;hwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonate+microparticles+for+hollow+polyelectrolyte+capsules+fabrication.">Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication.</a> Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).</li><li>Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+biocompatible+polymer+microcapsules+with+near-infrared+emitting+nanocrystals.">Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals.</a> Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).</li><li>Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+encapsulation+via+porous+CaCO3+microparticles+templating.">Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).</li><li>Tzaneva, V., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Time+differential+staining+technique+coupled+with+full+bilateral+gill+denervation+to+study+ionocytes+in+fish.">A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish.</a> J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Microparticles enjeksiyon zebra balığı böbrek içine göstermek için yarı geçirgen microcapsules bir göstergesi boya ile yüklenen kullanılmıştır. Böylece, iletişim kuralı kullanarak katman katman derleme ters şarj edilmiş polyelectrolytes7,8,15,16,17 microcapsules imalatı için yönergeler içerir ,18 (Şekil 1A). Bu teknolojinin bir avantaj elde edilebilir Labaratuar donanımları ile gerçekleştirmek kolay olmasıdır. Koşullar ve kullanılan bileşikler bağlı olarak, uydurma microcapsules 0,5 nanometre kalınlığında Polielektrolit Kabuk15ile 100 µm değişebilir. Sentez parametreleri elastik microcapsules polimerler (yanı sıra son biyouyumlu kat) 12 kat oluşan bu el yazması sonucu yaklaşık 2-6 µm boyutunda (Şekil 1B ve 1 C) açıklanmıştır. Microcapsules boyutunu belirleyen en önemli adımdır şablon microcores oluşumu. Bu işlem kendiliğinden kalsiyum karbonat kristalleri oluşumu içerir ve bu nedenle, elde edilen parçacıklar üniform olmayan. Bu nedenle, microcapsule boyutu dağıtım karakterizasyonu her toplu işlem için yapılmalıdır.
Önemli bu protokol optimizasyon microparticles teslimat embriyolardan teknikleri kullanmaya gerek kalmadan zebra balığı dolaşım sistemine aşamasıdır. Retro-orbital iğne ile tüm hücreleri yönetimini daha önce detay3' te tanımlanmıştır. Ancak, deneyim, çünkü retro-orbital sinüs çok küçük ve farinks ve gill kemerler, yanlışlıkla bir iğne ile yaralama kolaydır yakındır yazarlar tarafından açıklanan enjeksiyon verimliliği elde etmek acemi kullanıcılar için kolay değil. Bir milimetre beri doğruluk gereklidir için enjeksiyon, düzgün enjekte oldukça zor bir iştir. Eşit hızlı ve daha verimli alternatif (Tablo 1) doğrudan balık böbrek parankimi enjekte etmektir. Enjeksiyon sırasında iğne mekanik böbrek kılcal damar ve kan damarları (Örneğin, en büyük posterior Kardinal ven), dolaşım sistemi (Şekil 2E) microparticles girişi sağlayan zarar veriyor. Son olarak, Yetişkin zebra balığı gövde böbrek merkezi şişlik büyük yeterli (ilâ 2 mm) için el ile bir enjeksiyon mikrocerrahi aletler olmadan.
Enjeksiyon iğne uygun konumlandırma başarılı bir el ile yönetilmesi için önemlidir. Alt ışık Şekil 2A ve 2B'yiiçinde gösterildiği gibi kullanarak transilluminating balıklar tarafından olduğu gibi hayvanlarda gövde böbrek bulmak pratik yapabilirsiniz. Şekil 2B düzeninde düzgün enjeksiyon gerçekleştirmek gösterilmiştir. Microparticles kan akışı içine yönetmek yordamı başarısız olursa, yeniden enjeksiyon bireylerin sağkalım oranı üzerinde neredeyse hiçbir etkisi ile bir kısa süre içerisinde aynı ponksiyon yapılabilir.
Yetişkin zebra balığı (de başarıyla test edilmiştir yetişkin guppy Poecilia reticulata) gövde böbrek içine enjeksiyon microparticle teslimat izin verilen bir hayvan mortalite ile balık kan dolaşımına etkili bir yöntemdir; Ancak, mükemmel enjekte birimi farklılığı nedeniyle ilaç idaresi için uygun değildir. Bu tekniğin bir zayıf nokta karın içine böbrek dışında çözümün önemli bir kaçak nedeniyle hızlı ilçedir. Yine de, kan dolaşımına enjekte maddenin göreli miktarı kabaca görselleştirme gill kılcal (Tablo 2) kullanarak tahmin edilebilir. Enjeksiyon biriminin katı sınır yoktur ama süspansiyon daha--dan 1 µL yönetim etkisiz gibi görünüyor. En iyi cam kılcal damarlar için Mikroenjeksiyon uygulanabilir; Ancak, çok sayıda microcapsules toplama teşvik eğilimindedir çünkü 31-29 G kullanımı önerilir (Ø 0,33-0,25 mm) çelik iğne iğne lümen takunya önlemek için.
Microcapsule teslim böbrek enjeksiyonuyla kan dolaşımına başarısı solungaçları floresan parçacıkları varlığı için hızlı denetim kullanılarak izlenmelidir. Solungaçları vivo gözlemler için kolayca erişilebilir organları vardır. Gill filamentler kan kılcal damarlar (bir çeşit doğal optik pencere) solungaçları geçici intravital görüntüleme kan akışı özellikle uygun solunum epitel ince bir tabaka ile kaplı bir şebekesidir. Gözlem yapmak için kıkırdak gill kapak filamentler ortaya çıkarmak için kesilebilir. Bu yordamı bir azalma yaşam beklentisi olmadan de Gazlı su denuded solungaçları ile yaşayabilir balık için güvenlidir. Ayrıca, büyük balık solungaçları mikroskop altında sadece operculum şekilde19dışına iterek incelenebilir. Başarılı bir enjeksiyon durumunda, floresan microparticles hemen solungaçları (Şekil 3) görüntülenir. Not implante microparticles önemli ölçüde dolaşımdaki kan hacmindeki çözülür ve parçacıklar azaltılmış bir dizi gill kılcal ulaşmak, böylece microparticles yeterli konsantrasyonu balık solungaçları sonra algılaması için seçilen Enjeksiyon içine balık böbrek (Tablo 2).
İmplantasyon için önerilen yordam küçük balıklar farklı türler ile ilgili çalışmalar geniş bir alanda uygulanabilir. Rağmen geliştirilmiş ve floresan microparticles enjeksiyon içine dolaşım sistemi için en iyi duruma getirilmiş tekniği, renkli mikro/nano tanecikleri implantasyonu için uygulanabilir veya çözünmüş maddeler; Ancak, bu durumda enjeksiyon verimliliğini başka bir şekilde doğrulanmış olmalıdır. Şu anda açıklanan adımları bu tür amaçlar için en iyi durumda gibi fizyolojik farklı optik mikro - veya nanosensors, damarlara görselleştirme, aşı ya da ilaç teslim bazı optik görünür taşıyıcıları ve implantasyonu kullanarak izleme Genetiği değiştirilmiş hücreler.

Mikro büyüklükteki parçacıklar yönetim hayvan bir organizma içine ilaç ve aşı teslim1, damarlara görselleştirme2, transgenik hücre implantasyonu3ve küçük optik sensör implantasyon gibi alanlarda önemli bir görevdir 4 , 5. ancak, implantasyon yordam microscale parçacıklar halinde küçük Laboratuvar hayvanlarının damar sistemi için özellikle hassas Sucul organizmalar için zordur. Zebra balığı gibi popüler araştırma numuneler için bu tavsiye edilir bu yordamları açıklık video protokollerini kullanarak.
İntrakardiyak ve kapiller microinjections'microobjects dır zebra balığı kana eğitimli personel ve benzersiz mikrocerrahi özellikleri gerektirir. Daha önce bir retro-orbital el ile enjeksiyon3 tüm hücreleri yönetim için kolay ve etkili bir yöntem olarak önerilmiştir. Ancak, deneyim, göz kılcal ağ küçük alanı nedeniyle bu teknik üzerinden istenilen sonucu elde etmek için çok pratik alır.
Burada, biz güçlü ve verimli microparticle implantasyon dolaşım sistemi içine için bir yöntem yetişkin zebra balığı, böbrek dokusunun içine doğrudan el ile enjeksiyonla kılcal damar ve böbrek damarlarının açısından zengin olduğu açıklanmaktadır. Bu teknik zebra balığı böbrek6içine hücre transplantasyonu için video protokolünü dayanır ama travmatik ve zaman alıcı mikrocerrahi adımları elendi. Önerilen yöntem tarafından düşük mortalite ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır.
Hangi enjeksiyon kalite, sayısı bir kaba göreli değerlendirme doğrulanmasına izin verir (floresan veya renkli olmaları durumunda) implant microparticles gill kılcal damarlar içinde görselleştirme önerilen protokol önemli bir parçası olduğunu enjekte parçacıklar ve dolaşımdaki kandan doğrudan fizyolojik ölçümler için spektral sinyal algılama. Açıklanan tekniği olası uygulamaları bir örnek olarak, biz SNARF-1, ilk olarak önerilen Borvinskaya bir microencapsulated floresan sonda kullanarak zebra balığı kan pH vivo ölçümleri için protokol göstermek ve ark. 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dextran, 70000 MW</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler</td></tr><tr><td>Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Fluorescent probe</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Fluorescent probe</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>Cationic polymer</td></tr><tr><td>Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Anionic polymer</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>To dissolve applied polymers</td></tr><tr><td>Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>To prepare deionized water</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Stegler</td><td></td><td>For CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus pipette, 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus pipette, 10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips, volume range 200 to 1000 &amp;micro;L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips, volume range 0.1-10&amp;nbsp;&amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed</td><td>BioSan</td><td></td><td>For microcapsule centrifugation-washing procedure</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Microcapsule synthesis and storage</td></tr><tr><td>Shaker Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>To reduce microcapsule aggregation</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td></td><td></td><td>To reduce microcapsule aggregation</td></tr><tr><td>Head phones&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>To protect ears from ultrasound</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>To dissolve the CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates</td></tr><tr><td>Monosodium phosphate</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>Preparation of pH buffers</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>Preparation of pH buffers</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>To adjust the pH of the EDTA solution and buffers</td></tr><tr><td>Thermostat chamber</td><td></td><td></td><td>To dry microcapsules on glass slide</td></tr><tr><td>Hemocytometer blood cell count chamber</td><td></td><td></td><td>To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>In vivo visualization of microcapsules in fish blood</td></tr><tr><td>Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Visualization of microcapsules with fluorescent probes</td></tr><tr><td>Fiber spectrometer QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 &amp;mu;m, 2 m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>To connect spectrometer with microscope port</td></tr><tr><td>Collimator F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>To connect spectrometer with microscope port</td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Coverslips, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Glass microcapillaries Intra MARK, 10 &amp;micro;L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>To collect fish blood</td></tr><tr><td>Clove oil</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Fish anesthesia</td></tr><tr><td>Lancet No 11</td><td>Apexmed international B.V.</td><td>P00588</td><td>To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector</td></tr><tr><td>Heparin, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection</td></tr><tr><td>Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>To determine fish blood pH</td></tr><tr><td>Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>For injection procedure. Any thin needle (&amp;Oslash; 0.33 mm or less) is appropriate</td></tr><tr><td>Glass capillaries, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&amp;auml;te GmbH &amp;amp; Co</td><td>9201075</td><td>For injection procedure</td></tr><tr><td>Gas torch</td><td></td><td></td><td>To solder steel needle to glass capillary</td></tr><tr><td>Microinjector IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>For precise dosing of microcapsules suspension</td></tr><tr><td>Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Plastic spoon</td><td></td><td></td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Damp sponge</td><td></td><td></td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>To remove the gill cover from the fish head</td></tr><tr><td>Pasteur pipette, 3.5 mL</td><td>BRAND</td><td>Z331767</td><td>To moisten fish gills</td></tr></tbody></table>

simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection

Canlı bir organizma içine mikro büyüklükteki parçacıkların yönetim sistemik damarlara görselleştirme, ilaç ve aşı teslim, transgenik hücreleri ve küçük optik sensörler implantasyonu için uygulanabilir. Ancak, biyolojik ve veteriner laboratuvarları çoğunlukla kullanılan, küçük hayvanların içine intravenöz microinjections çok zor ve eğitimli personel gerektirir. Burada, biz balık böbrek içine enjeksiyon tarafından microparticles giriş yetişkin zebra balığı (Danio rerio) dolaşım sistemi içine için sağlam ve verimli bir yöntem göstermek. Damarlara tanıtılan microparticles görselleştirmek için balık solungaçları basit bir intravital görüntüleme tekniği öneriyorum. Vivo zebra balığı kan pH kontrolü başarılı bir enjekte microencapsulated floresan kullanarak sonda, SNARF-1, açıklanan tekniği mümkün uygulamalarından birini göstermek için. Bu makalede pH duyarlı boya encapsulation ayrıntılı bir açıklamasını ve hızlı enjeksiyon prensipleri ve görselleştirme floresan sinyali VIVO içinde kayıt için elde edilen microcapsules gösterir. Enjeksiyon önerilen yöntemi düşük mortalite oranı ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır. Tüm açıklanan yordamları süs balıkları ve medaka gibi diğer küçük balık türleri üzerinde gerçekleştirilebilir.

Elde edilen sonuçları sunulan Protokolü üç ana kategoride birinden gelir: bir floresan boya (Şekil 1), microcapsules daha fazla görselleştirme ile böbrek enjeksiyon encapsulation tarafından floresan microparticles oluşumu Gill kılcal damarlar (Şekil 2 ve 3) ve pH seviyeleri (Şekil 4) kan son olarak, in vivo spektral kayıt SNARF-1 floresans izlemek için.
Kaplama boya birden çok katmanı tarafından karşılıklı iliştirilen şablonu CaCO3 çekirdek kullanarak katman katman yaklaşım polimerler (PAH ve PSS) kullanılıyorsa ve biyouyumlu polimer (PLL-g-PEG) en dış tabakası basit ve düşük maliyetli bir yöntemdir SNARF-1-dextran, FITC-BSA veya diğerleri (Şekil 1A) gibi farklı floresan problar kapsüllemek için izin. Sonuç olarak, içi boş microcapsules micrometric, istikrarlı yarı geçirgen elastik kabukları ile boyut ve floresan boya ile yüklendi (Şekil 1B) elde edilir. Bu tekniği ile fabrikasyon microcapsules genellikle düzgün olmayan, partikül boyutu ve karakteristik ortalama boyutu her yığında (Şekil 1С) normal dağılım ile.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57491/57491fig1.jpg"> Resim 1 : Katman katman malzemelerin ve içi boş Polielektrolit microcapsules floresan bir boya ile dolu. (A) düzeni (Gurkov ve ark. 20164' te yayınlanan benzer bir düzeni çizilmiş) microcapsules derleme. (B) içi boş microcapsules resmini floresan boya FITC-BSA ile dolu. (C) microcapsules Şekil 1Büzerinden toplu karakterizasyonu boyutu. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57491/57491fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
Dolaşım sistemi içine sağlam ve verimli microparticle implantasyonu küçük balıklar balık böbrek içine doğrudan el ile enjeksiyon tarafından gerçekleştirilebilir. Balık vücut (gövde böbrek) uygun sitedeki ponksiyon microparticles manuel iğne ile hızlı teslimat için önemlidir. Balık böbrek hematopoetik organ ve pigmente melanophores içerir ve bu nedenle de renklidir. Yüzme kesesi saydam odalar arasında nestled olduğunu çünkü zayıf pigmentasyon ile veya transillumination Şekil 2A ve 2B'yigösterildiği gibi alt ışık kaynağı kullanarak küçük balıklar tarafından olduğu gibi hayvan organ tanımlamak kolaydır.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57491/57491fig2.jpg"> Resim 2 : Böbrek enjeksiyon için doğru siteyi lokalizasyonu. (A) zebra balığı Trans ışıklandırması gövde böbrek (ok) lokalizasyonu gösterir. (B) düzeni uygun delik sitesini tanımlamak üzere verilmektedir. Beyaz noktalı çizgi sonradan içini kaplamak balıkların karın parçasının gösterir. Ok websitesi için iletilecek ponksiyon ve enjeksiyon omurga doğru düzgün yönünü gösterir. Yüzme kesesi yeşil hat tarafından atanır. Zebra balığı böbrek organlar ve vücut duvarın kaldırılması aşağıdaki (C) görselleştirme. Bir ok gövde böbrek merkezi şişlik için işaret eder. (D) yetişkin balıkların iç organları Genel anatomi D. rerio sagittal histolojik bölümünü gösterir (H & E leke). (E) test bir balık böbrek (noktalı) posterior Kardinal ven lümen için işaret bir ok ile (D) ölçekli. Yıldız yüzme kesesi gösterir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57491/57491fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Enjeksiyon yordamı başarısı denetlemek için hızlı bir görsel denetim solungaçları düşük büyütmede (x10-20 amaç) balık gill kapak (Şekil 3A) kesim sonrası yapılmalıdır. Enjeksiyon yerinde kalan veya vücut boşluğuna (Şekil 3B), dökülmesini microcapsules çoğunu rağmen enjeksiyon doğru gerçekleştirilirse, serbestçe yüzen gill kılcal damarlar floresan microcapsules gözlemlemek mümkündür Hemen enjeksiyon (Şekil 3 c) sonra denuded balık solungaçları. Solungaçları yok floresan parçacıklar algıladıysa, aynı ponksiyon enjeksiyon tekrar mümkündür. Kan dolaşımına başarılı teslim toplam enjekte balık yaklaşık % 70-90 alınmalıdır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57491/57491fig3.jpg"> Şekil 3 : Microcapsules daha fazla gill kılcal görselleştirme ile böbrek enjeksiyon. (A) microcapsule teslim zebra balığı kan dolaşımına genel düzeni. (B) bir zebra balığı (ponksiyon site bir okla gösterilen) yeşil FITC-BSA boya ile microcapsules enjeksiyon sonra floresan görüntü. (C) bu resmi (B), ölçekli balıkların solungaçları microcapsules başarılı teslimini böbrek iğne ile gösterir (vahşi tipi zebra balığı Solungaçlarım var hiç autofluorescence). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57491/57491fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
Balık gövde böbrek içine doğrudan enjeksiyon sırasında geniş normalde morarma ponksiyon site altında parankimi kılcal veya böbrek damarlarının zarar gösteren oluşturur. Hızlı bir şekilde sözleşme için delik görünür çünkü vücut dışında hiçbir kan sızıntı vardır. İç kanama rağmen bireylerin hala yaklaşık % 80-90 (Tablo 1) yordamında size hayatta kalmak ile kurtarabilirsiniz. Da bilinen balık türlerinin ın de novo yaralanma13,14sonrası yeniden oluşturabilirsiniz. Balık % 20'den fazla ölüyor, bir anesthetization düzgün yapılır emin olmalısınız.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Kapsüllenmiş floresan boya</td>
			<td rowspan="2">n</td>
			<td rowspan="2">Konsantrasyon, microcapsules başına µL</td>
			<td rowspan="2">Enjeksiyon hacmi, µL</td>
			<td rowspan="2">Microcapsules, µm ortalama çapı</td>
			<td rowspan="2">Balık kan dolaşımına, başarılı teslim %</td>
			<td colspan="2">Enjeksiyon sonra ölüm oranı %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 h</td>
			<td>1 gün</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">Gövde böbrek içine enjeksiyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>FITC-BSA</td>
			<td>36</td>
			<td>4 x 106
</td>
			<td>1.6</td>
			<td>2.7</td>
			<td>94</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>SNARF-1-dextran</td>
			<td>29</td>
			<td>3-6 x 105
</td>
			<td>1-2</td>
			<td>5.1</td>
			<td>72</td>
			<td>7</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>RITC-dextran</td>
			<td>20</td>
			<td>6 x 106
</td>
			<td>2</td>
			<td>2.0</td>
			<td>70</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 0,9 NaCl</td>
			<td>41</td>
			<td>-</td>
			<td>1-2</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">Retro-orbital ekleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>FITC-BSA</td>
			<td>9</td>
			<td>1 x 105
</td>
			<td>2</td>
			<td>4.2</td>
			<td>11</td>
			<td>22</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>RITC-dextran</td>
			<td>11</td>
			<td>6 x 106
</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>9</td>
			<td>18</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Güvenlik ve verimliliği microcapsules teslimat zebra balığı kan dolaşımına. Yordamı başarısı varlığı balık gill kılcal floresan malzemeler ile belirlenir.
Enjekte microparticles konsantrasyonu yeterli değilse, çok az parçacıklar hızla balık solungaçları görüntülenmeyecektir mevcut olabilir. Aynı zamanda, bir süspansiyon çok yüksek bir konsantrasyon ile iğne yapışmasına neden olabilir. Medyan çapı ~ 2-5 µm ile katman katman monte microcapsules durumunda yaklaşık 4 * 105-6 * 106 microcapsules µL başına bir konsantrasyon balık solungaçları zahmetsiz algılaması balık böbrek (tablo içine enjeksiyon sonra görüntülemek için 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Konsantrasyon, microcapsules başına µL</td>
			<td colspan="7">Bir mikroskop görüş alanı (× 20 amaç) solungaçları farklı bireylerin içinde microcapsules sayısı (n = 7 konsantrasyon başına)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x 106
</td>
			<td>> 100</td>
			<td>> 100</td>
			<td>0</td>
			<td>> 100</td>
			<td>≈ 70</td>
			<td>≈ 50</td>
			<td>> 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x 105
</td>
			<td>≈ 10</td>
			<td>≈ 20</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>≈ 20</td>
			<td>≈ 40</td>
			<td>≈ 15</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x 104
</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x 103
</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. Kayıt microcapsules FITC BSA içeren görsel sayma D. rerio solungaçları sonra enjeksiyon (1.6 µL) gövde böbrek içine.
Microparticles implantasyon balık dolaşım sistemi içine önerilen yöntem, zebra balığı kan pH vivo izlemek için mikroenkapsüle floresan sondası tarafından SNARF-1 (Şekil 4) uygulanabilir. SNARF-1 protonated ve deprotonated boya (4A rakam) emisyon için karşılık gelen iki zirveleri ile bir spektrum vardır, böylece farklı pH medya tepeler arasındaki oran eğrileri olabilir kalibrasyon (4B rakam) çizilen. Kan bileşenlerinin kapsüllenmiş SNARF-eşzamanlı kan pH ölçümü tarafından microcapsules ve pH-metre bir cam elektrot ile deneysel olarak değerlendirilebilecek 1 (Şekil 4B), okuma etkiler. Bir sözde kalibrasyon eğrisi microcapsules zebra balığı kan için deneysel olarak ölçülen pH farkı eşit katsayı tarafından arabellekleri eğrisi değişen tarafından çizilen (Borvinskaya ve ark. 20175 Ayrıntılar için bakınız).
Zebra balığı gill kılcal kan pH en az birkaç saat sonra microcapsules (Şekil 4 c) enjeksiyon sırasında sabit kalır. Aynı zamanda, bir kısa hypercapnic maruz kalma uygulanabilirliği üzerinde küçük balıklar vivo içinde araştırma yöntemi gösterir kan pH istatistiksel olarak anlamlı bir azalma yol açar.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57491/57491fig4.jpg"> Şekil 4 : Zebra balığı kan izleme temsilcisi örnek Kayıt mikroenkapsüle boya SNARF-1 floresans spectra ürününün tarafından рН. (A) hazırlanan microcapsules Spectra farklı pH sodyum fosfat arabelleklerindeki SNARF-1 ile dolu. (B) kalibrasyon eğrileri hazır pH duyarlı microcapsules sodyum fosfat tampon ve ayıklanan zebra balığı kan. Tüm ölçümler için Ortalama ± standart sapma tasvir edilir. (C) bir temsili örnek, zebra balığı gill kılcal kapsüllenmiş floresan SNARF-1 boya tarafından izleme vivo içinde zebra balığı kan рН. 5 dakika pozlama şiddetli hypercapnia (çözünmüş CO2900-1000 mg/L) altında asitleştirme balık kan neden olur iken kontrol koşullarda kan pH 4 saat sonra microcapsules, enjeksiyon sırasında sabit kalır. Yıldız işareti p < 0,01 (Mann-Whitney U testi) ile paralel kontrol grubundan istatistiksel olarak anlamlı fark gösterir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57491/57491fig4large.jpg">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection at JoVE.com

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

Bu makalede, floresan microparticles hızlı, minimal invaziv enjeksiyon circulatory system küçük balıklar ve balık kan microparticles in vivo görselleştirme içine prensipleri gösterilir.

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

simple-effective-administration-visualization-microparticles

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Görüntüleme.  Institute of Biology at Irkutsk State University. Bu makalede, floresan microparticles hızlı, minimal invaziv enjeksiyon circulatory system küçük balıklar ve balık kan microparticles in vivo görselleştirme içine prensipleri gösterilir.

Video: Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biyoloji

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Gelişim Biyolojisi

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Intramyocardial Injection for the Study of Cardiac Lymphatic Function in Zebrafish

Zebrafish have proved to be an important model for studying cardiovascular formation and function during postembryonic development and regeneration. The present protocol describes a method for injecting fluorescent tracers into the zebrafish myocardium to study interstitial fluid and debris uptake into cardiac lymphatic vessels. To do so, microspheres (200 nm diameter) and quantum dots (&#60;10 nm diameter) are introduced into the myocardium of live zebrafish, which can be tracked using ex vivo confocal microscopy. These tracers are then tracked intermittently over several hours to follow clearance from the myocardium into cardiac lymphatic vessels. Quantum dots&#160;are transported through cardiac lymphatic vessels away from the heart, while larger microspheres&#160;remain at the injection site for over three weeks. This method of intramyocardial injection can be extended to other uses, including the injection of encapsulated MS or hydrogels to locally release cells, proteins, or compounds of interest to a targeted region of the heart.

The present protocol allows efficient and stable delivery of fluorescent microspheres (MS) and quantum dots (QD) into the myocardium of live fish that can be tracked (traced) over time.

Zebrafish have proved to be an important model for studying cardiovascular formation and function during postembryonic development and regeneration. The ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Micropuncture tarafından 2 foton mikroskobu kolaylaştırdı farelerde Bowman'ın alanı

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic approaches, a rapid delivery of exogenous factors provides a complementary technique in functional studies. Here, we present a method that relies on administration of a few microliters of solution into the pericardial cavity without causing myocardial damage. Intrathoracic (IT) injections can efficiently deliver proteins and chemical compounds directly onto the heart surface. The injected substances diffuse through the epicardium into the underlying cardiac tissues. Compared to intraperitoneal (IP) injections, the main advantage of intrathoracic injections is the focal administration of the tested factors on the target organ. The delivery of molecules directly into the pericardium is a suitable strategy for studies of cardiac preconditioning and regeneration in adult zebrafish.

This method relies on the injection of 0.5&#8722;3 &#956;L of solution into the thorax of adult zebrafish. The procedure efficiently delivers proteins and chemical compounds into the proximity of the zebrafish heart without damaging the organ. The approach is suitable for testing effects of exogenous factors on various tissues of the heart.