PuMA teknik eğitimde sağlanan Dr Arnulfo Mendoza teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, bu çalışma süresince kendi mikroskoplar kullanımını sağlamak için Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (ncı/NIH) ve Sam Aparicio (BC Kanser Ajansı) kabul etmek istiyorum. Bu araştırma (kısmen) ulusal sağlık enstitüleri, kanser araştırmaları, Pediatrik Onkoloji şube Merkezi Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. M.M.L. ulusal kurumları, sağlık Intramural ziyaret adam Program tarafından (Ödülü 15335) destek verdi ve şu anda bir Joan Parker bursu metastaz araştırma tarafından desteklenmektedir. P.H.S. British Columbia kanser Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Hangi görüntüleme veri elde tüm hayvan iletişim kurallarını hayvan bakım ve kullanım Komitesi Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri onayı ile gerçekleştirilmiştir. Tartışılan ve video makalede tasvir tüm hayvan iletişim kuralları British Columbia Üniversitesi hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. hazırlanması tümör hücreleri PuMA modeli için malzeme ve enjeksiyon için
Not: Çözümler ve hücre miktarı 1 fare için yeterli olacaktır. Daha fazla fare çalışmada kullandıysanız gerektiği şekilde büyütmek. Ortam için yemek tarifleri, Tablo 1 ve Tablo 2bakın.
<ol><li>Bir Media 5 mL 15 mL konik tüp 37 oC su banyosu içinde önceden ısıtmak.</li>
	<li>Laboratuvar mikrodalga kullanarak % 1.2 düşük erime özel çözümde (steril su) eritin.</li>
	<li>15 mL konik tüpe 5 mL de erimiş özel aktarım ve bir 37 oC su banyosunda sıcak tutun. 37 oC ve akciğer üfleme adım önce sıvı, erimiş özel olduğundan emin olun.</li>
	<li>Hücre kültürü grade 1 X kalem/strep nedense odamızda buz kovası ile takıma PBS önceden sakin 30 mL.</li>
	<li>6-şey plaka bir kuyuda bir jelatin sünger B-medya 1,5 ml önceden ıslatın. Sünger akciğer dilimleri için destek çapa olacaktır.</li>
	<li>İşletim sistemi hücreleri yaklaşık % 70-90 emin olmak Konfluent yordamı gününde. Aşırı birleşmesi veya ortamdır hücreleri genellikle vurguladı ve canlılık bu noktada azalmış beri sarı turuncu olan hücreler kullanmayın. Osteosarkom hücre hatlarında, MNNG ve HOS, 5 x 105 ' te 100 μL hacmi 1 fare kuyruğu damar içine enjekte etmek için kullanılır. Daha fazla fare çalışma için kullanılmışsa buna göre lüks.</li>
	<li>% 0.25 tripsin-EDTA (3 mL T75 şişesi veya 10 cm kültür tabak 2 mL) kullanarak tümör hücreleri hasat. Ne zaman hücre tabağını kaldırın başlıyor, tripsin-EDTA ile komple bir medya etkisiz hale getirin. Hücreleri aşağı spin ve bir kez hücre kültürü sınıf PBS ile durulayın. Pelet PBS 5 mL resuspend.</li>
	<li>Bir hücre sayısı standart yöntemlerle gerçekleştirmek. Daha fazla hücre süspansiyon hücre süspansiyon kaybı sık sık iğne çizmek-up sırasında oluşur ve enjeksiyon girişimleri başarısız oldu çünkü aslında gereken şey daha yapmak en iyisidir.</li>
	<li>Trypan-mavi dışlama tahlil hücrelerin canlılık değerlendirmek için hücre süspansiyon bir örnek üzerinde gerçekleştirin. Yalnızca hücre % 90 canlılığı göster, devam veya daha yüksek.</li>
	<li>100 μL hacmi 5 x 105 hücrelere enjekte. 2 X bu miktarın aşırı hazırlamak için 1 x 106 hücre aşağı döndü ve 0.2 mL HBSS resuspended.</li>
	<li>Hücre süspansiyon enjeksiyon için fareler hazırlarken bir buz kovası yerleştirin.</li>
</ol>2. kuyruk ven enjeksiyon ve akciğer üfleme
Not: Çözümler ve bu bölümdeki hücrelerin miktarı 1 fare için yeterli olacaktır. Daha fazla fare çalışmada kullandıysanız gerektiği şekilde büyütmek. Ekipman, malzeme ve aşağıdaki adımlarda kullanılan cerrahi aletler listesi için Tablo 3 ve Tablo 4bakın.
<ol><li>Dişi fare (yaş 6-8 hafta) 5 min için Isıtma lambası altında damar kuyruğunu gözle görülür daha belirgin hale getirmek için sıcak. Fare K7M2 veya K12 hücreleri için Balb/c fare kullanma; insan MG63.3, MG63, MNNG ve HOS hücreleri için ağır kombine immün yetmezlik fare kullanın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon tüpü hafifçe sallayarak düzgün olduğundan emin olun. Dikkatle iğne olmadan 1 mL şırınga içine hücre süspansiyon kadar çizin. Kap bir 27 şırınga iğne ölçmek. İğne eğim iğne üzerindeki birim işaretleri olarak aynı tarafta olduğundan emin olun.</li>
	<li>Restrainer fareyi getirin ve kuyruk bir alkol bezle temizleyin.</li>
	<li>Bir kuyruk ven enjeksiyon gerçekleştirmek ve hücre süspansiyon 100 μL enjekte için devam edin. 5 dk sonra enjeksiyon, fareyi bir CO2 odaya yerleştirin ve ötenazi standart işletim prosedürü (anahat kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından) başlayıp. Yordamı nefes borusu zarar verir bu yana servikal çıkığı ötenazi aracı olarak kullanılmamalıdır.</li>
	<li>Bir kez fare ötenazi, laminar akış hood hazırlanması için özel/bir-media çözüm ile fare akciğerin üfleme başlar. Laminar akış başlık içinde steril pad ile bir çalışma alanı oluşturun. Bu yastık sterilize cihazlar, IV kateter, IV uzantısı küme ve yerçekimi perfüzyon aygıtlar ( tamamlayıcı şekil 1bakınız) yerleştirir.</li>
	<li>Fareyi sırt recumbancy getirin. Steril küçük makas ile göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için sternum dikkatle incelemek. Özel/bir-media çözümünü akciğer insufflate için kullanılan bu yana akciğer ponksiyon değil için dikkat ediniz.</li>
	<li>Her iki tarafta göğüs giriş geçmiş zaman göğüs kemiği anatomi, Trakea incelemek. Trakea uzak çevresindeki yumuşak doku dissekan tarafından maruz.</li>
	<li>Nefes borusu 20 gauge IV kateter ile cannulate. Gevşek cannulated Trakea etrafında steril akorduna dikiş kullanarak bir cerrahi düğüm.</li>
	<li>Bir IV uzantısı catheterized Trakea yerçekimi perfüzyon aparatı 10 mL şırınga ayarlanabilen iliştirin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış 37 oC özel (5 mL) ve bir-media (5 mL) 1:1 karışım içine birleştirmek. Sıvı özel/bir-media çözüm yerçekimi perfüzyon cihazın 10 mL şırınga dökün. Önce üfleme özel/bir-media çözüm ile akciğer uzantısı küme tüm uzunluğu özel/bir-media, böylece yanlışlıkla üfleme hava ile akciğer örneklerinin inkâr ile hazır olun.</li>
	<li>Özel/bir-media çözüm akciğer akciğer tam insufflated dolduramazsınız.</li>
	<li>Akciğer tam olarak insufflated bir zamanlar kanül çıkarın ve nefes borusu ile agarase/bir-media çözüme kaçağı önlemek için cerrahi düğüm sıkıca bağla.</li>
	<li>Göğüs boşluğu üzerinden (Trakea, kalp ve akciğer) Yiğitlik dışarı incelemek için devam edin. Değil delik için dikkat çekmek veya akciğer yüzeyine zarar verebilir.</li>
	<li>Yer (belirli hiçbir yönde) yiğitlik PBS önceden soğutulmuş 30 ml 1 X kalem/strep ile desteklenmiş ve 20 dk kuvvetlendirmek özel/bir-media sağlar.</li>
	<li>İyi makas ve şekil 1A' gösterildiği gibi akciğer (3 x 1.5 mm) küçük parçalar koparıp cımbız kullanarak. Küçük akciğer dilimleri kolayca 2.5 X amacı istimal yansıması. Genellikle 4-10 dilim grubu başına deneysel koşul birden çok dilim kesebilir. Not: her deney grubu için B-medyada önceden ıslatılmış bir 2 x 2 cm jelatin sünger içeren akciğer dilimleri ayrı bir kuyuya (6-şey plaka) yerleştirin. Medya iyi ücret miktarı 1,5 mL olmalıdır. Medya her 2-3 gün değiştirin. İlaç araştırmaları için medya/uyuşturucu değişen belirlenen kullanıcı sıklığıdır.</li>
</ol>3. Widefield floresan görüntüleme akciğer dilimleri ve analiz
Not: widefield floresan için (3 x 1.5 x 1 mm) akciğer Bölüm 1 Resim 2.5 X amacı istimal sığabilmesi için görüntüleme, daha küçük dilimler kesilir.
Resim alma widefield floresan mikroskop Tarih:
<ol><li>Akciğer dilimleri genellikle 0, 3, 7 ve 14 gün sonrası enjeksiyon görüntüsü. Biyolojik kabine steril ortamda dikkatle akciğer dilimleri aktarım jelatin sünger bir steril 35 mm cam alt çanak yuvarlak. Akciğer dilim üzerinden aşırı sıvı kapalı olarak fazla sıvı bir ayna olarak hareket ve tümör hücreleri Floresan ışık yansıtacak kurulamak için dikkat ediniz.</li>
	<li>Şekil 1A' tasvir benzer bir şekilde akciğer dilimleri düzenleyin. Her sütun farklı bir deneysel durumu temsil eder. Çapraz-akciğerleri cımbız ile kirletmek değil kendine iyi bak. % 70 etanol ile durulayın ve akciğer dilimleri başka bir deney grubu üzerinden tutmadan önce kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Görüntüleme parametrelerini optimize etmek (yani. kazanç, ofset, pozlama zaman, binning) arka plan Akciğer doku (tedavi edilmezse araç) denetiminde ve floresan tümör hücreleri arasında en iyi kontrast sağlayan grup. Kontrol grubundan aynı parametreler deneysel grupları görüntü için kullanın. TIFF görüntü formatında kaydedebilirsiniz.</li>
	<li>Bir ölçek başvurusu için aynı amacı bir mikrometre dijital bir resim çekmek.</li>
	<li>Akciğer auto-floresan zaman içerisinde değişen beri görüntü parametreleri denetim akciğerlere görüntüleme her oturum ayarlanması gerekir. Bir oturum için görüntüleme parametreleri mutlaka sonraki görüntüleme oturumlar için en uygun olmayabilir.</li>
</ol>Görüntü analizi: Not: Aşağıdaki görüntü işleme adımlarını ImageJ 1,51 h yazılım paketi 17ile yapılır.
<ol><li>Bir görüntü dosyası ImageJ (şekil 3A) açın.</li>
	<li>Arka plan çıkarmak: işlem > arka plan çıkarmak > Rolling ball RADIUS (50 piksel başlamasıyla), "Işık arka plan" (şekil 3B) işaretini kaldırın.</li>
	<li>Resim 8-bit biçimine dönüştürme: Görüntü > türü > 8 - bit (şekil 3 c).</li>
	<li>Birimleri piksel olarak ayarlayın: Görüntü > Enter "Piksel" 1 "Piksel genişliği", "Piksel Yükseklik", "Voxel derinlik" uzunluğu birimi girin. Sonraki görüntülere uygulamak için "Global" onay kutusunu işaretleyin.</li>
	<li>Çokgen seçim aracını kullanarak, tüm akciğer dilim Şeklin anahattını ve toplam akciğer dilim alanının (piksel2) belirlemek. Bu değer yüzde tümör yükünü akciğerin hesaplamak için kullanılır.</li>
	<li>Eşik görüntü: Görüntü > ayar > eşik > "Varsayılan" ve "siyah-beyaz" vurgulamak > tümör hücrelerinin çoğunluğu doğru bir şekilde vurgulanmış şekilde eşik görüntü kaydırıcıyı kullanmak. "Uygula" tuşuna basarak bir siyah beyaz görüntü burada akciğer tüm siyah ve beyaz floresan lezyonlardir sonuçlanır (şekil 3D). İkinci kez "Uygula" tuşuna basarak tüm floresan yapıları şimdi siyah şekilleri (şekil 3E) nerede görüntü ters çevirmek.</li>
	<li>Miktar sayısını ve lezyonlar şeklinde: Analiz > ölçümleri ayarla > kontrol "Alan". Tüm diğer kutuların. Parçacıklar analiz > boyutu (piksel2): 0-Infinity ImageJ Numaralandırılacak şekiller aralığını temsil eder. Ampirik olarak gün 0 araç görüntüleri tek tümör hücresinde sayılan en küçük lezyon belirlemek. Bu tek tümör hücre alanının kalan görüntüler veri kümesi için alt sınır kullanın. Bu raporda sunulan çalışma için 11 piksel2 alt sınır ayarlanır. Video örnekte sunulan iş için 24 piksel2 alt sınır ayarlanır. "Döngü" aralığı 0-1 olarak bırakın. "Show" ayarlanabilir "Hiçbir şey". Alternatif olarak, "Göster" ve "Ana hatlarıyla" Seçili, tüm özetlenen şekillerin çizimi oluşturulur. "Göstermek-den sonuçlanmak" ayrı bir pencere açılır ölçümlerin denetleyin. İsteğe bağlı olarak, "yöneticisine Ekle" kutusunu kontrol sahip ilerisi için kaydedilebilir bir yatırım Getirisi Yöneticisi için sayısal şekiller kurtaracak. Tamam bastıktan sonra tüm numaralandırılmış şekillerin ve alan ölçüleri (şekil 3F) içeren bir "Sonuçlar" pencere açılır.</li>
	<li>Kopyalayabilir ve veri "Sonuçlar" penceresinden bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz. O belirli akciğer dilim için metastatik lezyonlar tüm alanlarında özetlemek için Excel'de topla matematiksel işlevini kullanın. Akciğer dilim yüzde akciğer tümör yükünü değerlendirmek için metastatik lezyonlar alanlara göre akciğer dilim toplam yüzölçümü toplamı bölün. Bu parametre de açıklanan alan kesir (birA) denir Underwood 18tarafından daha fazla. Akciğer tümör yükünü metastatik lezyon alanları/toplam akciğer dilim alanının toplamı =</li>
	<li>Akciğer tümör yükünü kontrol grubu ve gruplar kalan akciğer bölümlere kalanında hesaplayın. Ortalama akciğer tümör yükünü grubu başına 0, 3, 7 ve 14 gün içinde arsa. Yüksek ve düşük metastatik insan OS hücre ilerici zaman noktalarda PuMA modelindeki büyüyen temsilcisi widefield floresan resimler (şekil 4A) gösterilir. Kat değiştirme (0 gün normalize) yüzde metastatik tümör yükünü zaman içinde gösterilen bir çizgi grafiği (şekil 4B) gösterilir.</li>
</ol>4. confocal floresan görüntüleme PuMA modeli
Not: yansıması daha fazla ROIs için izin vermek için kesilmiş büyük akciğer dilimler (tam transvers kesitler, 1-2 mm kalınlığında) dışında confocal görüntüleme için doku işleme önceki bölümde buna benzer.
Akciğer parankimi ile DAR4M, etiketleme:
<ol><li>Akciğer dilim içinde 10 μμM DAR4M (HBSS) olarak 37 ° C'de 45 dk için bırakın DAR4M hücreleri içinde reaktif azot türleri akciğer Etiketler.</li>
	<li>Taze HBSS akciğer dilimlerle, kuluçka 45 dk sonra yıkayın.</li>
	<li>Akciğer dilim bir 35 mm cam alt yuvarlak çanak ve confocal mikroskop görüntüsünde yerleştirin.</li>
	<li>Şekil 5 ' te gösterilen örnek görüntüler için görüntü parametreleri Tablo 5' te listelenen.</li>
	<li>İlgi bir bölge için bir Z-yığını elde etmek. Önerilen Z dilim kalınlığı Nyquist örnekleme için kullanın. Yeşil flüoresan OS hücreleri DAR4M etiketli akciğer dokusunda gösterilen bir 3B yığın temsilcisi bir film film 1 ve tamamlayıcı film 1sağlanır.</li>
</ol>Şekil 5' te gösterilen örnek confocal görüntülerde görüntüleme oturumu terminal. Boyuna görüntüleme gerekiyorsa, yaşam için daha az duyarlilik olduğundan 2-Foton veya çoklu foton donanımlı confocal LSM mikroskop görüntüleme için kullanımı tavsiye edilir doku19,20. Mito-RFP ifade MG63 hücrelerde PuMA modeli görüntüleme:
<ol><li>PuMA iletişim kuralı olarak anahat içinde adım 1 ve 2 MG63 hücreleri mito-RFP yapı ifade kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Akciğer dilim bir 35 mm cam alt yuvarlak çanak ve confocal mikroskop görüntüsünde yerleştirin.</li>
	<li>Şekil 6 ' da gösterilen örnek görüntüler için görüntü parametreleri Tablo 6' da listelenir. Film 2 ve tamamlayıcı film 2yeşil flüoresan OS hücreleri floresan mitokondri sağlanan kırmızı ile gösterilen bir 3B yığın temsilcisi bir film.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Khanna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+drug+development+path+that+targets+metastatic+progression+in+osteosarcoma.">Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma.</a> Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+The+right+trials.">Perspective: The right trials.</a> Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).</li><li>Mendoza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung.">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).</li><li>Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+resistance+and+PKC+signaling:+distinguishing+features+of+high+and+low+metastatic+cells.">Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells.</a> Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).</li><li>Lizardo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+Glucose-Regulated+Protein+78+in+Metastatic+Cancer+Cells+Is+Necessary+for+Lung+Metastasis+Progression.">Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression.</a> Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).</li><li>Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Metastasis+Using+In+Vitro+Platforms.">Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms.</a> Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).</li><li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+progression+of+metastasis+in+lung:+cell+survival,+dormancy,+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency.">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li><li>Morrow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+inhibition+mitigates+enhanced+mRNA+translation+associated+with+the+metastatic+phenotype+of+osteosarcoma+cells+in+vivo.">mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo.</a> Clinical Cancer Research. , (2016).</li><li>Varghese, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+videomicroscopy+reveals+differential+effects+of+the+vascular-targeting+agent+ZD6126+and+the+anti-angiogenic+agent+ZD6474+on+vascular+function+in+a+liver+metastasis+model.">In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model.</a> Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).</li><li>Khanna, C., Hunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+vivo.">Modeling metastasis in vivo.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).</li><li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo.">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>El-Naggar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Activation+of+HIF1alpha+by+YB-1+Promotes+Sarcoma+Metastasis.">Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis.</a> Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).</li><li>MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+spread+and+micrometastasis+development:+quantitative+approaches+for+in+vivo+models.">Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models.</a> Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cancer+cell+extravasation+in+vivo.">Quantification of cancer cell extravasation in vivo.</a> Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Underwood, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantitative stereology. , (1970).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optical+imaging+of+cancer+metastasis+using+multiphoton+microscopy:+a+short+review.">In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review.</a> Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).</li><li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research.">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li><li>Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Live+Imaging+of+Lung+Metastasis+and+Their+Microenvironment.">Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment.</a> J Vis Exp. (108), e53741 (2016).</li><li>Guha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+retrograde+signaling+induces+epithelial-mesenchymal+transition+and+generates+breast+cancer+stem+cells.">Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).</li><li>Ren, L., Morrow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Positively+selected+enhancer+elements+endow+osteosarcoma+cells+with+metastatic+competence."> Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence.</a> . Nat Med. , (2018).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Metabolomics+uncovers+a+link+between+inositol+metabolism+and+osteosarcoma+metastasis."> Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis.</a> Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells.">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Aşağıdaki teknik makale akciğer kolonizasyon OS eğitim PuMA modeli pratik bazı yönlerini açıklar. Nerede araştırmacılar ekstra dikkat protokolündeki bazı önemli adımlar şunlardır:
a) nefes borusu cannulation. Nefes borusu çevresindeki kas ve bağ dokusu diseksiyon sırasında kolayca zarar görebilir. Buna ek olarak, iğne kateterin kolayca nefes borusu itti olabilir. Nasıl iğne eğimi Trakea kanül eklerken girdiği için dikkat edin.
b) Delme ...

Pediatrik hastalarda metastatik osteosarkom (OS) için geliştirilmiş sonuçları hala kritik karşılanmamış klinik ihtiyaç 1kalır. Bu yeni tatlı hedefli tedaviler geliştirmenin önemi vurgular. Hedef tümör hücre çoğalması metastatik hastalık ve böylece roman stratejileri tedavisinde etkili olduğu kanıtlanmış değil geleneksel chemotherapeutics metastatik işlemi 2hedeflemesi gerekir. Geçerli makalenin ex vivo akciğer metastazı modeli, yeni keşfetmek yararlı bir araç sağlayan Mendoza ve iş arkadaşları3tarafından geliştirilen pulmoner metastaz tahlil (PuMA) nispeten yeni bir tür pratik yönlerini ele almaktadır. Moleküler sürücüleri akciğer metastazı ilerleme OS 4,5. Devam etmeden önce ancak, kısaca metastaz çeşitli geçerli modeller dokunmak ihtiyatlı olur ve deneyleri nasıl PuMA modeli geleneksel vitro birkaç avantaj sunar.
Metastaz çalışırdım en deneysel modeller belirli bir adımı veya metastatik art arda birkaç adımını özetlemek vitro ve in vivo sistemleri oluşturmaktadır. Bu adımlar içerir: 1) tümör hücreleri birincil tümör, 2) intravasation uzak içine Yakındaki gemiler (kan veya lenf) ve dolaşım içinde transit geçiş 3) tutukla ikincil site, 4) ekstravazasyonu ve hayatta kalma ikincil alanında 5) oluşumu micrometastases ve 6) büyüme içine bozukluklarına Metastazlari (şekil 1). Metastaz vitro modelleri 2-boyutlu (2D) geçiş içerebilir ve hangi içinde gözden 3 boyutlu (3D) Matrigel işgali deneyleri, başka bir yerde 6detay. Vivo modellerinde, iki yaygın olarak kullanılan model sistemleri içerir: 1) spontan metastaz modeli nerede bir tümör hücreleri orthotopically kendiliğinden metastatik hücreleri tutuyor yerel bir tümör oluşturmak için belirli doku türü enjekte olmasıdır uzak sitelere; 2) deneysel metastaz modeli nerede tümör hücrelerinin damar akıntıya karşı hedef organ enjekte edilmiş olur. Örneğin, bir kuyruk ven enjeksiyon tümör hücreleri sonuçları geliştirme akciğer Metastazlari5,7,8. Diğer deneysel metastaz modelleri dalak ya da karaciğer metastaz9,10gelişiminde sonuçları Mezenterik ven içine tümör hücrelerinin enjeksiyon içerir. Bu vivo içinde modellerin pratik hususlar Welch 11tarafından ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Metastaz Pediatrik sarkomları içinde çalışmak için kullanılan başka bir vivo içinde modeli yerel tümör oluşumu ve spontan metastaz için akciğerler 12,13sonuçları böbrek böbrek subkapsüler tümör implantasyon modelidir. Teknik açıdan daha zorlu bir tekniği gibi intravital videomicroscopy can doğrudan görselleştirmek, buna metastatik kanser hücreleri ve metastatik bir site microvasculature gerçek zamanlı, Hofstede (yani. akciğer veya karaciğer)14 MacDonald tarafından açıklandığı gibi ve Entenberg15veya kanser hücre ekstravazasyonu chorioallantoic zarda Kim 16tarafından tanımlandığı gibi.
PuMA modelin bir ex vivo, Akciğer doku explant, kapalı kültür sistemi olduğunu nerede floresan tümör hücrelerinin büyümesini boyuna Floresans mikroskobu ile bir ay boyunca görülebilir ( şekil 2Abakınız). Bu model akciğer kolonizasyon (Adım 3-5) metastatik cascade başlangıç evresinde beyannamedir. Geleneksel vitro modelleri PuMA modelinin büyük bazı avantajları vardır: 1) içinde boyuna metastatik kanser hücre büyüme akciğer microenvironment özelliklerinin çoğu korur bir 3D microenvironment ölçmek için bir fırsat sağlar vivo 3; 2) puMA nakavt aday gen veya uyuşturucu tedavi Anti-metastatik etkinlik 3D akciğer microenvironment bağlamında olup olmadığını değerlendirmek araştırmacı sağlar; 3) Floresans mikroskobu platformlar (2B rakam) widefield Floresans mikroskobu ya da confocal mikroskobu lazer tarama birçok türde ile esnek PuMA modelidir, şekil 2C & Diçinde her örnekler gösterilir, anılan sıraya göre. Bu makalede PuMA modeli gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) metastatik büyüme üzerine boyuna görüntüleme verileri elde etmek için nasıl kullanılacağı ele alınacak-ifade, insan yüksek ve düşük metastatik osteosarkom hücreleri (MNNG ve HOS hücreleri, sırasıyla) kullanarak düşük-büyütme widefield floresan. Akciğer parankimi etiketleri floresan boya ve mitokondri içinde OS etiketleri genetik muhabir PuMA model confocal mikroskobu lazer tarama kullanarak hücreleri kırmızı-floresan protein Imaging örnekler de ele alınmıştır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>highly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>poorly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Amy LeBlanc Laboratory (NCI)</td><td>N/A</td><td>highly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>poorly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>10X M199 media</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>Base media for A-media and B-media</td></tr><tr><td>Distilled Water (sterilized)</td><td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>7.5% sodium bicarbonate solution</td><td>Thermofisher</td><td>25080094</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>Hydrocortizone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>Retinol acetate-water soluable</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media, complete media.</td></tr><tr><td>Bovine insulin solution (10mg/ml)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Thermofisher</td><td>11965092</td><td>Base media of Complete Media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Component of Complete Media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermofisher</td><td>16000044</td><td>Component of Complete Media</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td>Used in cell culture.</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td><td>Used to resuspend cell pellet prior to injection</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Thermofisher</td><td>25200114</td><td>Used in cell culture.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>Used to label lung parenchyma.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table 3&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for PuMA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Upright LSM confocal microscope</td></tr><tr><td>Zeiss 780 Confocal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Inverted LSM confocal microscope</td></tr><tr><td>SCID mice</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>Used as a support for lung tissue sections.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Used during insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>1 ml syringe with 27 gauge needle</td><td>Fisherscientific</td><td>14-826-87</td><td>Used for tail vein injection.</td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td>Used for insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>20 gauge catheter</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>Used during insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>Abbott IV extension set (30&quot;, Sterile)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>Used during insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>Alcohol swabs</td><td>BD</td><td>326895</td><td>For wiping tail vein before injection</td></tr><tr><td>Sterile surgical gloves</td><td>Fisherscientific</td><td>Varies with size</td><td>Asceptic handing of mouse lungs</td></tr><tr><td>30 cm ruler</td><td>Staples</td><td></td><td>Used for insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>Support stand for ruler</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>Used for insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>35 mm glass-bottomed culture dish</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Used during imaging of lung slices</td></tr><tr><td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>Used to line the sterile work area in the biological hood.</td></tr><tr><td>Catgut Plain Absorbable Suture</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>Used to tie off cannulated trachea.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table 4&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical instruments for PuMA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors 3.5&quot; Straight Sharp/Sharp</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>For cutting lung sections</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>For manipulating/holding lung sections.</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>For manipulating/holding lung sections.</td></tr><tr><td>Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5&quot; Length; 1.3 mm Tip Width</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>For general dissection.</td></tr><tr><td>Thumb Dressing Forceps 4.5&quot; Serrated 2.2 mm Tip Width</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>For general dissection.</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5&quot; Straight Sharp/Sharp, 20mm blade</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>For general dissection.</td></tr><tr><td>Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4&quot; Overall Length</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>For general dissection.</td></tr></tbody></table>

practical considerations in studying metastatic lung colonization in osteosarcoma using the pulmonary metastasis assay

Pulmoner metastaz tahlil (PuMA) bir ex vivo akciğer explant ve araştırmacılar tarafından Floresans mikroskobu osteosarkom (OS) akciğer kolonizasyon Biyoloji çalışmaya izin verir kapalı hücre kültür sistemi olduğunu. Bu makalede Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama ve metastatik büyüme widefield veya confocal floresan mikroskopi platformlar kullanarak bağlı görüntü veri alma örnekleri ele alınmaktadır. PuMA modeli esnekliğini araştırmacılar akciğer microenvironment içinde işletim sistemi hücrelerinin büyümesini sadece eğitim için aynı zamanda zaman içinde Anti-metastatik tedavi etkilerini değerlendirmek için izin verir. Akciğer parankimi ile OS hücre etkileşimlerin görülmemiş, yüksek çözünürlükte görüntüleme için confocal mikroskobu sağlar. Ayrıca, PuMA modeli floresan boyalar veya floresan protein genetik gazetecilere ile birleştirildiğinde, araştırmacılar akciğer microenvironment, hücresel ve hücre altı yapıları, gen fonksiyon ve metastatik OS hücrelerdeki organizatörü etkinlik eğitim görebilirsiniz. PuMA modeli osteosarkom araştırmacılar yeni metastaz Biyoloji keşfetmek ve roman Anti-metastatik, hedeflenen tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için yeni bir araç sağlar.

Düşük-büyütme widefield Floresans mikroskobu
İçin widefield floresan mikroskopi PuMA akciğer dilimleri temsilcisi görüntüler ve miktar veri şekil 2Cve şekil 4A ve Bgösterilir. Yüksek ve düşük metastatik hücre hatları için metastatik eğilimlerini ilerici zaman puan üzerinde görsel olarak görünür. Hiç ...

Watch this Scientific Journal Video about Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay at JoVE.com

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

practical-considerations-studying-metastatic-lung-colonization

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.0K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.

Video: Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Kanser Araştırmaları

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Deneysel metastaz Testi

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Tıp

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under the influence of specific environmental signals, these adult stem cells can release paracrine mediators leading to accelerated tumor growth and metastasis. Defining the crosstalk between tumor and MSCs is of primary importance to understand the mechanisms underlying cancer progression and identify novel targets for therapeutic intervention. 
Cancer cells produce high amounts of extracellular vesicles (EVs), which can profoundly affect the behavior of target cells in the tumor microenvironment or at distant sites. Tumor EVs enclose functional biomolecules, including inflammatory RNAs and (onco)proteins, that can educate stromal cells to enhance the metastatic behavior of cancer cells or to participate in the pre-metastatic niche formation. In this article, we describe the development of a preclinical cancer mouse model that enables specific evaluation of the EV-mediated crosstalk between tumor and mesenchymal stem cells. First, we describe the purification and characterization of tumor-secreted EVs and the assessment of the EV internalization by MSCs. We then make use of a multiplex bead-based immunoassay to evaluate the alteration of the MSC cytokine expression profile induced by cancer EVs. Finally, we illustrate the generation of a bioluminescent orthotopic xenograft mouse model of osteosarcoma that recapitulates the tumor-MSC interaction, and show the contribution of EV-educated MSCs to tumor growth and metastasis formation. 
Our model provides the opportunity to define how cancer EVs shape a tumor-supporting environment, and to evaluate whether blockade of the EV-mediated communication between tumor and MSCs prevents cancer progression.

Direct injection of cancer-derived extracellular vesicles (EVs) leads to reprogramming of bone marrow supporting tumor progression; however, which cells mediate this effect is unclear. Herein, we describe a step-by-step protocol to investigate EV-mediated tumor-mesenchymal stem cell (MSC) interactions in vivo, revealing a crucial role for EV-educated MSCs in metastasis.

Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Kemik Metastaz Modelleri

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These lesions compromise bone structure, increase the risk of pathologic fracture, and leave patients with limited treatment options. Primary bone tumors metastasize to distant organs, with some types capable of spreading to other skeletal sites. However, recent evidence suggests that with many solid tumors, cancer cells that have spread to bone may be the primary source of cells that ultimately metastasize to other organ systems. Most syngeneic or xenograft mouse models of primary bone tumors involve intra-osseous (orthotopic) injection of tumor cell suspensions. Some animal models of skeletal metastasis from solid tumors also depend on direct bone injection, while others attempt to recapitulate additional steps of the bone metastatic cascade by injecting cells intravascularly or into the organ of the primary tumor. However, none of these models develop bone metastasis reliably or with an incidence of 100%. In addition, direct intra-osseous injection of tumor cells has been shown to be associated with potential tumor embolization of the lung. These embolic tumor cells engraft but do not recapitulate the metastatic cascade. We reported a mouse model of osteosarcoma in which fresh or cryopreserved tumor fragments (consisting of tumor cells plus stroma) are implanted directly into the proximal tibia using a minimally invasive surgical technique. These animals developed reproducible engraftment, growth, and, over time, osteolysis and lung metastasis. This technique has the versatility to be used to model solid tumor bone metastasis and can readily employ grafts consisting of one or multiple cell types, genetically-modified cells, patient-derived xenografts, and/or labeled cells that can be tracked by optical or advanced imaging. Here, we demonstrate this technique, modeling primary bone tumors and bone metastasis using solid tumor graft implantation into bone.

Bone metastasis models do not develop metastasis uniformly or with a 100% incidence. Direct intra-osseous tumor cell injection can result in embolization of the lung. We present our technique modeling primary bone tumors and bone metastasis using solid tumor graft implantation into bone, leading to reproducible engraftment and growth.

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival compared to surgery alone. To address this problem, the aim of the study is to refine a lesser-known model of OS in rats with a comprehensive histologic, imaging, biologic, implantation, and amputation surgical approach that prolongs survival. We used an immunocompetent, outbred Sprague-Dawley (SD), syngeneic rat model with implanted UMR106 OS cell line (originating from a SD rat) with orthotopic tibial tumor implants into 3-week-old male and female rats to model pediatric OS. We found that rats develop reproducible primary and metastatic pulmonary tumors, and that limb amputations at 3 weeks post implantation significantly reduce the incidence of pulmonary metastasis and prevent unexpected deaths. Histologically, the primary and metastatic OSs in rats were very similar to human OS. Using immunohistochemistry methods, the study shows that rat OS are infiltrated with macrophages and T cells. A protein expression survey of OS cells reveals that these tumors express ErbB family kinases. Since these kinases are also highly expressed in most human OSs, this rat model could be used to test ErbB pathway inhibitors for therapy.

Here, a syngeneic orthotopic implantation followed by an amputation procedure of the osteosarcoma with spontaneous pulmonary metastasis that can be used for preclinical investigation of metastasis biology and development of novel therapeutics is described.

Metastaz Oranını Kontrol Etmek için Amputasyonlu Syngeneic Ortotopik Osteosarkom Sprague Dawley Sıçan Modeli

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival rate of osteosarcoma patients with pulmonary metastasis is less than 30%.Therefore, the utilization of mouse models mimicking the osteosarcoma development in humans is of great significance for understanding the fundamental mechanism of osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis to develop novel therapeutics. Here, detailed procedures are reported to generate the primary osteosarcoma and pulmonary metastasis mouse models via&#160;intratibia injection of osteosarcoma cells. Combined with the bioluminescence or X-ray live imaging system, these living mouse models are utilized to monitor and quantify osteosarcoma growth and metastasis. To establish this model, a basement membrane matrix containing osteosarcoma cells was loaded in a micro-volume syringe and injected into one tibia of each athymic mouse after being anesthetized. The mice were sacrificed when the primary osteosarcoma reached the size limitation in the IACUC-approved protocol. The legs bearing osteosarcoma and the lungs with metastasis lesions were separated. These models are characterized by a short incubation period, rapid growth, severe lesions, and sensitivity in monitoring the development of primary and pulmonary metastatic lesions. Therefore, these are ideal models for exploring the functions and mechanisms of specific factors in osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis, the tumor microenvironment, and evaluating the therapeutic efficacy in vivo.

The present protocol describes intratibia osteosarcoma cell injection to generate mouse models bearing orthotopic osteosarcoma and pulmonary metastasis lesions.

Ortotopik Osteosarkom ve Akciğer Metastazı Fare Modelleri Oluşturmak için İntratibiyal Osteosarkom Hücre Enjeksiyonu

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...