Name: evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle at JoVE.com

Biz onun mükemmel teknik destek için Clemire Cimper için borçlu bulunmaktadır. H.L. laboratuvar çalışmalarında Institut Pasteur, Merkezi Ulusal pour la Recherche bilimsel ve Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; tarafından finanse edildi ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) ve Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. ve A.C. doktora ve doktora sonrası Burslar canlandırmak Konsorsiyumu üzerinden tarafından finanse edilmektedir.

hayvanlar ele Avrupa toplum kuralları ve Etik Komitesi Institut Pasteur (CETEA) onaylı kurallarının başı olarak.
 1. hisse senedi çözümleri hazırlıkları <ol><li>kas örnek fiksasyon için malzemeleri hazırlayın. 0.5 g tragacanth sakız kas fiksasyon için donma katıştırma orta yapmak RT 20 mL su ile çözülür.</li>
	<li>SA-β-Gal boyama için çözümleri hazırlayın.
	<ol><li>Hisse senedi çözümleri K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), anılan sıraya göre tozu distile su içinde eriterek tarafından MgCl 2 (1 M) hazırlayın.</li>
		<li>Suda sulandrarak %0,2 C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (Eozin) hisse senedi çözüm hazırlayın.</li>
		<li>Hisse senedi çözüm (X-gal) (50 mg/mL) C 14 H 15 BrClNO 6 C 3 H 7 X-gal toz çözülerek hazırlamak yok (dimethylformamide, DMF).</li>
		<li>Mağaza K 3 Fe(CN) 6 ve K 4 Fe(CN) 6 çözüm 4 ° C'de ve dik, MgCl 2 
		Not: X-gal-20 ° C'de aliquot en fazla 6 ay saklanabilir. Eozin çözüm RT muhafaza ve gerekirse süzme sonra yeniden kullanılabilir. K 3 Fe(CN) 6 ve K 4 Fe(CN) 6 çözümleri protectedfromthe ışık vardır. X-gal çözüm suda sabit değil ve ışıktan korunması gerek.</li>
	</ol></li> <li>MicroRNAs boyama için hazırlanması çözümleri: %0,1 Na 3 C 6 H 5 O 7 (TRISODYUM sitrat), %0,1 C 14 H 22 O permeabilization çözüm içeren (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) distile su içinde hangi depolanması gereken 4'te ° C. RT. depolanan fosfat tamponlu tuz (PBS), % 5 fetal sığır serum (FBS) içeren engelleme çözüm hazırlamak</li>
</ol> 2. SA-β-Gal Staining TA kas bölümünde donmuş <ol><li>fiksasyon malzeme TA kas için tragacanth küçük bir miktar koyarak bir dilim mantar sakıza hazırlayın.</li>
	<li>Yaralandı fareler her iki cinsiyette (2 ay eski, C57/B6) cardiotoxin (CDX) ile 10 gün önce 13 daha önce açıklandığı gibi yaralandı. Aynı fare (PBS enjeksiyon) TA sigara yaralı negatif kontrol kullanın. Vivo yeniden programlama isterseniz, her fare Dox (1 mg/mL) ile içme suyu (ışıktan korunan), aynı gün şu CTX yaralanma sonra tedavi. 
	Not: Dox çözüm 3 günde toplam tedavi süresi 7 gün için değiştirilmesi gerekir.
	<ol><li>( şekil 1A) 13 daha önce açıklandığı gibi fare (yaralı ve kontrol) her iki TA kasları izole. Transvers kesitler sağlamak, TA kas distal tendon tragacanth sakız yerleştirin ve kas ( şekil 1B) dışında yaklaşık ¾ bölümünü terk ve doğrudan sıvı azot içinde dondurmak için isopentane için soğutmalı &#60; 1 min. 
		Not: dik bir pozisyonda ve mantar ortasına TA kas olduğundan emin olun. Örnekleri-80 ° C veya doğrudan cryosectioned 10 µm bölümlerinde depolanan.</li>
	</ol></li> <li>TA kas şekil 1B adımında açıklandığı gibi işlemek.
	<ol><li>Dağıt 1 st -10 inci bölümler her slaytın üst sol konumunda on farklı slaytlar üzerine doğru sırada. 11 inci Bölüm 1 st bölümüne bitişik ilk slaytta yer; 12 inci bölüm sağ yanı sıra ikinci slayt 2 nd bölümüne yerleştirilmesi için aynı sırada takip edecek. 10 bölümleri/slayt elde edilir kadar on slaytlar (toplamda 100 bölümleri) için ilk ve son bölümleri arasındaki mesafe en az 1 mm emin olmak için bu işlemi yineleyin.</li>
	</ol></li> <li>4 dk %1 paraformaldehyde ve % 0.2 oxazolidin içeren PBS için bölümleri düzeltmek. PBS, 2 x 10 dk ile yıkayın. Ardından, PBS bölümlerde kuluçkaya (pH 5.5 =) için 30 dk. RT., tüm adımları 
	Not: Fiksasyonun enzimatik aktivite korumak için hafif olmak zorunda. Başlık altında bu adımı gerçekleştirin. PBS pH önemlidir ve X-gal çözüm ışıktan korunmalıdır.</li>
	<li>X-gal solüsyon içeren içinde Incubate bölümler: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 ve 400 µg/mL X-Gal PBS, pH 5.5 =. Karanlıkta 24 h yıkama en az 37 ° C'de 3 x 10 min, dik, PBS, slaytlarla kuluçkaya 
	Not: Kuluçka en az 24 saat gerektirir ve SA-β-Gal sinyal en üst düzeye çıkarmak 48 saat sürebilir. Çözüm kuluçka 24 saat sonra değiştirilmesi gerekiyor. Slaytları ışıktan korunmalıdır. Eğer sadece SA-β-Gal boyama isteniyorsa, 2.5 adımla devam edin. MicroRNAs ile birlikte boyama isterseniz, lütfen ileri 3.1 FrameRelay.</li>
	PBS içinde <li>düzeltme slaytlar %1 paraformaldehyde 30 dk yıkama için PBS ile 3 x 10 dk. Counterstain % 0,2 Eozin ile slaytlar. Eozin çözüm 1 dk. için slaytları bırakın ve kısaca distile su ile yıka. Son olarak, sulu Floresanda montaj orta slaytlarla mount (Tablo malzemeleri görmek). 
	Not: Sonrası fiksasyon gerçekleştirmek için önemlidir. Başlık altında bu adımı gerçekleştirin. Tüm adımlar RT. gerçekleştirilir</li>
</ol> 3. İmmünhistokimya kullanarak Anti-MicroRNAs antikor <ol><li>%4 paraformaldehyde için 10 dk. yıkama ile PBS, 2 x 10 dk. eklemek 200 µL slayta doğrudan permeabilization çözüm içeren PBS ile slaytlar düzeltmek ve 5 min için kuluçkaya. <ol><li>Yıkama slaytlar PBS, 2 x 5 min ve son yıkama, kullanım 200 µL PBS % 0.25 BSA doğrudan slaytlarda içeren. Dik, tüm bu adımları gerçekleştirmek 
		Dikkat: başlık altında fiksasyon adımıysa.</li>
	</ol></li> <li>Incubate slaytlar ile birincil anti-MicroRNAs antikor (son konsantrasyonu: 1,25 ug/mL) % 5 içeren PBS 4 ° C'de gecede FBS. PBS, 2 x 10 dk ile slaytlar yıkama ve son makinaya kullanım 200 µL PBS % 0.25 BSA 5 dk. gerçekleştir içeren tüm çamaşır dik adımlar 
	Not: buharlaşma önlemek için ıslak kağıt havlu ile bir kutu içindeki slaytları kuluçkaya.</li>
	RAb-HRP ikincil antikor 100 µL ile <li>Incubate slaytlardan kullanıma hazır kit (Tablo malzemeleri görmek) 45 dk. yıkama için PBS ile 3 x 5 dk, slaytlar için ikincil antikor kaldırın. Işıktan koruma ile RT, tüm adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Görselleştirme <ol><li>ilk olarak, 3,3 seyreltik &#39;-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) substrat arabelleği kit (1 mL substrat tampon çözeltisi için DAB, 20 µL) kullanıma hazır tarafından sağlanan. Her slayda doğrudan DAB çözeltinin 100 µL ekleyin ve en fazla 10 dk RT. az kuluçkaya 
		Not: Seyreltilmiş DAB çözüm taze hazırlanmalı ve en fazla bir hafta 4 ° C'de depolanan Kuluçka süresi arka plan sinyal en aza indirmek için ayarlanabilir ama için tüm slaytlara aynı tutulmalıdır.</li>
		<li>Su ile durulama tarafından DAB çözüm kaldırın. Hızlı kırmızı çözüm (hazır kullanmak için Tablo reçetesi görmek) slaytlarla 20 dk. yıkama su kaydıraklı tekrar kısaca counterstain.</li>
		<li>Onları % 95 etanol için 5 m ile kurutmakBuna % 100 etanol tarafından 2 x 5 dk kadar takip ettim. Son olarak, hızlı sağlamlaştırma montaj orta slaytlarla mount (Tablo malzemeleri görmek).</li>
		<li>Gözlemlemek slayt arka plan önlemek için 20 X parlak alanındaki mikroskop altında. 
		Not: Hızlı kırmızı çözüm olabilir RT muhafaza ve süzme sonra yeniden kullanılan.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analiz ve miktar <ol><li>SA-β-Gal miktar <ol><li>slaytları inceden inceye gözden geçirmek ve elde edilen görüntüleri baz alınarak her bir slayt üzerinde en iyi bölümleri seçin. En az 2 bölümler/TA miktar için kullanın. Bölüm yargıç &#39; s Kalite tabanlı üzerinde doku bütünlüğü, boyama ve kalitesini counterstaining. Miktar için SA-β-Gal miktar tüm TA kas boyunca daha iyi gösterimini sağlar maksimum olası mesafe örnekleri arasında iki yüksek kaliteli bölümlerle seçin.</li>
		<li>Miktar SA-β-Gal pozitif hücrelerinin ( Şekil 2).
		<ol><li>Belirleme piksel boyutunu el ile en küçük ve en büyük pozitif SA-β-Gal hücreleri seçerek sırası.
			<ol><li>ImageJ yazılım kullanarak taranmış slayt dijital görüntü açın.</li>
				<li>Arabirim içinde tıklatın &#39; analiz &#39; &#62; &#39; araçlar &#39; &#62; &#39; ROI Yöneticisi &#39; &#62; &#39; analiz &#39; &#62; &#39; ayarla ölçüm &#39; &#62; &#39; alan seçin &#39;. Seçim aracını kullanın ve surround en küçük ve en büyük pozitif SA-β-hücre ve yatırım Getirisi müdürüne yanında tıkırtı üstünde eklemek Gal &#39; Ekle &#39;. Kullanarak boyutlarını ölçmek &#39; ölçü &#39; düğme ve değerleri daha sonra kullanmak için kaydetmek.</li>
			</ol></li> <li>Görünür pozitif hücreler seçilir emin olmak için eşik değerin ayarlanmasını.
			<ol><li>Convert tıklayarak gri tonlama için görüntü &#39; görüntü &#39; &#62; &#39; türü &#39; &#62; &#39; 8-bit &#39; ( şekil 2A). Daha sonra gitmek &#39; resim &#39; &#62; &#39; ayarla &#39; &#62; &#39; eşik &#39;, tüm olumlu SA-β-Gal hücreleri kırmızı ( şekil 2B) ile kaplıdır kadar ikinci ele alalım, o zaman tıkırtı &#39; Uygula &#39;.</li>
				<li>Tıklatarak analiz parçacıklar &#39; analiz &#39; &#62; &#39; parçacıklar analiz &#39; &#62; &#39; boyutu (piksel ^ 2) &#39; ve 4.1.2.1. adımda tanımlanan değeri uygulamak, girin &#39; Döngüsellik &#39;: &#39; 0.00 1.00 &#39;,'ı tıklatın &#39; tamam &#39;; a özet-in tüm sayılan parçacıklar ( şekil 2B) ROI Yöneticisi'nde gösterilir.</li>
			</ol></li> <li>Tüm seçili parçacıklar özgün görüntü aktarmak. El ile doğru miktar emin olmak için seçim ayarlayın. Pozitif hücrelerinin (Yeşil ok, şekil 2E) eklemek ve/veya yanlış pozitif hücre (kırmızı ok, şekil 2E) kaldırma. Son olarak, tedbir alan bölümü ( şekil 2B) kullanılarak özetleyen tarafından &#39; seçim aracını &#39;. ' I tıklatın &#39; ROI Yöneticisi &#39; &#62; &#39; Ekle &#39; &#62; &#39; ölçü &#39;.</li>
			<li>Önemlisi, bölüm alanı tarafından pozitif hücre sayısı normale.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>MicroRNAs miktar <ol><li>parlak alanını el ile 20 X büyütme, mikroskop altında MicroRNAs pozitif hücreleri saymak. 
		Not: Hızlı kırmızı counterstaining iyi değerlendirilmesi TA kas morfolojisi sağlar. Ancak, boyama çok hafif ve bölümün Seviyelendirmeyi Temizle'yi yoksun. Tarayıcı kez bölümleri kenarlığını tanımlamak başarısız olur ve doğru odak olamaz. Taramadan önce bölümleri kenarlarını daire veya bölüm algılamak için daha duyarlı bir tarayıcı kullanmak için işareti kullanmak mümkündür. Geçerli iletişim kuralı için el ile MicroRNAs pozitif hücreleri saymak en verimli yoldur.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+p16(Ink4a)-positive+cells+shorten+healthy+lifespan.">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype:+the+dark+side+of+tumor+suppression.">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li><li>Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+turnover+of+senescent+cells+during+regeneration+of+a+complex+structure.">Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+senescent+cells+in+optimal+wound+healing+through+secretion+of+PDGF-AA.">An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li><li>Mosteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+and+senescence+provide+critical+signals+for+cellular+reprogramming+in+vivo.">Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo.</a> Science. 354 (6315), (2016).</li><li>Chiche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-Induced+Senescence+Enables+In+Vivo+Reprogramming+in+Skeletal+Muscle.">Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li><li>Ritschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype+induces+cellular+plasticity+and+tissue+regeneration.">The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration.</a> Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Abad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+in+vivo+produces+teratomas+and+iPS+cells+with+totipotency+features.">Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features.</a> Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).</li><li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation.">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li><li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Acute+Skeletal+Muscle+Regeneration+by+Cardiotoxin+Injection.">Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+is+required+to+prevent+p53-dependent+senescence+following+skeletal+muscle+injury.">Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury.</a> Nat Commun. 6, 8528 (2015).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence?.">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?.</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li><li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SA+beta+Gal+staining:+biomarker+or+delusion.">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada, senescent her ikisi de algılamak için bir yöntem ve pluripotent kök hücre içinde Bilişim farelerin kas iskelet mevcut. Bu yöntem değerlendirmek ve her iki yaşlanma ölçmek ve hücresel plastisite vivo içindeikna etmek ve yaşlanma doku onarımı ve rejenerasyon rol incelemek için kullanılabilir.
Geçerli protokol, yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-Gal) tahlil içinde vivo senescent hücreleri kas iskelet algılamak için kullanılır. Bu tahlil ...

Hücresel yaşlanma stres yanıt istikrarlı hücre döngüsü tutuklama tarafından karakterize bir şeklidir. Son on yıl içinde araştırma sıkıca yaşlanma embriyonik geliştirme, fibrozis ve1,2yaşlanma organizma da dahil olmak üzere çeşitli biyolojik ve patolojik işlemlerle ilişkili olduğunu kurmuştur. Hücresel yaşlanma ilk3kısalma telomer tarafından tetiklenen ikileştirici onların ömrü sonundaki insan fibroblast tespit edilmiştir. İkileştirici stres yanı sıra, yaşlanma, DNA hasarı, oksidatif stres, oncogenic sinyalleri ve genomik/epigenomic değişiklikler, herhangi biri sonunda p53/p21 ve/veya pRB yolları etkinleştirebilir gibi neden olabilir birçok çekim gücü vardır kurmak ve kalıcı büyüme tutuklama1güçlendirmek. Senescent hücreleri önemli özelliklerinden biri olan metabolik olarak aktif kalır ve sağlam bir yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP) hızlı: salgısı birçok inflamatuar sitokinlerin, büyüme faktörleri ve hücre dışı matriks faktör4. SASP faktörler arabuluculuk ve bağışıklık hücreleri çeken ve yerel ve sistemik doku ni1değiştiren güçlü etkileri nedeniyle yaşlanma etkisi yükseltecek önemli bir rol oynamak için önerilmiştir. İlginçtir, yaşlanma son zamanlarda doku onarımı ve yenilenme için5,6önemli olmak teklif edildi. Buna ek olarak, veri--dan bizim de dahil olmak üzere birkaç labs doku zarar indüklenen yaşlanma SASPs yenilenme7-9tanıtmak için üzerinden hücresel plastisite geliştirmek önerdi. Bu nedenle, tüm gelişmekte olan verileri yaşlanma içinde vivoeğitim önemini vurgulayın.
Yazı İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC) dönemde, hücresel plastisite bir hücrenin yeni bir kimlik edinme ve farklı uyaranların her iki kültür ve in vivo10maruz alternatif bir kader benimsemeye kapasitesidir. Tam yeniden programlama elde vivo içinde11,12, olabilir bilindiği nerede ifade dört Yamanaka faktör içeren kaset: Oct4, Sox2, Klf4ve c-Myc (OSKM) indüklenen vivo içinde birden fazla organ teratomas oluşumu teşvik olabilir. Bu nedenle, bir etiketteki fare modeli (i4F) güçlü bir sistemi kritik düzenleyiciler ve hücresel plastisite11için önemli yollar tanımlamak için kullanılabilir.
Uygun ve hassas vivo içinde sistem nasıl hücresel yaşlanma anlamak önemlidir doku rejenerasyonu bağlamında hücresel plastisite düzenler. Burada, sağlam bir sistem ve yaşlanma ve doku rejenerasyonu bağlamında hücresel plastisite arasındaki bağlantıyı değerlendirmek için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Cardiotoxin (CTX) indüklenen kombinasyonu kas hasarı Tibialis Anterior (TA) kas grubunda, doku rejenerasyonu ve i4F fare modeli çalışmaya iyi kurulmuş bir sistem hücresel yaşlanma ve içinde vivo algılanmasını sağlar kas yeniden oluşturma işlemi sırasında yeniden programlama.
Hücresel plastisite ile yaşlanma arasında bağlantı değerlendirmek için i4F fare CTX ile akut kas hasarı ikna etmek için yaralı ve in vivo yeniden programlama ikna etmek için Doksisiklin ile (0.2 mg/mL) 7 gün boyunca tedavi. Bir CTX akut kas hasarı indüklenen ve rejenerasyon Protokolü son yayınlanan13, etik nedenlerle oldu iken, bu yordamı geçerli iletişim kuralında atlanacak. Senescent hücreleri zirvesine daha önce gözlemlenmiştir ne zaman14TA kas örnekleri 10 gün sonrası yaralanma13' toplanacak. Burada, bu ayrıntılı protokolünü yaşlanma (yolu ile SA-β-Gal) düzeyini ve programlama (via IHC MicroRNAs boyama) değerlendirmek için gerekli olan adımları açıklar.
Yaşlanma ile ilişkili beta-galaktozidaz (SA-β-Gal) tahlil senescent hücreler kültür ve in vivo15içinde algılamak için en sık kullanılan tahlil olduğunu. Diğer deneyleri için karşılaştırıldığında, SA-β-Gal tahlil için in vivo çalışmada özellikle önemlidir sağlam doku mimarisi ile yerel onların ortamında senescent hücreleri tanımlaması sağlar. Ayrıca, SA-β-Gal tahlil IHC kullanarak diğer işaretleri ile çift mümkündür. Ancak, SA-β-Gal tahlil örnekleri, taze veya dondurulmuş olan büyük bir sınırlama kalır gerektirir. Donmuş TA kas numuneler gibi taze veya dondurulmuş dokular düzenli olarak kullanılabilir olduğunda, SA-β-Gal belli ki senescent hücreleri algılamak için en uygun tahlil olduğunu. MicroRNAs olduğunu reprogramed hücreleri iki nedenden dolayı algılamak için kullanılan işaretleyici: 1) pluripotency için; temel bir işaretleyicidir 2) daha da önemlisi, onun ifade Doksisiklin (dox) tarafından tahrik değil, bu nedenle Yamanaka kaset zorla ifade yerine İndüklenmiş Pluripotent algılar.
Bu çalışmada sunulan boyama iletişim kuralları ayrı ayrı miktar yordamı kolaylaştırmak için yapılan, ama da senescent her ikisi de görselleştirmek için ortak boyama bir yordam ve pluripotent kök hücreler aynı bölümünde yapılabilir unutmamak önemlidir.

<table><tbody><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>For inducing in vivo reprogramming</td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Lotaxan Valence, France</td><td>L8102</td><td>For muscle injury</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron microscopy science</td><td>50-980-487</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>NaCitrate : &lt;br/&gt;Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>Antibody anti- Nanog</td><td>Cell signalling</td><td>8822S</td><td>Rabbit monoclonal antibody</td></tr><tr><td>EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>For Nanog revelation</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Fast red</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher scientific</td><td>9990402</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt&amp;reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Microscope for Nanog quantification</td></tr><tr><td>Mouse: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>Reprogrammable mouse model</td></tr><tr><td>Skeletal muscle, Tibialis Anterior</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>slides scanning</td></tr></tbody></table>

evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle

Hücresel yaşlanma kanser ve yaşlanma gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçler için önemlidir istikrarlı hücresel büyüme krizi ile karakterize bir stres yanıttır. Son zamanlarda, yaşlanma Ayrıca doku onarımı ve rejenerasyon karıştığı olmuştur. Bu nedenle, senescent hücreleri vivotanımlamak için giderek kritik haline gelmiştir. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-Gal) tahlil senescent hücreleri hem de kültür ve in vivoalgılamak için en çok kullanılan tahlil olduğunu. Bu tahlil senescent hücreleri artan lizozomal içeriğinde lizozomal β-galaktozidaz faaliyet histochemical algılanması suboptimum pH (6 veya 5.5) sağlayan temel alır. Akış Sitometresi gibi diğer deneyleri ile karşılaştırıldığında bu doku mimari, Morfoloji, ilgili konumu gibi değerli bilgiler sunan ikamet çevreleri senescent hücrelerde tanımlaması sağlar ve Kaplin immünhistokimya (IHC) üzerinden diğer imleçli olasılığı. Büyük SA-β-Gal tahlil taze veya dondurulmuş örnekler şartı kısıtlamasıdır.
Burada, nasıl hücresel yaşlanma anlamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut hücresel plastisite ve doku rejenerasyonu içinde vivoteşvik etmektedir. SA-β-Gal senescent hücreleri iskelet kas doku rejenerasyonu çalışmaya köklü bir sistemdir yaralanma üzerine algılamak için kullanır. Ayrıca, IHC MicroRNAs, bir işaretleyici pluripotent kök hücrelerin bir transgenik fare modelinde algılamak için kullanır. Bu iletişim kuralı incelemek ve hücresel yaşlanma indüklenen hücresel plastisite ve in vivo yeniden programlama bağlamında ölçmek sağlar.

Kas yaralanması indüklenen hücresel yaşlanma algılama
Son zamanlarda kas yaralanması geçici hücresel yaşlanma14indükler kanıtlanmıştır. 10 gün sonrası yaralanma (DPI), bozuk myofibers çoğunluğu yenilenme merkezi konuma sahip çekirdeklerin, myofibers, yenileyici bir hallmark ile geçiren ve kas mimarisini yeniden kurulur. İnfiltrating inflamatuar hücrelerin belirli bölgelerde görünür...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle at JoVE.com

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Burada senescent her ikisi de algılamak için detaylı bir protokol ve pluripotent kök hücre iskelet kas üzerine vivo içinde yeniden programlama inducing sırasında yaralanma mevcut. Bu yöntem doku yeniden oluşturma işlemi sırasında hücresel yaşlanma rolünün değerlendirilmesi ve in vivoyeniden programlama için uygundur.

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

9.5K Görüntüleme.  Institut Pasteur. Burada senescent her ikisi de algılamak için detaylı bir protokol ve pluripotent kök hücre iskelet kas üzerine vivo içinde yeniden programlama inducing sırasında yaralanma mevcut. Bu yöntem doku yeniden oluşturma işlemi sırasında hücresel yaşlanma rolünün değerlendirilmesi ve in vivoyeniden programlama için uygundur.

Video: Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

İskelet Kas Rejenerasyonu Sırasında Kardiyotoksin Yaralanması ve Kendi Kendine Teslim SiRNA In Vivo Enjeksiyonu Sırasında Uydu Hücre Fonksiyonuanalizi

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

Genetik

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Uygulamaları<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biyomühendislik

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new muscle fibers under the right conditions. Although SCs can be harvested from muscle tissue and cultured in vitro, the resulting myoblast cells are not very effective in promoting myogenesis when transplanted into host muscle. Surgically exposing the host muscle and grafting segments of donor muscle tissue, or the isolated muscle fibers with their SCs onto host muscle, promotes better myogenesis compared to myoblast transplantation. We have developed a novel technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME). MIME involves passing a surgical needle through the host muscle, drawing a piece of donor muscle tissue through the needle track, and then leaving the donor tissue embedded in the host muscle so that it may act as a source of SCs for the host muscle. Here we describe in detail the steps involved in performing MIME in an immunodeficient mouse model that expresses a green fluorescent protein (GFP) in all of its cells. Immunodeficiency in the host mouse reduces the risk of immune rejection of the donor tissue, and GFP expression enables easy identification of the host muscle fibers (GFP+) and donor-cell-derived muscle fibers (GFP-). Our pilot data suggest that MIME can be used to implant an extensor digitorum longus (EDL) muscle from a donor mouse into the tibialis anterior (TA) muscle of a host mouse. Our data also suggest that when a myotoxin (barium chloride, BaCl2) is injected into the host muscle after MIME, there is evidence of donor-cell-derived myogenesis in the host muscle, with approximately 5%, 26%, 26% and 43% of the fibers in a single host TA muscle showing no host contribution, minimal host contribution, moderate host contribution, and maximal host contribution, respectively.

Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

We describe a novel experimental technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME), which is based on the evidence that skeletal muscle tissue contains viable myogenic cells that can facilitate donor-cell-mediated myogenesis when implanted into a host muscle.

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

Tıp

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Biyoloji

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

Kök hücreleri ve nişlerini kültürlemek için fare iskelet kasının toplanması

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

Yazar Spotlight: Niş Bileşenlerle Hareketsiz Kas Kök Hücrelerini Kültürlemek için Ex Vivo Protokolü 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

İskelet Kas Rejenerasyonu Sırasında Kardiyotoksin Yaralanması ve Kendi Kendine Teslim SiRNA In Vivo Enjeksiyonu Sırasında Uydu Hücre Fonksiyonuanalizi

Uygulamaları

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü