Name: a microfluidic platform for longitudinal imaging in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Science Foundation durch Zuschüsse PHY-1205494 und MCB-1413134 (EL) und die National Research Foundation of Korea Grant 2017R1D1A1B03035671 (KSL).

Das Protokoll unten verwendet WormSpa5, ein zuvor beschriebenen mikrofluidischen Gerät für die longitudinale Bildgebung von Würmern. Herstellung von WormSpa (beginnend mit CAD-Dateien, die von den Autoren auf Anfrage erreicht werden können) ist einfach aber erfordert einiges an Fachwissen. In den meisten Fällen kann Fertigung ohne weiteres erfolgen, durch eine zentrale Anlage oder von einem gewerblichen Unternehmen, das solche Dienste bereitstellt. Wenn das Gerät herstellen, stellen Sie sicher, um anzugeben, dass die Höhe der Features 50 µm beträgt.
1. Versuchsaufbau
<ol><li>Montieren Sie das mikrofluidischen Gerät auf eine invertierte Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Stadium.</li>
	<li>Legen Sie einem Orbitalschüttler nahe dem Mikroskop, aber stellen Sie sicher, dass die Schwingung aus dem Shaker wirkt nicht direkt das Mikroskop. Legen Sie beispielsweise den Shaker auf einem Regal befestigt an der Wand, die keinen Kontakt mit der optischen Tisch macht.</li>
	<li>Die Orbitalschüttler eine Spritzenpumpe aufsetzen. Kleben Sie die Pumpe in den Shaker, damit es nicht beim Schütteln wackeln.</li>
</ol>2. Vorbereitung der mikrofluidischen Umgebung
Hinweis: Während des Experiments sind vier Spritzen mit mikrofluidischen Gerät per Spritze Röhren verbunden, wie in Abbildung 1dargestellt. Dieser Schritt beschreibt die Vorbereitung der diese Spritzen. Sofern nicht anders erwähnt, halten Sie die Spritze Röhren so kurz wie möglich ohne sie straff.
<ol><li>Bereiten Sie ein Outlet-Spritze und ein Rohr der Spritze. Diese Spritze (S1 in Abbildung 1) wird später an die Steckdose des Geräts durch das Rohr der Spritze angeschlossen und verwendet für die temporäre Speicherung von Flüssigkeit aus dem Gerät kommen.<ol>
<li>Machen Sie eine Adapter-Nadel durch Kunststoffteile ein 20 X 1/2 Zoll-Spritze-Tip, halten nur die Nadel (Metallteil) entfernen. Tun Sie dies durch den Kunststoff und Metall-Teile mit einer Zange halten und Auseinanderziehen. Verbleibenden kunststoffreste auf der Nadel kann mit dem Bunsenbrenner abgebrannt.</li>
		<li>Biegen Sie die Nadel nach der Geometrie des experimentellen Aufbaus während seiner beiden Enden mit einer Zange halten. In der hier beschriebenen Ausführung ist die Nadel in der Mitte in einem Winkel von ~ 110 ° Biegung am bequemsten.</li>
		<li>Stecken Sie die Adapter-Nadel auf halbem Weg in die Röhre. Die andere Hälfte wird später an das Gerät angeschlossen werden. Das Rohr der Spritze sollte mit 20 G Spritze Spitze ohne ein Leck (z. B. Schläuche mit Innendurchmesser von 0,86 mm und Außendurchmesser von 1,32 mm) kompatibel. Die empfohlene Länge ist ca. 50 cm.</li>
		<li>Verbinden Sie eine 10 mL Spritze mit Luer-Lock mit anderen (offenen) Ende der Spritze Röhre über einen 20 X 1/2 Zoll-Spritze-Tipp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Puffer-Einlass Spritzen vorbereiten und Spritze Röhren. Einer der diese Spritzen (S2 in Abbildung 1) dient als Reservoir für die Flüssigkeit, die in das Gerät und zur Steuerung der Einspritzung geht. Die andere Spritze (S3 in Abbildung 1) ist für Buffer Tausch erforderlich, wie in Schritt 3.2 erläutert.<ol>
<li>Eine 10 mL Spritze mit Luer-Lock (S2) direkt an ein 3-Wege-Ventil und schließen Sie eine andere Spritze (S3) an das gleiche Ventil über eine Spritze Schlauch (Abbildung 1): S3 mit dem Rohr über eine Spritze Tipp zu verbinden, und schließen Sie den Schlauch an das Ventil über eine andere Spritze Spitze. Hinweis: Die Reihenfolge, in der diese Materialien verbunden sind, spielt keine Rolle.</li>
		<li>Schließen Sie einen Spritze Schlauch an den verbliebenen Anschluss des 3-Wege-Ventil. Bereiten Sie einen anderen Adapter Nadel wie in Schritt 2.1.2, und stecken Sie die Nadel halbwegs in anderen (offenen) Ende der Spritze Röhre.</li>
		<li>Das Ventil so eingestellt, dass die Spritze Röhre im Schritt 2.2.2 und S2 verbunden sind, während S3 geschlossen ist (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine Wurm-Einlauf Spritze und eine Spritze Schlauch. Diese Spritze (S4 in Abbildung 1) dient der Würmer in das Gerät laden.<ol>
<li>Schließen Sie einen lange Spritze Schlauch an eine 10 mL Spritze mit Luer-Lock (S4). Bestimmen Sie die Länge des Rohres aus dem Volumen der Flüssigkeit, die zum Laden verwendet werden; 100 cm Rohr unterstützt z. B. mehr als 2 mL Flüssigkeit (auch, siehe Punkt 4.2).</li>
		<li>Bereiten Sie einen anderen Adapter Nadel wie in Schritt 2.1.2, und stecken Sie eine Hälfte der Nadel, um anderen (offenen) Ende der Spritze Röhre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen Sie die Spritzen und Schläuche mit S-Medium12 zweimal. Füllen Sie die Spritzen und die Rohre mit S-Mittel, kümmert sich um alle Luftblasen zu entfernen.</li>
	<li>Schließen Sie den Auslass Spritze Schlauch an das Gerät an.<ol>
<li>Stecken Sie die Adapter-Nadel am Ende der Spritze Schlauch zum Auslass.</li>
		<li>Ein kleines Volumen des S-Mediums durch den Auslass des Geräts zu füllen, bis ein wenig S-Medium aus dem Puffer Einlass und Wurm Einlauf kommt zu injizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schließen Sie den Puffer-Spritze Schlauch an der Puffer-Ansaugöffnung des Gerätes, beim Einstecken des Wurm-Einlass mit einem Stift (Edelstahl Dübel Pin mit einem 1/32-Zoll-Durchmesser).</li>
	<li>Injizieren Sie einen konstanten Strom von Puffer in das Gerät. Laden Sie die Puffer-Einlauf Spritze S2 auf eine Spritze Pumpe13, und die Pumpe so eingestellt, dass das Medium in S2 in das Gerät bei einer Durchflussmenge von 3 µL/min kontinuierlich eingespritzt wird.</li>
</ol>(3) laden Bakterien in mikrofluidischen Gerät
<ol><li>Bereiten Sie Escherichia coli OP50 in S-Medium12ausgesetzt.<ol>
<li>Im Anschluss an ein standard-Protokoll eine 250 mL Flasche mit 50 mL LB und eine einzige Kolonie zu impfen, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Nacht Kultur bei 4000 u/min für 10 Minuten und Aufschwemmen Sie das Pellet in 30 mL S-Medium.</li>
		<li>Filtern Sie die Aussetzung durch eine 5 µm-Spritze-Filter. Messen Sie die Bakterienkonzentration durch seine optische Dichte bei 600 nm (OD600), und passen Sie die Konzentration auf eine OD600 3. Diese hohe Dichte ist erforderlich, um die Würmer satt zu halten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tauschen Sie den Puffer in das Gerät mit dem OP50-Fahrwerk.<ol>
<li>Bereiten Sie eine saubere Spritze (S5) gefüllt mit dem OP50-Fahrwerk. Halten Sie die Spritze senkrecht und drücken Sie es mehrmals, um die Luftblasen an der Spitze zu sammeln.</li>
		<li>Drehen Sie das 3-Wege Ventil der Puffer-Einlass Spritzen, schließen Sie die Verbindung zum Gerät, und verbinden Sie die zwei Spritzen, S2 und S3. S2 aus der Spritzenpumpe zu lösen.</li>
		<li>Trennen Sie das Ventil S2 und schließen Sie S5 an das Ventil an. Drücken Sie die Luft an der Spitze der S5 S3 durchströmt werden gesammelt, bis ein wenig des Puffers OP50 in S3 geht. Stellen Sie auf diese Weise sicher, dass keine Luftblase in S5 oder das Ventil bleibt.</li>
		<li>Drehen Sie das 3-Wege-Ventil wieder in die ursprüngliche Position schließen die Verbindung zwischen S3 und S5 und S5 an das Gerät anschließen. Laden Sie S5 auf die Spritzenpumpe. Orbitalschüttler, das hält die Pumpe einschalten. Die schütteldrehzahl auf ca. 200 u/min einstellen</li>
		<li>Einstellen der Durchflussmenge 100 µL/min sein. Der Zeitaufwand für den neuen Puffer, um die Würmer in das Gerät zu erreichen hängt von der Länge der Puffer-Spritze Schlauch (ca. 5 Minuten mit dem oben beschriebenen Schlauch). Eine höhere Durchflussrate kann eingesetzt werden, wenn ein schneller Puffer Austausch erforderlich ist.</li>
		<li>Sobald die OP50 Puffer in das Gerät verbreitet, setzen Sie die Durchflussmenge auf 3 µL/min zurück.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Laden Würmer in mikrofluidischen Gerät
<ol><li>Bereiten Sie einen kleine geringe Bindung Microcentrifuge Schlauch (650 µL) und füllen Sie ihn mit 100 µL OP50 Aufhängung. Übertragen um 20-30 Jahren synchronisiert jungen Erwachsenen Würmer (46 Stunden post L1 Larven Verhaftung bei 25 ° C) von einer nährbodenplatte NGM (Nematoden Wachstumsmedium) am Rohr durch Abnehmen sie eins nach dem anderen mit einem Wurm zu wählen. Alter-Synchronisation kann nach einem Standardprotokoll12erfolgen.</li>
	<li>Füllen Sie den Wurm-Einlass Spritze und Spritze tube (S4 in Abbildung 1) mit dem OP50-Fahrwerk. ~ 500 µL der Flüssigkeit in den Microcentrifuge Schlauch mit Würmern zu injizieren. Ziehen Sie die Suspension mit Würmern in den Wurm-Spritze Schlauch. Stellen Sie sicher, dass die Spritze Schlauch lang genug ist (> 1 m) und dass gezeichnete Würmer in das Rohr der Spritze zu bleiben und nicht zu machen, ganz nach der Spritze S4.</li>
	<li>S4 mit dem Wurm-Einlass zu verbinden. Injizieren Sie die Würmer in die Wurm-Spritze Schlauch in mikrofluidischen Gerät. Trennen Sie S4 und das Rohr der Spritze. Stecken Sie den Wurm-Einlass mit einem Stift.</li>
	<li>Lösen Sie die Puffer-Einlauf Spritze S2 von der mechanischen Pumpe ( Abbildung 1) zu und manuell steuern Sie, S1 und S2, um die Würmer in getrennten Kanälen zu schieben. S2 drücken bewegt sich Würmer in die Kanäle, während S1 drücken sie in die entgegengesetzte Richtung bewegen. Sobald ein Kanal geladen ist, wird die Wurm in jedem Kanal den Eintrag Andere Würmer blockieren.</li>
	<li>Lassen Sie Würmer für ca. 2-3 Stunden an die neue Umgebung anpassen.</li>
</ol>(5) die Einrichtung eines Imaging-Protokoll
<ol><li>Finden Sie alle Würmer, die sicher im Gerät befinden, und legen Sie eine bildgebende Position für jeden von ihnen in der Bild-Datenerfassungs-Software, die Ihr Mikroskop kontrolliert. Beachten Sie, dass in einigen Fällen (z.B. bei höherer Vergrößerung gewünscht wird, oder bei Verwendung von Kameras mit einem kleineren CCD-Sensor) mehrere bildgebende Positionen sind erforderlich für jeden Kanal. Hinweis: Während dies manuell durchgeführt werden, können einige Softwarepakete Erwerb eine Text-Datei laden, in dem die Positionen aufgelistet, wo Bilder aufgenommen werden sollte. Da diese Positionen regelmäßig in WormSpa bestellt werden, kann ein Benutzer (z. B. in Python oder kommerzielle Software) ein kleines Skript schreiben, das automatisch eine solche Liste erstellt. Das genaue Format dieses Skript würde abhängen, das Dateiformat von Datenerfassungs-Software (siehe ein Beispiel in ergänzenden Material 1) erwartet.</li>
	<li>Stellen Sie die erforderliche Frequenz der Zeitraffer Bildgebung. Beispielsweise erfolgt die Bildgebung immun gen Reaktion auf die Infektion mit einer Frequenz von 10 Minuten pro Frame. Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Kanäle (z. B. Hellfeld und die GFP-Fluoreszenz) zu jedem Zeitpunkt erworben werden.</li>
</ol>6. Wirtsantwort, Pseudomonas-Infektion
Hinweis: Dieser Schritt ist spezifisch für Wirt-Pathogen Interaktionen zu studieren. Alternativ kann man einen Puffer vorbereiten, der andere ökologische Hinweise von Interesse (biotische und abiotische Stressoren, Drogen, Signalisierung Moleküle, etc.) enthält.
<ol><li>Bereiten Sie Pseudomonas Aeruginosa PA14 ausgesetzt in SK-Medium14 vor.<ol>
<li>Eine 250 mL Flasche mit 50 mL LB und eine einzige Kolonie zu impfen, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Eine weitere 250 mL Flasche mit 50 mL LB und ein Aliquot der Kultur zu impfen, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Nacht Kultur bei 4000 u/min für 10 Minuten und Aufschwemmen Sie das Pellet in 10 mL SK-Medium. Messen der Bakterienkonzentration und passen Sie die Konzentration auf OD600 = 4.</li>
		<li>Die Aussetzung in eine saubere Flasche und Inkubation bei 37 ° C für 24 Stunden und bei 25 ° C für weitere 24 Stunden unter schütteln. Dieser Schritt ahmt die Platte inkubationsschritt in der Norm Assay14zu töten.</li>
		<li>Filtern Sie die Aussetzung durch eine 5 µm-Spritze-Filter. Dies soll verhindern, dass bakterielle Aggregate verstopfen des Geräts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ersetzen Sie die OP50 Suspension in das Gerät mit der PA14-Aussetzung, nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.2. Halten Sie imaging für 10 Stunden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+gene+expression+to+changing+environments:+from+rapid+responses+to+evolutionary+adaptation.">Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).</li><li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+gene+expression+in+response+to+stress.">Controlling gene expression in response to stress.</a> Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+Streamlining+discovery+in+worm+biology.">Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology.</a> Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues.">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li><li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+Responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Grisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+spectroscopy+of+single+sub-nL+ova+with+inductive+ultra-compact+single-chip+probes.">NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes.</a> Sci Rep. 7, 44670 (2017).</li><li>Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping,+imaging,+and+screening+of+multicellular+organisms.">Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms.</a> Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).</li><li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans.">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).</li><li>Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HandKAchip+-+Hands-free+killing+assay+on+a+chip.">HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip.</a> Sci Rep. 6, 35862 (2016).</li><li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin-dependent+kinetics+of+feeding+bursts+underlie+a+graded+response+to+food+availability+in+C.+elegans.">Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans.</a> Nat Commun. 8, 14221 (2017).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , (2017).</li><li>Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Caenorhabditis+elegans+by+Pseudomonas+aeruginosa+used+to+model+mammalian+bacterial+pathogenesis.">Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans.">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+I.+Wild-type+growth+and+reproduction.">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).</li><li>Chalancon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+gene+expression+noise+and+regulatory+network+architecture.">Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture.</a> Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).</li><li>Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+gene+expression.">Regulation of noise in gene expression.</a> Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).</li><li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Switching+of+Cell+Fate+in+Microbes.">Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).</li><li>Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+genetic+networks+and+identifying+compound+mode+of+action+via+expression+profiling.">Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling.</a> Science. 301 (5629), 102-105 (2003).</li><li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants.">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li><li>Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malate+and+Fumarate+Extend+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).</li><li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , (1997).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+method+for+automatically+measuring+pharyngeal+pumping+in+C.+elegans.">A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans.</a> J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mikrofluidische Tools bieten mehrere Vorteile bei der Untersuchung von Würmern. Bildgebung in einem PDMS bietet Gerät höhere Bildqualität im Vergleich zu einer standard NGM-Agar-Platte. Mehrere Bilder können ein einziger Wurm, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden entnommen werden, in denen Tiere abgeholt von der Platte und montiert auf einen Objektträger für die Bildgebung. Darüber hinaus kann der Mikroumgebung, in denen Würmer befinden sich, konstant oder modulierte wie gewünscht, erlaubt präzise Zuordnung zwischen der Zusammensetzung der Umwelt und die Reaktion der Tiere gehalten werden.
Hier haben wir gezeigt, wie eine longitudinale Messung der Wirtsantwort für bakterielle Infektionen durch bildgebende Antwort mehrere einzelne Würmer, die opportunistischen Erreger p. Aeruginosa PA14 mit einem benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät (WormSpa) durchführen. Hellfeld und Fluoreszenz Bilder wurden auf mehrere Male ohne laufende Experiment sind. Insbesondere die Kinetik der Eiablage und der Irg-1 -gen-Expression wurden alle 10 Minuten eine deutliche Zunahme der zeitlichen Auflösung über traditionelle Methoden14,15sondiert.
In diesem Gerät können longitudinale Messungen von mehreren Würmern durch eine Überprüfung der gespeicherten Position jeder Wurm zu einem bestimmten Zeitpunkt durchgeführt werden. Dies zeigte sich in den Figuren 2C und 3 b, wo wir der Irg-1 quantifizieren:: GFP Fluoreszenz und den Eiern gelegt durch einzelne Würmer. Diese Zahlen zeigen, dass Würmer breite Palette von kinetischen Profile angezeigt. Wie zuvor in einzellige Studien19,20,21dargestellt diese Individualität lässt sich das Design der genetischen Schaltungen sowie die Korrelation zwischen unterschiedlichen Wege19, zu verstehen 22.
Für erfolgreiche Experimente ist es wichtig, die Würmer in mikrofluidischen Gerät schnell zu laden. Während Würmer auf Agar-Oberfläche zu kriechen, sie neigen dazu, in flüssiger Umgebung thrash, und dieses Verhalten induziert ein genetisches Programm in dem AMP aktiviert Proteinkinasen beteiligten23,24 sind. Um diese unerwünschte Störung zu minimieren, ist es wichtig, dass Würmer in ihre getrennten Kammern schnell, da die Mikrostrukturen in der Kammer und die Luftdurchlässigkeit des PDMS Würmer mit einer Umgebung bieten, die feste Oberfläche imitiert. 5 obwohl höhere Druck laden Würmer schneller hilft, könnte das Gerät zuviel Druck mechanischen Belastung auf die Würmer induzieren. Würmer, die stark beansprucht werden tun nicht füttere oder Laie Eiern, wodurch eine deutlich wahrnehmbare Absacken Phänotyp25. Nach dem Laden werden Würmer E. Coli OP50 gefüttert, für ca. 2-3 Stunden, so dass die Würmer der mikrofluidischen Umwelt anpassen und Bereitstellung des Forschers die Möglichkeit, die Tiere zu beobachten und entsorgen Sie diejenigen, die beschädigt wurden.
Die Größe und den Abstand von Mikrostrukturen in jeder Kammer sind optimiert für die Würmer gewachsen für 46 Stunden von L1 Verhaftung bei 25 ° C. Die Strukturen können skaliert, um ältere Würmer zu studieren oder verkleinert und um L4-Larven zu untersuchen, die kleiner sind. Würmer sind jedoch nicht in der Lage, erfolgreich in der Kammer mausern Studie der Post-Embryonalentwicklung in diesem Gerät entgegensteht. Für solche Anwendungen können Methoden wie WorMotel26 berücksichtigt werden. Da Würmer sind beschränkt, aber nicht in WormSpa immobilisiert, abhängig ein dauerhaftes erfolgreiches Experiment ob die Tiere in der Kammer bleiben. Wir finden, dass dies eine Herausforderung für Frühphasen-Larven, für männliche Erwachsene und für einige zwittrigen Mutanten sein.
Anstatt einer einzigen Puffer-Bucht (in der Mitte des oberen, Abbildung 1), die zwei kopfüber ballonförmigen Eingänge gleichzeitig nutzbar. Die zwei Spritzen mit verschiedenen Puffer füllen, kann man zeitlich strukturierte Umgebungen erzeugen, indem auf verschiedene Spritzen zu anderen Zeitpunkt. Dies ermöglicht beispielsweise Studie der Anpassung an sich verändernde Umwelt. 27 , 28
Wie oben erwähnt, kann die hier beschriebene mikrofluidischen Geräte für eine Vielzahl von anderen Anwendungen verwendet werden. Dazu gehören Antworten auf andere ökologische Hinweise zu studieren. Solche Reaktionen können sind Veränderungen in der Genexpression und Eiablage Verhaltensweisen, wie hier, sondern auch Veränderungen im Stoffwechsel und Fett Ansammlung (z. B. durch Fett durch Nil rote Färbung), neuronale Physiologie und Signalisierung (z. B. durch Calcium Imaging und optogenetische Störungen), Veränderungen der motorischen Verhaltensweisen wie Pumpen, Stuhlgang und Kopf Bewegung (über automatisierte quantitative Bildgebung von Zeitraffer-Sequenzen) und mehr.
Schließlich, dieser Ansatz ist weitgehend automatisiert und reduziert den Arbeitsaufwand für lange Experimente über viele Stunden, sogar Tage. Nachdem die Standorte der einzelnen Würmer in der Datenerfassungs-Software gespeichert sind, besteht das Experiment der automatischen Aufnahme von Bildern während die mechanischen Pumpensteuerung den ständigen Wandel der Puffer in das Gerät pflegt. Wichtiger ist, Herstellung eines WormSpa Gerätes erfordert nicht mehr als standard weichen Lithographie-Protokoll und das Design und die Bedienung sind einfach genug, selbst zu Forschern ohne Vorkenntnisse in Mikrofluidik. Mit den verschiedenen oben genannten Vorteile und relativ einfache Vorbereitungsschritte kann dieser Ansatz hilfreich für diejenigen, die erwägen, longitudinale Messung von live Worms unter genau kontrollierten Bedingungen.

Veränderungen der Umweltbedingungen führen zu einer Aktivierung des genetischen Programme, die begleitet von Induktion und Unterdrückung der Expression bestimmter Gene1,2. Diese kinetische Änderungen möglicherweise Variable unter Gewebe in den gleichen Tieren und zwischen den verschiedenen Tieren. Studien über solche genetische Programme fordern daher Methoden, die ermöglichen längs-Bildgebung einzelner Tiere und dynamische Kontrolle der Umweltbedingungen.
In den letzten Jahren wurden Microfabricated fluidischen Geräten verwendet, um viele Aspekte der Reaktion und Verhalten bei kleinen Tieren, darunter Würmer, fliegen, Bärtierchen und weitere3,4,5,6zu studieren, 7. Anwendungen sind zum Beispiel Tiefe Phänotypisierung, optogenetische Aufzeichnung von neuronaler Aktivität in Reaktion auf chemische Reize und Nachverfolgung der motorischen Verhaltensweisen wie Fortbewegung und Pumpen8,9,10 , 11.
Mikrofluidik-basierte Ansätze halten viele Eigenschaften, die langfristige längs Bildgebung der Reaktion auf ökologische Hinweise, einschließlich präzise dynamische Steuerung der lokalen Mikroumgebung, flexibles Design, das ermöglicht die Aufrechterhaltung der profitieren könnten einzelne Tiere in getrennten Bereichen und günstige Eigenschaften für die Bildgebung. Pflege Tiere in einer mikrofluidischen Kammer für eine lange Zeit mit minimalen negativen Auswirkungen auf ihre gut Wesen ist jedoch eine Herausforderung, die besonderen Sorgfalt bei der Gestaltung von mikrofluidischen Gerät sowie bei der Durchführung des Experiments erfordert.
Hier zeigen wir die Verwendung von WormSpa, einem mikrofluidischen Gerät für die longitudinale Bildgebung von Caenorhabditis Elegans. 5 einzelne Würmer beschränken sich in Kammern. Niedrige Zufuhr von Flüssigkeit und bakterielle Federung gewährleistet, dass Würmer sind gut gefüttert und ausreichend aktiv zur Erhaltung guten Gesundheits und Stress zu lindern, und die Struktur der Kammern Würmer Eier legen. Die Einfachheit der Konstruktion und Betrieb von WormSpa sollte Forscher ohne Vorkenntnisse Mikrofluidik, dieses Gerät in ihre eigenen Forschungsvorhaben zu integrieren ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>WormSpa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.</td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>An inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>SCI Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0.034&amp;rdquo; (0.86 mm) I.D. x 0.052&amp;rdquo; (1.32 mm) O.D</td></tr><tr><td>Syringe Tip</td><td>CMLsupply</td><td>901-20-050</td><td>20 Gauge x 1/2&amp;rdquo; blunt tip stainless steel canula</td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>PALL</td><td>4650</td><td>Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Qosina</td><td>C3307</td><td>10 mL Male Luer Lock Syringe</td></tr><tr><td>3 Way Valve</td><td>ColeParmer</td><td>FF-30600-23</td><td>Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile</td></tr><tr><td>Dowel Pin</td><td>McMaster-Carr</td><td>90145A317</td><td>18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32&quot; Dia. x 1/2&quot; Lg.)</td></tr><tr><td>Low Binding Microcentrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>CL S3206</td><td>0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube</td></tr></tbody></table>

a microfluidic platform for longitudinal imaging in caenorhabditis elegans

In den letzten zehn Jahren mikrofluidischen Techniken angewendet wurden, um kleine Tiere, einschließlich der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans, zu studieren und haben sich bewährt als praktisch live imaging Plattform bietet Funktionen für präzise Steuerung der experimentellen Bedingungen in Echtzeit. In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmern beschäftigt WormSpa, ein zuvor veröffentlichten benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht. Um die Funktion zu veranschaulichen, haben wir Proof of Principle Experimenten, in denen Würmer im Gerät mit pathogenen Keimen infiziert wurden, und die Dynamik des Ausdrucks der Immunantwort Gene und Eiablage wurden in einzelnen kontinuierlich überwacht Tiere. Einfache Planung und Betrieb dieses Gerätes machen es für Benutzer ohne Vorkenntnisse mit mikrofluidischen basierenden Experimente geeignet. Wir schlagen vor, dass dieser Ansatz nützlich für viele Forscher in Längsrichtung Beobachtungen biologischer Prozesse unter genau definierten Bedingungen interessiert sind.

Alter-synchronisierte jungen Erwachsenen Würmer (46 Stunden Post L1 Larven Verhaftung bei 25 ° C)12 wurden in das Gerät geladen, wie im Protokoll beschrieben. Die Würmer befanden sich einzeln in separaten Kanälen ermöglichen längs der Tiere als Reaktion auf den Erreger zu messen. Wenn der Versuch erfolgreich ist, bleiben die meisten Würmer in ihren Kanälen für die Dauer des Experiments. In diesem Fall sind Bilder von einzelnen Würmer genommen, einfach indem man ihren Kanal in der Bildgebung Weg, vermeidet die Notwendigkeit, das Tier aktiv zu suchen. Abbildung 2 A zeigt die Hellfeld Bilder von einem einzigen repräsentativen Wurm im Laufe von 10 Stunden im Gerät. Während Würmer innerhalb ihrer Kanäle beschränkt sind, können sie bewegen up- und downstream, und ihre Köpfe frei drehen können. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Gerät selbst nicht Stress verursachen oder die Tiere zu Schaden.
Wir überwachen Antwort von Würmern für bakterielle Infektionen durch p. Aeruginosa, einer der am besten untersuchten bakterielle Erreger von C. Elegans. Es ist auch eine opportunistische menschlicher Erreger die Infektion bei Mukoviszidose und immungeschwächten Patienten verursacht. Würmer mit bestimmten Stämmen von p. Aeruginosa, Fütterung, wie z. B. der klinischen PA14, führt zu tödlichen Darminfektion zu isolieren und die Virulenzfaktoren in diesen Prozess einbezogen sind auch die Infektion der Säugetier-Wirte verwickelt. 14 , 15
Um das Muster der Veränderungen in der Genexpression während der bakteriellen Infektion zu untersuchen, können fluoreszierende Reporter eingesetzt werden. Unter vielen Genen, die dynamische Reaktion auf eine Infektion anzeigen, wir überwacht die transcriptional Antwort der Irg-1 (Infektion Antwort Gen 1), durch bildgebende GFP Fluoreszenz von transgenen Würmer mit dem Ausdruck Irg-1::GFP (AU0133 [agIs17 () Pirg-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], gewonnen aus dem Ausubel Labor). IRG-1 ist bekanntermaßen stark im Darm der infizierten Tiere in der Frühphase der Infektion durch p. Aeruginosa PA14 induziert werden. 16 , 17 Abbildung 2 B zeigt Zeit Zeitraffer Bilder eines repräsentativen Wurms (das gleiche Tier wie in Abbildung 2A). Jede fluoreszenzbild wurde unmittelbar nach dem entsprechenden Hellfeld Bild übernommen. In den ersten 5 Stunden Post Infektion GFP Fluoreszenz nur leicht erhöht in der Mitte Körper und das Heck. Dann wird ein erheblicher Anstieg der Fluoreszenz beobachtet, ausgehend von der Mitte Körper. Die gesamte Fluoreszenz in jeder Wurm ist in Abbildung 2C als Funktion der Zeit Post Infektion aufgetragen. Diese Daten zeigen nicht nur die zuvor beschriebenen Induktion der Irg-1 auf PA14 Infektion, sondern auch die Wurm-Wurm Variabilität in den Zeitpunkt und Umfang der Induktion.
Das Design des Geräts WormSpa mikrofluidischen beinhaltet Filter die Eiablage durch jeden einzelnen Wurm5sammeln. Sobald schlüpfen, sind die L1-Larven durch den Filter und in den Auslass-Schlauch gewaschen. Dies erlaubt uns, die Eiablage Kinetik der einzelnen Würmer manuell während der bakteriellen Infektion zu überwachen. Die Zeit Zeitraffer Bilder von der Eiablage durch den gleichen Wurm wie in Abbildung 2 sind in Abbildung 3gezeigt. Diese Bilder wurden direkt nach der entsprechenden Hellfeld Bilder in Abbildung 2A. Die kumulative Anzahl der Eiablage durch jeden Wurm ist als Funktion der Zeit Post Infektion in Abbildung 3B, und der Mittelwert und die Standardabweichung über die gesamte Bevölkerung sind in Abbildung 3Cangezeigt. Diese Daten erfassen die Variabilität von Tier zu Tier, als auch der zuvor beschriebenen Rückgang der Eiablage als Infektion fortschreitet. Im Gegensatz dazu Posten Peaks bei ~ 54 Stunden bei nicht infizierten Tieren, die Eiablage Rate nicht bis es ablehnen wird L1 bei 25 ° C5,18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57348/57348fig1.jpg"> Abbildung 1: experimentelle Schema live Imaging von Würmern in einem mikrofluidischen Gerät. Würmer sind in das Gerät über den Wurm Einlassgeladen und werden anschließend in getrennten Kanälen geschoben. Bakteriensuspension wird in das Gerät vom Puffer Einlass durch eine mechanische Pumpe montiert auf einem Orbitalschüttler injiziert. Der Puffer wird beendet durch den Auslass des Gerätes. Vier Spritzen (S1, S2/S5, S3 und S4) werden verwendet, um das Gerät zu betreiben. Die roten gestrichelten Linien sind Spritze Röhren Spritzen und das Gerät verbindet. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57348/57348fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57348/57348fig2.jpg"> Abbildung 2: Vertreters Gen Ausdruck Kinetik. Zeitraffer Bilder eines repräsentativen Wurms getroffenen Bright-Feld (A) und (B) GLP-Fluoreszenz-Mikroskopie. Die am weitesten links stehende Bilder wurden aufgenommen, kurz bevor der Erreger eingeführt wurde, während die am weitesten rechts stehende Bilder aufgenommen wurden 10 Stunden nach Infektion durch PA14. Der zeitliche Abstand zwischen den Bildern beträgt 1 Stunde. (C) den zeitlichen Verlauf des gesamten Irg-1:: GFP Fluoreszenz in einzelne Würmer. Jede Zeile entspricht ein einziges Tier. Zeilen wurden in absteigender Reihenfolge der mittlere Fluoreszenz sortiert. Fluoreszenzintensität ist farbcodiert und die Farbskala wird auf der rechten Seite angezeigt. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57348/57348fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57348/57348fig3.jpg"> Abbildung 3: repräsentative eierlegende Kinetik. (A) Time Lapse Bilder von der Anzahl der Eiablage durch den gleichen Wurm, dargestellt in Abbildung 2A und B. Die am weitesten links stehende Bilder wurden aufgenommen, kurz bevor der Erreger eingeführt wurde, während die am weitesten rechts stehende Bilder aufgenommen wurden 10 Stunden nach Infektion durch PA14. Der zeitliche Abstand zwischen den Bildern beträgt 1 Stunde. (B) den zeitlichen Verlauf der kumulierte Anzahl von Eiern in einzelne Würmer. Jede Zeile entspricht ein einziges Tier. Zeilen wurden in absteigender Reihenfolge von der Gesamtzahl der Eiablage pro Wurm sortiert. Die Anzahl der Eizellen ist farbcodiert und die Farbskala wird auf der rechten Seite angezeigt. (C) die durchschnittliche Anzahl Eier pro Wurm als Funktion der Zeit gelegt. Der graue Bereich zeigt eine ± Standardabweichung. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57348/57348fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplementary Material 1" src="/files/ftp_upload/57348/57348supfig.jpg"> Ergänzende Material 1: ein Beispielskript, das erstellt eine Textdatei mit den bildgebenden Positionen für alle Kanäle in WormSpa Gerät. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57348/Supp1.EditZeissTiles.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmer mit einem benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht.

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

6.4K Aufrufe.  Kongju National University. In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmer mit einem benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht.

Serie: A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Forschung

Biotechnik

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Entwicklungsbiologie

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Neurowissenschaften

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biologie

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Verwendung von einem Mikrofluidik-Gerät für mechanische Stimulation und High Resolution Imaging von C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Langzeitkultur einzelner Caenorhabditis elegans auf festen Medien für longitudinales Fluoreszenzmonitoring und aversive Interventionen

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

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Einfache mikrofluidischen Systemen für

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von