Name: retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice
Uploaded: 2018-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice at JoVE.com

Teknik destek için Robert Graffin ve Pauline Duhant için sana şükrediyoruz.

Deneysel protokol Avrupa Toplulukları Konsey direktifleri ile uyumlu hayvan için (2010/63/AB, 86/609/EEC ve 87-848/EEC) yapılan ve hayvan Etik Komitesi, üniversite Namur tarafından (etik proje n ° 17-284 kabul edildi ). Şekil 1 gösterir iki ilgili yaklaşımlar: transdiaphragmatic veya Transtorasik iğne. Erkek C57bl/6J fareler kullanın (n = 18), 4 ay çalışma 3 yaşında.
1. CTB çözüm hazırlanması
<ol><li>Transdiaphragmatic enjeksiyon için:<ol>
<li>%0,2 (w/v) konsantrasyonu için steril su CTB iktidarda geçiyoruz.</li>
		<li>CTB çözüm (% 0,2 w/v) 7.5 µL bir steril 10-µL-microsyringe içinde her fare için ekli bir 33'lik iğne (künt veya kısa konik) yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transtorasik enjeksiyon için:<ol>
<li>Steril su konsantrasyonu % 0.1 (w/v) CTB iktidarda geçiyoruz.</li>
		<li>CTB çözüm (% 0,1 w/v) steril bir 500-µl-insülin şırınga 20 µL eğimli 27 lik bir iğne her fare için yükleyin. Not: distile ve steril su kullanmaya dikkat edin ve düzgün CTB toz geçiyoruz. Çözüm 4 ° C'de bir ay tutulabilir (değil dondurma). Birkaç gün sonra bir çökelti şeklinde. Çözüm oda sıcaklığına getirmek ve iyi bir pipet kullanmadan önce kullanarak karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intrapleural enjeksiyonu öncesinde hazırlık
<ol><li>Otoklav veya cam boncuk Sterilizatör kullanarak ameliyat öncesi cerrahi .aletleri sterilize. Bir temiz tezgah kat ameliyatı yapmak ve cerrahi araçlar imha etmek hazırlamak. Not: cerrahi işlem sırasında kullanılan herhangi bir malzeme steril olmalıdır. Microsyringe bir dezenfektan (klorheksidin) silmiş ya da olması gerektiği gibi sterilize cant araçlar tek sadece kullanımı. Cerrah ameliyat başlamadan önce bir dezenfektan (klorheksidin bodur) ile onu/onun ellerini yıkamalısın. Cerrah steril eldiven, bir sağlamlılık ve temiz bir elbise giymek gerekir.</li>
	<li>Hayvan tartmak ve anestezi uygun bir doz: anestezi kokteyl mayi enjeksiyon (örneğin ketamin 100 mg/kg ve xylazine 5 mg/kg).</li>
	<li>Ayak çimdik ve/veya fare düzgün anestezi olup olmadığını belirlemek için palpebral refleks kaybı için kontrol edin. Kornea korumak için bir veteriner merhem uygulamak.</li>
	<li>Dikkatle ventral cilt (için transdiaphragmatic yordam) veya elektrikli saç kesme makineleri kullanarak sağ taraflı göğüs cilde (Transtorasik yordam), tıraş. İyi ve yeterince geniş saç cerrahisi alanına alma önlemek için tıraş.</li>
	<li>Aseptik koşullar traş alan üzerinde % 10 iyot çözümün topikal uygulama tarafından emin olun. Cerrahi sitesi çevre doğru sitesinin Merkezi'nden fırçalayın için dikkatli olmak iyot solüsyonu ile fırçalayın.</li>
	<li>Hayvanın vücut ısısını korumak için ameliyat homeothermic takımını kullanın.</li>
</ol>3. Intrapleural Transdiaphragmatic yaklaşımı kullanarak enjeksiyonları
<ol><li>Bir Isıtma yastığı sırtüstü pozisyonda imzalat fare yatırmak. Hayvan boyun altında bir haddelenmiş gazlı bez yastık yerleştirin. Yetişkin bir fare için bir haddelenmiş gazlı bez takımını 0,5 inç kalınlığında kullanın. Hareket varsa önlemek için ameliyat yönetim kurulu bu yastık teyp.</li>
	<li>Bir neşter bıçak kullanarak deşmek orta çizgi boyunca ventral Cilt: deri gerin için yanal diğer el ile cilt germe sırasında xiphoid işleminden göbek bölgesine bir kesi yapmak. Çok fazla baskı üzerinde bıçak temel organlara zarar görmesini önlemek için geçerli değildir.</li>
	<li>Küçük makas kullanırken, dikkatle cilt kesi çevresinde karın kasları bağlantısını kesin. Bu yordam, kasları ve ameliyat sonunda ayrı deri dikiş yardımcı olur.</li>
	<li>Laparotomi küçük makas kullanarak gerçekleştirin. Karın boşluğu bir ilik kesi abdomenden düzeyde gerçekleştirerek açın. Beyaz hattı boyunca karın kasları deşmek ("linea alba") xiphoid süreci kadar.</li>
	<li>Diyafram karın yüzeyine görselleştirmek için karın kasları ticari veya ev yapımı traktör kullanarak geri çek. Not: Bu makaralara MIDI-boyut ataç L-kanca19şeklinde yapılabilir.</li>
	<li>Laparotomi ve bantlar makaralara tezgah kat için aşağı her iki uzatmayayeltenmişti. Görüş alanı aydınlatma diyafram karın yüzeyine penumbra içinde daha fazla en iyi duruma. Bu amaçla en güçlü aydınlatma aygıtının yönlendirilebilir bir ışık demeti ile LED Lamba vardır.</li>
	<li>Yumuşak cımbız bir elinde kullanarak, xyphoid ek kaldırın ve karaciğer (şekil 2A) yan lobları çekin. Diğer elinde küçük makas kullanırken dikkatle kesin suspensory bağ safra kesesi veya diyafram (şekil 2B) zarar vermeden.</li>
	<li>Yumuşak cımbız bir elinde kullanarak, xyphoid ek kaldır. Öte yandan Hamilton şırıngada kavramak. Üç siteleri değil hemidiyafram sırasıyla sternal, kapsayacak şekilde yerleştirmeye medial ve krural bölgeler (şekil 3A,) şekil 3B' iç metin hedef.</li>
	<li>Diyafram kalınlığı 0.37 mm fareler7civarında, iğne en fazla 1 veya 2 mm ötesinde sırasında nefes akciğer zararları önlemek için diyafram sayfası eklemek. 2.5 µL CTB çözüm (% 0,2 w/v), her sitede (şekil 4B) doğru diyafram aracılığıyla teslim. Diyafram istikrar gerekli değildir.</li>
	<li>Üç Ipsilateral siteleri enjeksiyon (şekil 1A) ve contralaterally bir ikili PhMN havuzu etiketleme için bu yordamı yineleyin.</li>
	<li>Laparotomi sitesini kapatmak için 4-0 dikiş karın kasları ile tekrar Emilebilen dikiş. Kesintiye uğramış dikiş 3 mm. tarafından elyaf cilt aralıklı kullanım 9.0 mm yara klipleri ile kapalı. Zımba zımba çekerek hayvan önlemek için sıkın. Alanı yaklaşık 5 mm ayrı zımba. Bu Engelli şifa için açabilir gibi yara klipler, aşırı sıkın değil.</li>
	<li>Temiz mikro şırınga tıkanma distile su ile. Yavaş yavaş çizme ve sınırdışı 2 - 3 kez. Hava şırınga çekiyor mu.</li>
</ol>4. Intrapleural Transtorasik yaklaşımı kullanarak enjeksiyon
Not: Bu yöntem fareler4 ' te açıklanan yordamı gelen ilham ve fare için uyarlanmıştır.
<ol><li>İmzalat fareyi sol yanal dekübitus getirin, bir Isıtma yastığı (şekil 4A) yatırmak.</li>
	<li>Altıncı ve yedinci kaburga dirsek bölgesi altında el ile palpasyonla (şekil 4B) tanımlayın.</li>
	<li>Asistan sağ ön ve arka bacaklarda (şekil 5A) genişletir iken, şırınga cranially odaklı ve yüzeysel altıncı veya yedinci kaburga, 3 mm derin (şekil 1B ve şekil 5B) aşağı eğim ile deri altında yerleştirin.</li>
	<li>Yavaşça, kaburgaları kaldırarak bu iyi göğüs boşluğuna (şekil 5C, insets içinde şekil 1B) içine konumlandırılmış onaylamak için iğne yükseltmek.</li>
	<li>Göğüs duvarı üzerinde iki parmak ile hafif basınç uygulayarak göğüs hareketleri nefes stabilize etmek.</li>
	<li>Şırınga diğer elinde tutarak, tek bir enjeksiyon CTB çözüm (% 0,1 w/v) 20 µL teslim.</li>
</ol>5. ameliyat sonrası bakım
<ol><li>İşlemden sonra hemen, fareyi sağ yanal dekübitus pozisyonda kurtarma için homeothermic bir yastık üzerinde yatıyordu. Bu plevral boşluğu sağ tarafta yayıldı izleme sağlar ve hayvanın nefes izlenmesi için izin verir.</li>
	<li>1 mL steril serum fizyolojik çözüm ı.p. subkutan yönetmek. Hayvan susuz ve/veya ilgisiz görüntülenirse takip enjeksiyon sağlar.</li>
	<li>Subkutan 0.1 mg/kg buprenorfin, yönetmek herhangi bir potansiyel ağrı en aza indirmek için ilk iki gün sonrası ameliyat sırasında günde iki kez. Not: Birçok kurum multimodal analjezi burada tasvir laparotomi gibi invaziv prosedürler için tavsiye ederim. Bu bir non-steroid anti-enflamatuar (NSAİİ) ilaç ve/veya lokal anestezik Ajan kesi yerinde kullanımı içerebilir. Bu ilaçlar genellikle kurmalı ağrı en aza indirmek için belgili tanımlık ilk kesme önce teslim edilir.</li>
	<li>Hayvanlar her gün ötenazi kadar izlemek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan protokol yetişkin fareler herhangi bir zorlanma veya diyafram-PhMN devresi bütünlüğünü değerlendirilmelidir deneysel herhangi bir paradigma için uygulanabilir. Örneğin, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve servikal Medulla Spinalis Yaralanmalarında (CSCI) PhMN kaybı, frenik akson ve sonraki solunum uzlaşma anterograd dejenerasyonu ile ilişkilendirilmiş koşullardır. ALS veya CSCI hayvan modelleri insan hastalıkları gözlenen histopatolojik ve fonksiyonel solunum açıkları taklit. Bu modellerinde, histolojik teknikler genellikle PhMN hayatta kalma şu PhMN neuroprotection18,20,21, yönelik çeşitli tedavi müdahaleler değerlendirmek için uygulanır. Herhangi bir sorun alımı, NMJ diyafram veya aksonal transport şüphesiz CTB nöronal hücre gövdelerinde birikmiş miktarını tehlikeye sokacaktır. Frenik aksonlar veya PhMN dejenerasyon kaybı belli ki omurilik CTB retrotransported miktarını azaltacaktır.
Her bir yaklaşım intrapleural idarenin kendi artıları ve inşaat Transdiaphragmatic enjeksiyonları laparotomi ve dikkatli yırtılması ve organ çıkıntı önlemek için tüm deri katmanları dikiş gerektiren oldukça invaziv vardır. Laparotomi ile normal solunum22 engelleyen ve bir PhMN aktivite veya retro-aktarım verimliliği etkileyebilir göz ardı edemeyiz. Ancak, diyafram doğrudan görselleştirme enjeksiyon sırasında başarılı plevral boşluğu her zaman hedefleme sağlar. Transtorasik iğne transdiaphragmatic enjeksiyonu için göre minimal invaziv ve böylece bir prosedür olarak arıtma için "Üç Rs" kavramı ven düşünülebilir. Bir dezavantajı olma artış olasılığı kapalı-hedef bir deneyimsiz kullanıcı için (örneğin subkutan doku veya göğüs duvarı).
İntrapleural floresan CTB yönetim herhangi bir motor nöron plevral boşluğu astar kaslar projelendirme, PhMN, interkostal motor nöronlar veya beyin sapı motor nöronların farklı topluluklarda da dahil olmak üzere etiketi olur ki olasıdır. De yetişkin, fareler, Mantilla vd. interkostal motor nöronlar da torasik spinal kord yanı sıra bazı dorsal kök gangliyon nöronlar4ventral boynuz etiketli gösterdi. Biz asla CTB etiketli hücreleri servikal spinal kord farelerde daha diğer sitelerdeki varlığı kontrol ettirin.
Bağlı olarak deneysel ayarları/modeller, sonuç ölçümleri PhMNs sütunlu yerleşimi boyunca servikal spinal kord, geometrik veri her PhMN konumu hakkında ayrıntılı çözümlemesi içerebilir veya, burada, PhMN miktar olarak açıklanan numarası. Toplam PhMN sayısı doğru değerlendirilmesi teknik konuları ve arası değerlendirici güvenilirlik bağlıdır; CTB floresan yoğunluğu, nöron soma boyutu veya arka plan boyama değişkenlik nedeniyle. Transdiaphragmatic enjeksiyonu CTB-fluorophore kullanarak deneyim, biz fare hemicord 120 ve 180 hücreler, biraz daha az veri diğer grupları8daha bir dizi arasında bir aralıktaki başına PhMN sayısı tahmini. Gerçekten de, çalışmanın iki sınırlamalar vardır. İlk olarak, sınırlı sayıda hayvan, Transtorasik yaklaşımı kullanarak enjekte edilir ve ikinci bir belirsizlik PhMN havuzu tam etiketleme var. (Sonra sinir transeksiyon) frenik sinir daldırma veya floresan nöroanatomik izleyici ile intraneural enjeksiyonları tüm PhMNs daha doğru bir şekilde etiketlemek için kullanılan tamamlayıcı teknikler vardır. Gelecekteki çalışmaları için bu PhMNs saymak için stereology gibi tarafsız yöntemler tarafından tavsiye edilir.
Deneyim, biz asla herhangi bir bariz solunum eksikliği ya da karışıklık (solunum) kanama veya aşağıdaki yordamı pnömotoraks gibi gözlemledim. Ancak, diyafram transdiaphragmatic enjeksiyon sırasında zarar görmüş bir iğne daha küçük çaplı veya daha net eğim ile kullanmaya dikkat edin.
Hayvan ölüm sırasında veya ameliyat sonrası önlemek için dikkatli kokteyl anestezi her bileşenin konsantrasyonları kontrol. Karaciğer, bağırsak, safra kesesi veya diyafram yüzeylerin üzerine yaralanmaları yapmaktan kaçının.
Hayır ya da düşük PhMN etiketleme çeşitli sorunları nedeniyle olabilir. Transtorasik enjeksiyon plevral boşluğu kaçırırsa, yeniden yapmak ve kontrol tarafından el ile palpasyonla iğne kaburga altında eklenir veya yok dışarı deri yoluyla açılır. Hava kabarcığı yok CTB çözüm enjeksiyon oluşturmalıdır. Ayrıca sinir hücresindeki CTB içselleştirilmesi pH bağımlı23olan hatırlıyorum: asidik ve nötr pH en uygun temel pH toksin alımını azaltır iken. Bu CTB tozu su, tuz veya PBS arabellek resuspend için tavsiye edilir. Sebat sürenin nöronal hücre vücuttaki etiketli toksini. Deneyim, bir zaman penceresi dört gün ve iki hafta sonra intrapleural teslim arasındaki hücrelerde CTB etiketli tespit olabilir. Taşıma retrograd için ayrılan süreyi kısaltır veya zaman intrapleural teslimat ve kurban arasındaki artan floresan-CTB doku optimal algılama tehlikeye atabilir.
Önlemek için solma Floresans uygun sabitleştirici yöntemini kullanın. Biz hayvanın vücut tamponlu %4 paraformaldehyde ile Ventriküler öneririz. Bir kez omurilik hasat edilir, aynı sabitleştirici gecede kuluçkaya. Cryoprotect kablosu batan kadar 72 saat boyunca Sükroz % 30 çözümde sonra O.C.T. orta servikal büyütme (yaklaşık 8 mm) gömün. Kurutmak veya örnek parafin içinde gömmek değil. Omurilik örnekleri veya doku bölümleri ışıktan bütün sonrası işleme sırasında koruma. Sabit bütün spinal kordonlar saklamadığını 4 ° C'de aylardır thimerosal cryoprotectant çözüme eklenir mı (floresan solma tahrik edecek gibi sodyum azid eklemeyin). Doku bölümler-20 ° C'de ay ışıktan uzak tutulabilir. Son olarak, bir anti-solma reaktif slaytlarla takmak için tavsiye ederiz. Floresans soluk olan ise, immünhistokimya kullanarak CTB algılamak mümkün.

Çalışmanın amacı frenik motor nöronlar (PhMN) fare omurilik bölümlerinde tanımlamak için güvenilir bir yöntem sunmaktır. Bir floresan nöroanatomik izleyici plevral boşluğunda enjeksiyon frenik akson boyunca retrograd taşıma frenik hücre organları etiketlemek için kullanın ve frenik nöromüsküler projeksiyonlar üzerine diyafram ulaşmak için Teslimat yöntemi olarak seçildi. İntrapleural teslimat iki teknikleri açıklanmıştır: Transtorasik karşı transdiaphragmatic.
Frenik motor nöronlar olan akson sonuçta diyafram innervate frenik sinir yakınsama spinal geçiş hücrelerdir. Bu alt motor nöronlar inspiratory sürücü dan bulber solunum merkezlerinin alma ve diyafram sinir-kas kavşak (NMJ) geçişi vardır. PhMN içine iki motor sütun, bir Servikal Omurga çalışan her hemicord için yapılandırılmış. Memeli tür insanlar dahil çoğunda, frenik motor sütunları C3 düzeylerinden C61,2,3' e yaymak. Biz ve diğerleri PhMN C3-C5 düzeylerinde fare ve fare omurilik4,5,6,7,8yoğunlaşmıştır doğruladı. Topografik dağıtım frenik hücre değil rastgele; motor nöronlar krural bölümü innerve daha Kaudal (C5)9ise motor nöronlar diyafram göğüs parçası innerve daha yoğun frenik tamirhanede (C3), kafatası parçası olarak dağıtılır. Ayrıca, PhMN kümelenmiş değişik ventral boynuz bu gri konuda. C3 düzeyinde frenik hücre kümeleri yanal yalan, daha sonra ventrolateral bir yönde kayması ve en Kaudal düzeyleri10,,11ventromedially bulunur.
Kendi hayati rol ilham sırasında göz önüne alındığında, bu doğru bir şekilde PhMN sağlıklı omurilik tanımlamak ama Ayrıca dejeneratif hastalıklar veya omurilik travmatik yaralanmalar gibi patolojik koşulları sırasında kendi kaderini takip için son derece önemlidir. Beri morfolojik servikal diğer motorlu neurons PhMN farklı değildir, PhMN tanımlaması nöroanatomik izleyicileri ya düzeyinde birincil solunum merkezleri8, ya da diyafram NMJ7 ya da hedeflenen teslimini kullanır frenik sinir4. İzleyici sinir lifleri tarafından alınan ve Servikal Omurga frenik hücre gövdelerinde kadar yapılan doğrudan veya dolaylı tespit sistemleri kullanarak görüntülenmeyecektir nerede. Retrograd veya anterograd izleyiciler ticari geniş conjugates bir ile mevcuttur. Önemli, her izleyici no ile donatılmış olan trans sinaptik izleme için düşük veya yüksek yetenekleri.
Mevcut çalışmada, Alexa Fluor (bundan böyle CTB-fluorophore da adlandırılır) 555 ile functionalized kolera toksini (CTB) beta altünitesi floresan bir etiket olarak PhMN donmuş omurilik bölümlerinde doğrudan bir görselleştirme izin seçtik. Deneysel verilerin bir transneuronal geçit12göstermek eğiliminde olmasına rağmen CTB genellikle monosynaptic bir izleyici tanımlanır. CTB GM1 gangliosid sinir biten plazma zarı bağlamak için yeteneğine sahiptir. CTB clathrin bağımlı - bağımsız mekanizmaları ve trans-Golgi ağ üzerinden trafik üzerinden bir retrograd moda13,14endoplazmik retikulum içine içselleştirilmiş. İçselleştirilmesi ve retrograd taşıma bağımlı aktin sitoiskeleti15,16 yanı sıra Mikrotubul ağ17gibi görünüyor.
CTB kullanışlılığı diyafram-PhMN devresi etiketleme retrograd nöroanatomik izleme aygıtı olarak göstermek CTB-fluorophore intrapleurally teslim edildi. CTB yönetilen iki teknikleri kullanarak: İlki dahil laparatomi ve birden çok transdiaphragmatic iğneleri; İkincisi, daha az invazif bir benzersiz Transtorasik iğne kullanılır. Dört gün sonra fluorescently etiketli PhMNs servikal spinal kord her iki sağlıklı ve spinally yaralı (C4) hayvanlardan sayılabilir.

<table><tbody><tr><td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td><td>Keller</td><td>31-101</td><td></td></tr><tr><td>Small scissors</td><td>F.S.T.</td><td>14058-00</td><td></td></tr><tr><td>Soft tweezers</td><td>F.S.T.</td><td>11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>Swann Morton</td><td>No.11 or 15</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>C22843</td><td>Bring at room temperature before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>701RN</td><td></td></tr><tr><td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td><td>Filter Service</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td><td>Terumo</td><td>BS05M2713</td><td></td></tr><tr><td>Orientable LED lamp</td><td>V.W.R.</td><td>631-0995</td><td></td></tr><tr><td>Resorbable 4/0 sutures</td><td>S.M.I. AG</td><td>15151519</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>F.S.T.</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>9mm autoclips</td><td>Bioseb</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip 9mm applier</td><td>Bioseb</td><td>MikRon 9mm</td><td></td></tr></tbody></table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

Frenik motor nöronlar servikal motor nöronlar en memeli türlerinde C6 düzeylere C3 kaynaklanan vardır. Aksonal projeksiyonlar solunum diyafram innerve frenik sinir gidiyor. Spinal kord dilimler halinde frenik motor nöronlar diğer motor nöronlar üzerinde morfolojik veya biyokimyasal ölçüt üzerinden tanımlanamıyor. Biz fare, bir fluorophore Birleşik kolera toksini alt birim beta (CTB) aşağıdaki intrapleural enjeksiyonu frenik motor nöron hücre gövdelerinde görüntülenmesi için yordamlar açıklamasını sağlar. Bu floresan nöroanatomik izleyici diyafram nöromüsküler kavşak yakalanmış, retrogradely frenik akson yapılacak ve frenik hücre cesetleri ulaşmak için yeteneği vardır. İntrapleural CTB teslimat iki metodolojik yaklaşım karşılaştırılır: Transtorasik iğne karşı transdiaphragmatic. Her iki yaklaşımın başarılı ve frenik motor nöronlar CTB etiketli benzer sayıda neden. Sonuç olarak, bu tekniklerin görselleştirmek veya bu diyafram frenik devre üzerinde duruldu gibi çeşitli deneysel çalışmalar frenik motor nöronlarda ölçmek için uygulanır.

Erkek C57bl/6J fareler (n = 18), 4 ay 3 yaşlı çalışmaya dahil edildi. Denemenin gün 0, 8 fareler yayımlanmış protokolü7,18göre bir tek taraflı C4 kontüzyonu, sağ taraflı uygulandı. Sham prosedür olarak C4 üzerine bir laminektomi kontüzyonu olmadan 10 fareler uygulandı. Gün 3, fareler CTB-fluorophore intrapleural enjeksiyonu için yukarıda açıklanan iki farklı yordamlara göre hazırlanmıştır. Gün 7, tüm fareler anestezi euthanized (ketamin 100 mg/kg ve xylazine 5 mg/kg) ve kan kaybı.
Bütün spinal kordonlar, paraformaldehyde ve cryoprotected içinde % 30 Sükroz standart laboratuvar yordamlara göre sabit hasat edildi. Servikal genişleme, O.C.T. ve cryosectioned boyuna veya transversally 30 µm kalınlığında katıştırılmış izole edildi.
Uzunlamasına omurga bölümleri Floresans analiz için filtre küp ile donatılmış bir epifluorescent mikroskobu ile gözlendi (uyarma: 560/20nm; Emisyon: 635/30nm). Ventral boynuz floresan motor nöronlarda doğrusal sütun C3 hücre C5 düzeyleri (şekil 6A, üst panel) olarak tespit edilmiştir. Tüm etiketli hücreleri Ipsilateral bu gri konuda bulunmaktaydı ve Morfoloji (şekil 6B) motor nöronlar ile tutarlı sergiledi. Yaralı hayvanlarda etiketli PhMN çarpıcı bir kaybı ile birlikte spinal doku bozulması (yıldız şekil 6A ve 6 C) C4 düzeyde gözlenmiştir. CTB+ PhMNs el ile (150 µm tarafından aralıklı) her beşinci enine bölümünde zarar görmemiş ve C4 yaralı spinal kabloları (şekil 6C) sayıldı. Bir tahmini etiketli PhMNs toplam sayısı 5 tarafından sayılan CTB+ hücre sayısı çarpılarak hesaplanır. Zarar görmemiş sağlıklı farelerde etiketli PhMNs hemicord başına toplam sayısı 151 ± 9 transdiaphragmatic (TDia) yaklaşım, 178 ± 9 Transtorasik (TTho) yaklaşımı (şekil 6D) kullanarak karşılaştırıldığında kullanırken tahmin edilmiştir. C4 yaralanma bu rakamlar sırasıyla 59 14 ve 70 ± ± 10 düştü. Bu çalışmada, intrapleural teslim iki yöntem arasında istatistiksel fark kanıtlanan (p > 0,05, Mann-Whitney U testi; TDia TTho karşı).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig1.jpg"> Şekil 1. Transdiaphragmatic veya Transtorasik iğne kullanarak Intrapleural enjeksiyonları. Transdiaphragmatic yaklaşımı laparatomi, pozlama diyafram (pembe renkte) karın yüzey ve üç iğne göğüs, medial ve krural bölgelerde Aiçerir. Transtorasik yaklaşım için fareyi sol yanal dekübitus bulunduğu atıldı. Altıncı ve yedinci kaburga altında dirsek bölgesi manuel palpasyonla Btarafından tanımlanır. İğne deri, subkutan doku, göğüs kasları, interkostal kaslara ve plevral boşluğu (Asteriks) ulaşmak için parietal plevra eklenir. Lar, göğüs; m, medial; c, krural; S/SC, deri ve subkutan doku; TM, göğüs kasları; IC, interkostal kaslara; PP; parietal plevra; L, akciğer. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56758/56758fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig2.jpg"> Şekil 2. Karaciğer, safra kesesi ve diyafram karın karşısında bir görünüm ile cerrahi alan. A. safra kesesi ve diyafram arasında suspensory bağ unutmayın. B. belgili tanımlık kiriş dikkatli bir şekilde kesilir. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56758/56758fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig3.jpg"> Şekil 3. Görünümü diyafram '. Sternum (s), medial (m) ve krural (c) alanlarında doğru hemidiyafram tanımlanır. A. krural bölge için karaciğer LOB posterior olduğuna dikkat edin. B. CTB plevral boşlukta enjekte için iğne 1 mm sağ hemi-diyafram ile derin ekleyin. Orta alanda enjeksiyon olduğunu resimli. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56758/56758fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig4.jpg"> Şekil 4. Transtorasik yaklaşım. Fare sol yanal dekübitus Aiçinde yer alıyor. Diyafram ve dirsek bölgesi kostal marjı tanımlayın. B. altıncı ve yedinci interkostal boşluk derin dirsek bölgesine tanımlanır. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56758/56758fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig5.jpg"> Şekil 5. Altıncı ve yedinci interkostal boşluk derin dirsek bölgesine tanımlanır. A. genişletilmiş ön ve arka bacaklarda. B. şırınga cranially odaklı ve yüzeysel altıncı veya yedinci kaburga, 3 mm eğim ters ile interkostal kasları ile derin altında eklenmiş. C. iğneyi yavaşça yükselmiş ve kaburga iğne göğüs boşluğuna iyi konumlandırılmış onaylamak için kalkar. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56758/56758fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig6.jpg"> Şekil 6. Ventral boynuz gri madde intrapleurally enjeksiyonlu fare hücrelerinde CTB+ . A. spinally yaralanmamış fare, C5 için servikal spinal kord düzeyinde C3 gelen boyunca CTB+ frenik motor nöronlar dağıtın. Berelenmiş fare, doku bozulması CTB+ frenik motor nöronlar C4 düzeyinde (Asteriks) kaybı ile tek taraflı olarak görülmektedir. B. CTB+ etiketli hücreleri Ipsilateral bu gri konuda bulunmaktaydı ve Morfoloji motor nöronlarile tutarlı sergiledi. C. spinal iplerden transvers kesitler CTB+ hücreleri zarar görmemiş (sol) ve yaralı (sağda) fareler spinal kord boyunca belirli mesafelerde ölçmek için kullanılmıştır. Ö. CTB miktar+ hücre transdiaphragmatic (TDia) veya intrapleural CTB teslimat Transtorasik (TTho) yaklaşım göre zarar görmemiş ya da yaralı farelerde Ipsilateral hemicord bulundu. Çubukları temsil 250 µm. veri (SEM) ortalama ortalama ± standart hatasını ifade. n = 5-7 fareler her TDia grubunda; n = 3 fareler her TTho grup. Sigara Lameller Mann-Whitney U testi gerçekleştirilen ve sonuçları kabul kadar önemli ölçüde farklı p için < 0,05. p < 0,001 için C4 yaralanma karşı yaralanmamış. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56758/56758fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice at JoVE.com

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Burada, sonra intrapleural teslim fluorophore kolera toksini alt birim beta Birleşik frenik motor nöronlar farelerde belirlenmesi için bir protokol açıklayın. İki teknik plevral boşluğu enjekte etmek için karşılaştırılır: Transtorasik yaklaşımlar karşı transdiaphragmatic.

Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

retrograde-neuroanatomical-tracing-of-phrenic-motor-neurons-in-mice

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Görüntüleme.  Université de Namur. Burada, sonra intrapleural teslim fluorophore kolera toksini alt birim beta Birleşik frenik motor nöronlar farelerde belirlenmesi için bir protokol açıklayın. İki teknik plevral boşluğu enjekte etmek için karşılaştırılır: Transtorasik yaklaşımlar karşı transdiaphragmatic.

Video: Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Nörobilim

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Gelişim Biyolojisi

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Motor End Plates boyunca İntramüsküler Enjeksiyonlar: Doğrudan Motor Nöronlar içine Servis Tarayıcıları Bir Minimal İnvaziv Yaklaşım

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

A Mouse Model of Direct Anastomosis via the Prespinal Route for Crossing Nerve Transfer Surgery

Crossing nerve transfer surgery has been a powerful approach for repairing injured upper extremities in patients with brachial plexus avulsion injuries. Recently, this surgery was creatively applied in the clinical treatment of brain injury and achieved substantial rehabilitation of the paralyzed arm. This functional recovery after the surgery suggests that peripheral sensorimotor intervention induces profound neuroplasticity to compensate for the loss of function after brain damage; however, the underlying neural mechanism is poorly understood. Therefore, an emergent clinical animal model is required. Here, we simulated clinical surgery to establish a protocol of direct anastomosis of bilateral brachial plexus nerves via the prespinal route in mice. Neuroanatomical, electrophysiological, and behavioral experiments helped identify that the transferred nerves of these mice successfully reinnervated the impaired forelimb and contributed to accelerating motor recovery after brain injury. Therefore, the mouse model revealed the neural mechanisms underlying rehabilitation upon crossing nerve transfer after central and peripheral nervous system injuries.

We simulated clinical surgery to establish a protocol of direct anastomosis of bilateral brachial plexus nerves via the prespinal route in mice, contributing to the study of the neural mechanisms underlying rehabilitation upon crossing nerve transfer after central and peripheral nervous system injuries.

Çapraz Sinir Transferi Cerrahisi için Prespinal Yol Yoluyla Doğrudan Anastomozun Bir Fare Modeli

Crossing nerve transfer surgery has been a powerful approach for repairing injured upper extremities in patients with brachial plexus avulsion injuries. ...

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. This standard approach can be challenging for targets in the caudal brainstem and upper cervical cord due to specific anatomical challenges as these sites are remote from skull landmarks, leading to imprecision. Here we outline an alternative stereotaxic approach via the cisterna magna that has been used to target discrete regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. The cisterna magna extends from the occipital bone to the atlas (i.e., the second vertebral bone), is filled with cerebrospinal fluid, and is covered by dura mater. This approach provides a reproducible route of access to select central nervous system (CNS) structures that are otherwise hard to reach due to anatomical barriers. Furthermore, it allows for direct visualization of brainstem landmarks in close proximity to the target sites, increasing accuracy when delivering small injection volumes to restricted regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. Finally, this approach provides an opportunity to avoid the cerebellum, which can be important for motor and sensorimotor studies.

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice commonly involves access through the skull bones and is guided by skull landmarks. Here we outline an alternative stereotaxic approach to target the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna that relies on direct visualization of brainstem landmarks.

Farelerde Cisterna Magna ile Kaudal Beyin Sapı ve Üst Servikal Omuriliğin Mikroenjekte Edilmesine Stereotaksik Cerrahi Yaklaşım

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

Fare Sempatik Nöronlarının Hedeflenmesi: Lomber Sempatektomi Yaklaşımı

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays many critical roles in maintaining bodily homeostasis, but it has rarely been studied in the context of peripheral nerve injury. The extent of postganglionic sympathetic neuronal functions in distal targets in the periphery is currently unclear. To better explore the role of sympathetic innervation of peripheral targets, a surgical &#34;knock-out&#34; model provides an alternative approach. Although this can be achieved chemically, chemical destruction of postganglionic sympathetic neurons can be nonspecific and dose-dependent. The use of a surgical lumbar sympathectomy in mice, once thought to be &#34;virtually not practicable&#34; in small animals, allows for specific targeting of postganglionic sympathetic neurons that innervate the hind limbs. This manuscript describes how to surgically remove the L2-L5 lumbar sympathetic ganglia from a mouse as a survival surgery, which reliably decreases the hind paw sweat response and the number of sympathetic axons in the sciatic nerve.

Yazar Spotlight: Sempatik Nöronların Plastisitesini Keşfetmek

This manuscript presents a protocol for surgically removing the postganglionic lumbar sympathetic neurons from a mouse. This procedure will facilitate a multitude of studies aimed at investigating the role of sympathetic innervation in distal tissue targets.

Farelerde Cerrahi Lomber Sempatektomi

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays ...

Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi

Motor End Plates boyunca İntramüsküler Enjeksiyonlar: Doğrudan Motor Nöronlar içine Servis Tarayıcıları Bir Minimal İnvaziv Yaklaşım

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Çapraz Sinir Transferi Cerrahisi için Prespinal Yol Yoluyla Doğrudan Anastomozun Bir Fare Modeli

Farelerde Cisterna Magna ile Kaudal Beyin Sapı ve Üst Servikal Omuriliğin Mikroenjekte Edilmesine Stereotaksik Cerrahi Yaklaşım

Farelerde Cerrahi Lomber Sempatektomi

Farelerde Cerrahi Lomber Sempatektomi