Name: the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes at JoVE.com

Bu eser kısmen Nihon ilaç Üniversitesi Araştırma Bursu Nihon ilaç Üniversitesi (2016) ve MEXT KAKENHI Grant numarası JP17854179 tarafından desteklenmiştir.

Hayvan deneysel protokoller Nihon ilaç Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Nihon ilaç Üniversitesi kılavuzlarınıza uygun olarak yürüttü. Protokol doku özleri ICR fareler türetilmiş için ayarlandı. ICR fareler Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japonya) satın alınan
1. Iminobiotin etiketli substrat hazırlanması
9-fluorenylmethyloxycarbonyl grubu (Fmoc) kullanarak katı fazlı sentez substrat uğrar-11açıklandığı gibi amino asitler korumalı. Tablo 2 , istenen amino asit ve sentez aşamasına bağlı olarak kullanılan Fmoc bileşik belirlemek için kullanın.
<ol><li>Fmoc-NH-SAL reçine 0.2 g N, N-dimethylformamide (DMF) bir sentez sütunda 10 mL ile açgözlü.</li>
	<li>5 mL % 30 Piperodin DMF içinde ekleyin. Fmoc-grup ayırmak için 10 dakika için çözüm rock.</li>
	<li>
Kontrol Fmoc bölünme trinitrobenzenesulfonic asit (TNBS) ile test12: TNBS DMF ve diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 mm2 cam tüp sonra cam reçine az miktarda aktarmak için 10 µL eklemek 10 µL % 1'lik tüp. Fmoc i ciddi reçine turuncu renk geliştirmeniz gerekir.
	<ol>
<li>Bu sonuç olumsuz ise 1.2-1.3 adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reçine üç kez DMF 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>
5 mL Fmoc bahçedeki 0,3 mmol içeren DMF de tablo 2'de (Etap 1 kullanılan bileşik ile başlayan), O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 1-0,3 mmol 0,3 mmol listelenen Ekle Hidroksi-1H-benzotriazol, monohidrat (HOBt) ve diisopropylethylamine (DIPEA) 0.6 mmol. Reçine ile çift 30 dk için çözüm rock.
	<ol>
<li>Bu adım TNBS testi ile kontrol edin. Sonuç pozitif çıkarsa, bu tepki değil yeterince ilerlemiştir ve bu adımı tekrarlanması gerekir anlamına gelir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reçine üç kez DMF 5 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Uzama tepki adımları yineleyerek 1.2-1.6, değiştirme Tablo 2göre 1.5 adımda kullandığınız Fmoc bileşik yineleyin.</li>
	<li>% 2.5 su, 1 mL ekleyin %1 triisopropylsilane (TIS) ve % 2.5 ethanedithiol (EDT) trifluoroacetic asit peptidlerin reçine ve koruma grupları ayırmak için. Rock 60 dk için çözüm.</li>
	<li>Filtre ve filtrate 50 mL tüp içinde toplamak.</li>
	<li>40 mL soğuk dietil etanol ve mağaza gecede-20 ° C'de ekleyin</li>
	<li>-20 ° C'de 30 dakika süreyle santrifüj 4.000 x g Pelet toplamak.</li>
	<li>3 h için bir desiccator dietil eter kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>% 50 Asetonitril 1 mL su ekleyin ve ham peptidler geçiyoruz. Trifluoroacetic asit kaldırmak için çözüm lyophilize. Bu adımı birkaç kez yineleyin.</li>
	<li>
C18 kartuş sütun kullanarak peptidler arındırmak.
	<ol>
<li>3 mL Asetonitril (ACN) kullanarak C18 kartuş sütunundaki reçine etkinleştirin.</li>
		<li>5 mL %5 ACN, % 0,1 TFA H2O. ile equilibrate</li>
		<li>Ham sentetik peptidler C18 kartuş sütuna yerleştirin.</li>
		<li>10 mL %5 ACN, % 0,1 TFA H2o yıkayın</li>
		<li>%60 3 mL örnekleriyle elute ACN, % 0,1 TFA H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Peptidler MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanarak kendi moleküler ağırlığı ölçerek kontrol edin.
	<ol>
<li>Eluent bir hedef plaka üzerinde 1 µL pipet. Hemen % 0,1 trifluoroacetic asit % 50 Asetonitril doymuş α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) çözüm ekleyin</li>
		<li>Karışımı air-drying tarafından kristalize.</li>
		<li>Araç üreticisinin protokolüne göre örneklerin kitle spectra elde etmek.<ol>
<li>El ile ayarlamak için olumlu bir MALDI-TOF Kütle Spektrometre modu yansıtmak.</li>
			<li>CHCA kullanarak kütle spektrometre kalibre, bradikinin parçası 1-7 (monoisotopic molekül ağırlığı 756.3997 Da =) ve Anjiyotensin II (monoisotopic molekül ağırlığı 1,045.5423 Da =).</li>
			<li>Sentetik peptidler kitle spectra alacak ve kuramsal moleküler ağırlığı ile karşılaştırarak değerlendirmek.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. doku özleri hazırlanması
<ol><li>Erkek ICR fareler bir isoflurane inhalasyon odasında anestezi ve anestezi derinliği ayak tutam ile doğrulayın. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi.</li>
	<li>Makas kullanarak, cilt xiphoid süreci kadar uzanan aracılığıyla bir karın ensizyon olun.</li>
	<li>Diyafram kesin ve tüm akciğer doku toplamak. Doku küçük parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Doku buz gibi 50 mM Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (pH 7,4) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Doku ve bir 12 x 75 mm2 cam tüp 100 mg dokuların aktarmak tartın.</li>
	<li>Ayıklama arabellek (50 mM Tris-arabellek, % 0,1 poli (oxyethylene) octylphenyl eter içeren pH 7.4,) 0.3 mL ekleyin.</li>
	<li>
Bir karıştırma homogenizer kullanarak akciğer doku örnekleri lunaparkçı.
	<ol>
<li>Buz üzerinde örnekleri ne yapıyorsun?</li>
		<li>Örnekleri için 30 20.000 rpm'de homojenize bir karıştırıcıda s. Tamamen homojen olduğu kadar bu adımı yineleyin. Not: sıcaklık artışı önlemek amacıyla sürekli olarak daha fazla 1 dakikadır homojenize değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogenate 1000 µL 1,5 mL tüp ve santrifüj 10.000 x g 4 ° C'de, 5 min için transfer</li>
	<li>500 µL süpernatant ile yeni bir 1,5 mL plastik tüp aktarın.</li>
	<li>Örnek 10 µL protein konsantrasyonu, bicinchoninic asit (BCA) gibi yöntemler veya Coomassie parlak mavi (CBB) yöntemini kullanarak belirlemek için kullanın.</li>
	<li>Donma önlemek için örnekleri % 50 gliserol son bir konsantrasyon için % 80 gliserol ekleyin.</li>
	<li>-80 ° C'de örnekleri daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.</li>
</ol>3. sindirim yüzeylerde modeli proteaz ve doku ayıklar
<ol><li>
0.1 µg/µL N-tosyl-L-Fenilalanin chloromethyl keton (TPCK) 10 µL eklemek-tripsin, 0.1 µg/µL Staphylococcus aureus V8 proteaz veya 10 µg/µL doku özler bir sindirim arabellek 890 µL içine.
	<ol>
<li>Proteaz özgüllük bağlı olarak pH farkı açıklamak için pH 3, 5, 7 ve 9 ayarlanabilir arabelleklerini kullan. Sindirim arabellek bileşimi Tablo 3' te gösterilmiştir.</li>
		<li>Etkin olmayan proteaz doku özleri, 10 dakikadır kuluçka kaynar su (veya ısıtma 100 ° c) tarafından hazırlanan kullanarak bir negatif kontrol yerine getirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İminobiotin etiketli yüzeylerde 10 µL ekleyin (dimetil sülfoksit (DMSO), nihai toplama çözünmüş 100 pmol/10 µL =).</li>
	<li>37 ° C'de iminobiotin etiketli yüzeylerde sindirmek için 3 saat kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra yüzeylerde kaynar su ile (veya ısıtma 100 ° c) sindirim 10 dakikadır durdurmak.</li>
	<li>Sindirilir yüzeylerde, 10.000 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant yeni 1,5 mL tüp içine aktarın.</li>
</ol>4. Iminobiotin etiketli substrat saflaştırılması
<ol><li>
50 µL % 50 streptavidin sepharose boncuk 1 M Tris-tampon (pH 9) kapsayan %0,1 poly(oxyethylene) octylphenyl eter içinde ekleyin.
	<ol>
<li>Çözüm pH 9 olması için pH test kağıt kullanın. Çözüm pH düşükse, pH yaklaşık 9 1 M Tris-tampon (pH 9) kapsayan %0,1 poly(oxyethylene) octylphenyl eter ekleyerek ayarlayın. Bu adım önemlidir, iminobiotin etiketli substrat streptavidin için bağlama karıştırmak gibi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de sürekli nazik iminobiotin etiketli yüzeyler için streptavidin bağlamak için bir rotator tekerlek üzerinde karıştırma ile kuluçkaya. Boncuk kuluçka asılı kalması gerekir.</li>
	<li>10.000 x g 4 ° C'de, 1 dk santrifüj Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>
Boncuk aşağıdaki gibi beş kez yıkama:
	<ol>
<li>Bir yıkama arabellek (50 mM Tris-tampon, pH 9) 1.000 µL boncuk için ekleyin.</li>
		<li>4 ° C'de sürekli nazik bir rotator tekerlek üzerinde karıştırma ile 10 dakika yıkayın. Boncuk kuluçka asılı kalması gerekir.</li>
		<li>10.000 x g 4 ° c de 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
100 µL % 0,2 trifluoroacetic asit için boncuk ekleyin.
	<ol>
<li>Çözüm pH 2 olması için pH test kağıt kullanın. Çözüm pH yüksek ise, için pH 2 aşağıda %1 trifluoroacetic asit ekleyerek ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sürekli nazik bir rotator tekerlek üzerinde karıştırma ile Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>10.000 x g 4 ° c de 1 dk santrifüj kapasitesi, sonra yeni bir 1,5 mL tüp süpernatant transfer.</li>
</ol>5. örnek hazırlama ve matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma uçuş zaman kütle spektrometresi (MALDI-TOF Kütle spektrometresi)
Not: Aşağıdaki adımlarda tüm çözümleri ile yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) hazırlanmalıdır-sınıf veya amino asit sıralama-grade su.
<ol><li>Asetonitril etkinleştirmek için C18 reçine üzerine 500 µL pipet. Kullanılan Asetonitril kaldırın. Bu üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>C18 reçine 100 µL % 0,1 trifluoroacetic asit ile equilibrate. Eluent kaldırın. Bu üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Örnekleri yüklemek için bir pipet kullanarak reçine örnekleri bağlayın.</li>
	<li>Reçine 20 µL % 0,1 trifluoroacetic asit ile yıkayın. Bu beş kez tekrarlayın.</li>
	<li>Örnekleri 3 µL % 60 Asetonitril %0,1 trifluoroacetic asit ile elute. Eluent MALDI-TOF Kütle spektrometresi için hedef tabakta pipette. Hemen doymuş α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) çözüm % 50 Asetonitril %0,1 trifluoroacetic asit ekleyin.</li>
	<li>Karışımı air-drying tarafından kristalize.</li>
	<li>
Araç üreticisinin protokolüne göre örneklerin kitle spectra elde etmek.
	<ol>
<li>El ile ayarlamak için olumlu bir MALDI-TOF Kütle Spektrometre modu yansıtmak.</li>
		<li>CHCA kullanarak kütle spektrometre kalibre, bradikinin parçası 1-7 (monoisotopic molekül ağırlığı 756.3997 Da =) ve Anjiyotensin II (monoisotopic molekül ağırlığı 1,045.5423 Da =).</li>
		<li>Örnekleri yakın kitle spectra 700 üzerinden 900 savcıya biotin etiketli yüzeylerde cleaved form için dikkat, kitle spectra elde etmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tablo 1kullanarak algılanan doruklarına tanımlayın. Uygun moleküler ağırlık tespiti C-terminus ilgili amino asit, bölünme gösterir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+(a+review).">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li><li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein.">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li><li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases.">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li><li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin.">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li><li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li><li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer.">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li><li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo.">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li><li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics.">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li><li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates.">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li><li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin.">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+synthesis+of+a+tetrapeptide.">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li><li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2,4,6-trinitrobenzenesulphonic+acid.">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li><li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+NeutraLite+avidin:+A+non-glycosylated,+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties.">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li><li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography.">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Bu iletişim kuralı MALDI-TOF Kütle spektrometresi proteaz özgüllük doku özler elde edilen ham örneklerinde tanımlamak için kullanır ve kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli. Özellikle, pH substrat özgüllüğü bir değişiklik neden manipüle.
Yaygın Biyokimya onun bağlama özgüllüğü nedeniyle kullanılmıştır, avidin-biotin karmaşık (ABC) yöntemi, bizim iletişim kuralında kullanılmıştır. ABC güçlü yakınlığı nedeniyle, avidin biotin için bağ...

Proteaz proteinler fizyon tarafından fizyolojik süreçleri düzenleyen ve belirli zamanlarda ve yerlerde proteaz aktivitesinin başlangıcında düzenlenmiş1. Bu nedenle ifade ve yerel olarak düzenlenmiştir dokuların aktivite tanımlama ve proteaz algılamak için yeni bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Önerilen yöntem bu çalışma proteaz özgüllük proteaz tespit için paralel olarak tanımlamak amaçlamaktadır.
Proteaz özgüllük algılamak için bazı yöntemler vardır. Azocasein yönteminin kullanımı ile proteaz2 algılanması için iyi bilinen ama onun yetenek daha fazla bilgi almak için sınırlıdır. Zymography, proteaz3molekül ağırlığı belirlemek için kullanılan başka bir kapsamlı proteaz algılama yöntemi olmakla birlikte, substrat özgüllüğü incelemek için kullanılamaz. Proteaz özgüllük spektrometrik deneyleri, p-nitroanilide4gibi yüzeylerde kullanarak ve Fluorometrik deneyleri, coumarin yüzeylerde5 veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) deneyleri6kullanarak tarafından belirlenebilir. Bu yöntemler tek bir kuyuda bulunan yüzeylerde tek-özgüllük algılanmasını etkinleştirin. Bu özler birden çok proteaz içeren çalışmanın, doku özleri proteaz özgüllük çeşitli koşullar altında incelenir. Proteaz aktivitesi pH, koenzimler, prostetik gruplar ve iyon gücü de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından düzenlenmiştir. Son zamanlarda, proteomik tabanlı yöntemleri proteaz özgüllük tanımlamak için kullanılmıştır; Örneğin, Biniossek ve arktarafından bildirilen yöntemi. 7 Proteom substrat özgüllüğü bile içinde ham özleri belirlemek için kullanır ve birden çok amino asit dizileri8tanımak proteaz bölünme etkinliğinin doğru belirlenmesi sağlar. Ancak, bu yöntem çok sayıda örnekleri analiz için uygun değildir. Buna ek olarak, bizim Yöntem birden çok örneği aynı anda işleme ve kullanım Matrix-Assisted Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma sağlar saat uçuş (MALDI-TOF) örnek analiz için kütle spektrometresi i ciddi, hızlı ve kolay algılama kolaylaştırır yüzeylerde.
Bu kağıt proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçmek için MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak değerlendirmek için bir yöntem özetliyor. Onların kuramsal moleküler ağırlıkları birlikte i ciddi yüzeylerde moleküler formları Şekil 1 ve Tablo 1' de gösterilmiştir. Önceki çalışmalarda polyglycine çubukları ve biotin9içeren yüzeylerde kullanılan; Ancak, polyglycine sıra glisin sıra tanımak enzimler tarafından i ciddi çünkü bu yüzeylerde hatalı. Ayrıca, yüksek afinite avidin ve biotin arasında düşük kurtarma oranı için neden olabilir. Polietilen glikol (PEG), iminobiotin ve bölünme sitesi (Şekil 1) teşhis edebilecek bir amino asit oluşan benzersiz bir substrat sentezlenmiş Bu çalışmada bu sakıncaları üzerine geliştirmek için. Benzer moleküler ağırlık amino asitler arasında ayırımcılık için D-serin PEG spacer ve amino asit cleaved sitesinde arasında eklendi.
N-terminal substrat, benzeşim arıtma ham örneklerinden sağlayan iminobiotin ile etiketli oldu. İminobiotin yerine biotin kullanımı önemlidir; biotin avidin avidin için iminobiotin'ın ilgi pH tarafından değiştirilebilir iken hangi biotin etiketli yüzeylerde avidin reçine, düşük oranda düşük kurtarma sonuçlar ile güçlü bir ilgi vardır. İminobiotin etiketli yüzeylerde pH 4 aşağıdaki koşullarda avidin bültenleri iken Iminobiotin etiketli yüzeylerde avidin pH 9, yukarıdaki koşullarda bağlayacaksınız. Bu nedenle, iminobiotin benzeşme arıtma10için kullanıldı. Özetle, biz proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde kullanarak tespit için detaylı bir protokol tanımlamak.

<table><tbody><tr><td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)&lt;br/&gt;aminomethyl]phenoxy resin)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>piperidine</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)</td><td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triisopropylsilane (TIS)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethanedithiol (EDT)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18 cartridge column</td><td>Waters</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>poly(oxyethylene) octylphenyl ether</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>mixing homogenizer</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>polytron homogenizer</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td><td>Nakarai Chemical</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Nakarai Chemical</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF mass spectrometry</td><td>Bruker Daltonics, Germany</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-amino acids</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes

Proteaz protein harekete geçirmek/inactivation ve gıda sindirimi de dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyonları var. Proteaz özgüllük tanımlayan proteaz işlevi ifşa için önemlidir. Bu çalışmada önerilen yöntem matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kullanarak benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçerek proteaz özgüllüğü belirler saat uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi. Cleaved site amino asitleri oluşur ve boşluk Ekleyici Polietilen glikol oluşur yüzeylerde iminobiotin, içerir. Cleaved substrat cleaved bir amino asit kullanarak benzersiz bir moleküler ağırlığı oluşturur. Bu yöntem yararları bu ham numuneleri kullanılarak bir tencereye yürütülen ve aynı zamanda birden fazla örnekleri değerlendirmek için uygundur biridir. Bu makalede, biz basit bir deneysel Yöntem doku çıkarma, sindirim yüzeylerde yerleşimini farklı pH koşullarında sindirim yüzeylerde arıtma örnekleri, içine dahil olmak üzere fare akciğer dokusundan elde örnekleri ile optimize tarif ve yüzeylerde moleküler ağırlık MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak ölçümü. Özet olarak, bu teknik proteaz özgüllük ham örneklerinde kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak doku özleri elde tanımlanması için izin verir.

Proteaz özgüllük modeli proteaz tarafından tanımlanması için yöntem değerlendirilmesi
Bu sistemin verimliliği TPCK-tripsin ve V8 proteaz olan substrat özelliklerine elde edilmiştir, kullanılarak değerlendirilmiştir. TPCK-tripsin ve V8 proteaz amino asit dizisi lizin ve arginin kalıntılarının C terminalinde ve carboxy yanında aspartik asit ve glutamik asit kalıntıları eklenmesi, sırasıyla ayırmak için tahm...

Watch this Scientific Journal Video about The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes at JoVE.com

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

the-determination-protease-specificity-mouse-tissue-extracts-maldi

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.8K Görüntüleme.  Nihon Pharmaceutical University. Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.

Video: The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Biyokimya

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view of the impact of a disease, treatment, or other condition on the proteome as a whole. This report provides a detailed protocol for the extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, and subsequent data analysis of protein samples. Our optimized TMT labeling protocol requires a lower tag-label concentration and achieves consistently reliable data. We have used this protocol to evaluate protein expression profiles in a variety of mouse tissues (i.e., heart, skeletal muscle, and brain) as well as cells cultured in vitro. In addition, we demonstrate how to evaluate thousands of proteins from the resulting dataset.

We present an optimized tandem mass tag (TMT) labeling protocol that includes detailed information for each of the following steps: protein extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, submission to a proteomics facility, and data analyses.

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein phosphatases (PPPs) coordinate over 90% of all cellular serine/threonine dephosphorylation. Deregulation of protein phosphorylation has been implicated in the pathophysiology of various diseases, including cancer and neurodegeneration. Despite their widespread activity, the molecular mechanisms controlling PPPs and those controlled by PPPs are poorly characterized. Here, a proteomic approach termed phosphatase inhibitor beads and mass spectrometry (PIB-MS) is described to identify and quantify PPPs, their posttranslational modifications, and their interactors in as little as 12 h using any cell line or tissue. PIB-MS utilizes a non-selective PPP inhibitor, microcystin-LR (MCLR), immobilized on sepharose beads to capture and enrich endogenous PPPs and their associated proteins (termed the PPPome). This method does not require the exogenous expression of tagged versions of PPPs or the use of specific antibodies. PIB-MS offers an innovative way to study the evolutionarily conserved PPPs and expand our current understanding of dephosphorylation signaling.

Here, we present a protocol for the enrichment of endogenous phosphoprotein phosphatases and their interacting proteins from cells and tissues and their identification and quantification by mass spectrometry-based proteomics.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

Monoklonal Antikor İlaç Ürünlerinde Konak Hücre Proteinlerinin Zenginleştirilmesi

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks associated with drug products, methods have been developed to identify low-abundance HCPs. A crucial approach for developing a sensitive HCP detection method involves enriching HCPs while simultaneously removing monoclonal antibodies (mAbs) before analysis, utilizing liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
This protocol offers detailed instructions for enriching host cell proteins using commercially available proteome enrichment beads. These beads contain a diverse library of hexapeptide ligands with specific affinities for different proteins. The protocol also incorporates limited digestion and subsequent peptide detection using nano LC-MS/MS. By employing these techniques, HCPs with low abundance can be enriched over 7000-fold, resulting in an impressive detection limit as low as 0.002 ppm. Significantly, this protocol enables the detection of 850 HCPs with a high level of confidence using a NIST mAb. Moreover, it is designed to be user-friendly and includes a video demonstration to assist with its implementation. By following these steps, researchers can effectively enrich and detect HCPs, enhancing the sensitivity and accuracy of risk assessment for drug products.

Yazar Spotlight: Zenginleştirme Boncukları ve Sınırlı Sindirim Kullanarak İlaç Ürünlerinde Düşük Miktarda Konak Hücre Proteinlerinin Tespit Edilmesi 

A protocol is presented for enriching host cell proteins (HCPs) from drug products (DP) and detecting peptides using proteome enrichment beads. The method is demonstrated using an in-house manufactured monoclonal antibody (mAb) drug substance (DS), which is a well-characterized reference material for evaluating and comparing different methods in terms of performance.

Sınırlı Sindirim ile Birleştirilmiş Zenginleştirme Boncukları Kullanılarak Konak Hücre Protein Analizi

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

Kimya

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Biyoloji

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that transduce the mechanical energy of sound into an electro-chemical energy processed by the peripheral and central nervous systems. Several proteomic techniques have been developed to study the cochlear inner ear, such as two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), antibody microarray, and mass spectrometry (MS). MS is the most comprehensive and versatile tool in proteomics and in conjunction with separation methods can provide an in-depth proteome of biological samples. Separation methods combined with MS has the ability to enrich protein samples, detect low molecular weight and hydrophobic proteins, and identify low abundant proteins by reducing the proteome dynamic range. Different digestion strategies can be applied to whole lysate or to fractionated protein lysate to enhance peptide and protein sequence coverage. Utilization of different separation techniques, including strong cation exchange (SCX), reversed-phase (RP), and gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (GELFrEE) can be applied to reduce sample complexity prior to MS analysis for protein identification.

Proteome analysis of the cochlear sensory epithelium can be challenging due to its small size and because membrane proteins are difficult to isolate and identify. Both membrane and soluble proteins can be identified by combining multiple preparative methods and separation techniques along with high-resolution mass spectrometry.

Kapsamlı Cochlear Proteome tanımak için aşağıdan yukarıya ve Shotgun Proteomiks

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Sınırlı Sindirim ile Birleştirilmiş Zenginleştirme Boncukları Kullanılarak Konak Hücre Protein Analizi

Sınırlı Sindirim ile Birleştirilmiş Zenginleştirme Boncukları Kullanılarak Konak Hücre Protein Analizi

Sınırlı Sindirim ile Birleştirilmiş Zenginleştirme Boncukları Kullanılarak Konak Hücre Protein Analizi

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

Kapsamlı Cochlear Proteome tanımak için aşağıdan yukarıya ve Shotgun Proteomiks