Name: minimally invasive muscle embedding (mime) - a novel experimental technique to facilitate donor-cell-mediated myogenesis
Uploaded: 2017-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis at JoVE.com

Bu eser bir Pilot Grant tarafından İttifak'ın rejeneratif rehabilitasyon araştırma ve eğitim (AR3T) ve öğretim başlangıç paketi için Wayne State Üniversitesi kavanoz için mümkün yapıldı. AR3T Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan geliştirme (NICHD), sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü, Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NIBIB tarafından desteklenmektedir ), Ulusal Ödülü numarası P2CHD086843 altında sağlık Enstitüleri. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

canlı hayvanları içeren tüm çalışmaları kurum hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Wayne State Üniversitesi, Detroit, Michigan, ABD, tarafından onaylanır ve uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanlarının (için rehber olarak vardır 8 edition, 2011, ulusal akademiler Press tarafından 500 beşinci Yayınlanan Street, NW, kasa 285, Washington, DC 20055, ABD). Onaylı IACUC protokolleri başı olarak, ağrı ve/veya sıkıntı içeren yordamlar indüklenen ve isoflurane inhalasyon (etkisi % 1,5-5) tarafından tutulan genel anestezi altında yapıldı. Anestezi doğrulanmadı çimdik baştan aşağı çekilmesi eksikliği ve palpebral eksikliği tarafından veya vibrissae yanıt (isoflurane yüzdesi artış oldu etkisi korumak için gerektiğinde). İletişim kuralları, minimal invaziv doğası gereği bir &#34; steril ipuçları &#34; Teknik takip edildi. Hayvanları anestezi altında iken, vazelin kuruluğu önlemek için gözler için uygulandı. Hiçbir özel tedaviler gerekli idi; Ancak, diyet jel hayvanlar için 24 h genel anestezi. araştırmacı prosedürü cerrahi ana açığa kapsamamaktadır beri MIME, takip analjezi saklamayı IACUC tarafından onaylanmıştır ilgili yordamı için sağlanan kas, çünkü o bir hindlimb için sınırlı olduğunu ve normal işlevini etkilemez ve birçok ortak analjezik ilaç normal kas rejenerasyon etkiler bilinmektedir çünkü. 1. Hayvan modelleri <ol><li>ana bilgisayar fareler için MIME <ol><li>konukçu kullanım NSG-GFP fareler (8-10 hafta, erkek) kas için greft çalışmalar. 
		Not: çünkü onlar Olgun T ve B lenfositler ve fonksiyonel doğal katil hücrelerin eksikliği, sitokin sinyal eksik ve başkaları tarafından allografting veya ksenografi olmayan kas hücreleri için kullanılan allojeneik kas greft için bu fareler ideal ev sahibi vardır 14. Her yerde GFP ifade sağlar ana bilgisayar (GFP +) ve (GFP-) kas lifleri donör-hücre kaynaklı kolay tanımlanması için.</li>
	</ol></li> <li>Donör fareler için MIME <ol><li>Kullanım C57BL/6J fareler (12-16 hafta) olarak donör fareler. 
		Not: çünkü onlar tam olarak eşlenen genom var, herhangi bir kas iskelet patoloji olduğu bilinmektedir değil, kolayca kullanılabilir ve ekonomik ve GFP ifade edemediği bu fareler uygun donör farelerin karışıyor.</li>
	</ol></li></ol> 2. Donör kas dokusunun hazırlanması <ol><li>bağlayan yol gösterici dikişler ve hasat donör Edi kas <ol><li>ötenazi servikal çıkması ve bir masa tarafından yönetilen genel anestezi altında gerçekleştirilen Torakotomi tarafından donör fareler tıbbi oksijen (inhale isoflurane; etkisi % 2-5) tarafından tahrik isoflurane Buharlaştırıcı.</li>
		<li>Edi kasları erişmek için deri bacak ön yüzey üzerinde açmak için Cerrahi makas kullanın. TA kas ön bacak bulmak ve çıkarmak o TA kas yer alan Edi kas görselleştirmek için. Forseps Edi kas arkasında bir çift ucu slayt ve nazik çekiş ayak uzatmak Eğer görmek için geçerlidir (Bu kas Edi olduğunu onaylar). &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Not: donör doku alan cerrahi olarak, hasat için aseptik hazırlandı önceki olmalıdır.</li>
		<li>Kullanımı ~ 10 cm kesimleri 4-0 ipek, örgülü, absorbe olmayan, steril dikiş ve yol gösterici dikiş Edi kas proksimal ve distal tendon uygulamak için yapmak iki kişilik deniz mili. ( şekil 1A).</li>
		<li>Distal Edi tendon kesmek, EDL kas yansıtmak ve proksimal tendon kesti.</li>
		<li>Donör Edi kasları bir kabında yer fare zil çözüm ile dolu.</li>
	</ol></li></ol> 3. Ana bilgisayar fare MIME için hazırlık <ol><li>anestezi <ol><li>yer ana bilgisayar fare (inhale isoflurane; 1,5-%5 etkisi) tıbbi oksijen tarafından yönlendirilen bir masa üstü isoflurane Buharlaştırıcı tarafından yönetilen genel anestezi altında.</li>
		<li>Anestezi indüksiyon odasında teşvik ve sonra hayvan üzerinde diğer yordamları gerçekleştirirken anestezi korumak için bir burun konisi için fareyi aktarın. Hayvan anestezi altında iken yastık Isıtma izotermal bir jel ile termal destek.</li>
	</ol></li> <li>Cilt hazırlık <ol><li>hayvan kaldırmak için &#39; s kürk, sol arka bacak ön yönü üzerinde depilatory bir krem uygulayın. Sonraki yordamlar için bir denetim bacak sağ bacak görür.</li>
		<li>Bırak üzerinde depilatory krema için 2 dk. temiz depilatory krem ile birlikte müstakil kapalı kürk fosfat içinde batırılmış mendil ile serum fizyolojik (PBS) arabelleğe alınmış. Kürk kaldırıldıktan sonra üç alternatif mendil povidone-iyot temizlik çözüm ve % 70 etanol ile cildinizi fırçalayın.</li>
	</ol></li> <li>Bir iğne parça konak TA kas oluşturma <ol><li>ana Merkezi aracılığıyla bir 18'lik (1 içinde uzun) cerrahi iğne TA kas kas boyunca geçmek &#39; s uzun eksen ( şekil 1B). İğne TA kas ve kas göbek ( şekil 1B) Merkezi aracılığıyla uzunluğu boyunca bir cephalo Kaudal yön geçirin. 
		Not: Bu adımın amacı donör kas parçası içine gömülü olabilir bir iğne parça oluşturmaktır. Donör doku TA kas ortasına katıştırma olanak sağlayabilecek geçirin ve myogenesis tüm ana bilgisayar arasında kolaylaştırmak için donör dokusundan SCs TA kas.</li>
	</ol></li> <li>Konak TA kas iğne izini katıştırma donör doku <ol><li>cerrahi iğne konak TA kas içinde olduğunda, bir donör doku ile cerrahi iğnede Lümen ucundaki yol gösterici dikiş geçmek bir caudo Sefalik yön ( şekil 1 c).</li>
		<li>İğne konak TA kas caudo Sefalik yönde üzerinden çekilmiş olarak donör doku ile iğne parça çizmek.</li>
		<li>Yol gösterici dikiş donör doku Kaudal ve Sefalik ucunda donör doku yerleşimini ayarlamak için kullanın. Donör doku konak TA kas ( şekil 1 d) içinde yerleşmişti olun.</li>
		<li>Sonra donör doku yerleşimi en iyi duruma getirilmiş, yol gösterici dikiş, kesim herhangi bir son donör doku yerleşim ince uçlu Forseps ile ayarlamalar.</li>
		<li>Mühür Kutanöz iğne yaralar ( şekil 1E -F) yara kenarına Forseps ile yaklaşıldığıdır ve hayvan hastalıklarıyla ilgili doku yapıştırıcı 27 lik cerrahi bir iğne ucu ile uygulayarak.</li>
	</ol></li></ol> 4. Neden uyumlu kas dejenerasyon ve yenilenme için kas içi Myotoxin enjeksiyon <ol><li>sonra MIME, 50-60 µL % 1.2 BaCl 2 (myotoxin) ana kas kapsamlı kas lif hasar ikna etmek için ev sahibi TA kas içine enjekte ve donör doku içinde gömülü 15.
	<ol><li>Enjekte BaCl 2 konak TA uzunluğu boyunca 3 sitelerdeki kas (orta proksimal ve distal 1 / 3'kas göbek). 
		Not: myotoxins BaCl 2, cardiotoxins ve notexin gibi iskelet kas içine enjekte rejenerasyon 16 tarafından takip uyumlu kas lif hasar neden olmaktadır.</li>
	</ol></li></ol> 5. Sonrası yordam hayvan bakım <ol><li>sonra MIME ve BaCl 2 enjeksiyon, temiz ana bilgisayar fare &#39; s sol arka bacak ile etanol ve Vazelin cildi korumak için ince bir tabaka uygulayın.</li>
	<li>Sonrası yordam Cilt Bakımı sonra ana bilgisayar fare burun konisi kaldırmak.</li>
	<li>Yatak olmadan yalnız kurtarma kafeste fareyi getirin. İzotermal jel Isıtma yastığını aracılığıyla kurtarma hayvan için termal destek yerleştirilmiş küçük kurtarma kafes yarısı sağlamak. 
	Not: Bir yarısı değil ısıtmalı o hayvanı uzak Isıtma yastığını gerekirse hareket edebilir böylece.</li>
	Ana bilgisayar fare tamamen anesteziden dönüş hayvan için orijinal onun kafes kurtarıldı sonra <li>. İzleme denemeleri yapılmaktadır kadar hayvan arkadaki Hayvan tesiste koyun. İzlenmek üzere hazır olması ne kadar ana bilgisayar fare her gün izlemek &#8211; örnek: 3 veya 14 gün sonrası MIME adlı. MIME, hayvanlar izlenir laboratuar personeli tarafından de hayvan hastalıklarıyla ilgili personel tarafından &#8211; bu esas olarak hayvanlar parlak, uyarı ve duyarlı; ise değerlendirme içerir ve hayvanlar açık ağrı belirtileri gösteriyor veya taşıma, besleme, içme ve damat zorluk yaşıyorsanız Ayrıca değerlendirirken.</li>
</ol> 6. Doku koleksiyonu <ol><li>hasat ana kas <ol><li>ötenazi servikal çıkması ve tahrik tıbbi oksijen () tarafından bir masa üstü isoflurane Buharlaştırıcı tarafından yönetilen genel anestezi altında gerçekleştirilen Torakotomi tarafından ana bilgisayar fare inhale isoflurane; etkisi % 2-5). araştırmacı da hasat TA kaslara önce ötenazi. genel anestezi altında IACUC onayı vardır</li> <li>konak TA kas erişmek için Cerrahi makas deri bacak ön yüzey üzerinde açmak için kullanın. TA kas ön bacak bulun, distal tendon kesmek, kas yansıtmak ve proksimal kas ekleri (bakınız Bölüm 2.1) kesti.</li>
		<li>(Deneysel) sol ve sağ (kontrol) TA toplamak kaslar.</li>
	</ol></li> <li>Dondurucu hasat kasları snap <ol><li>yanında duvar ilanı hasat kasları tartmak kağıt tartmak ve ölçek ağırlığında.</li>
		<li>Kısa bir süre mineral yağ cryoprotection için kasları daldırma. Leke aşırı yağ.</li>
		Alüminyum folyo ve ek <li>yer kaslar kaslar tarafından hızlı bir şekilde onları sıvı azot içinde bir Dewar dolu çeker dondur. Örnekleri etiketli cryovials aktarın ve daha sonraki araştırmalar-80 ° C dondurucuda örnekleri depolayın.</li>
	</ol></li></ol> 7. Histolojik çalışmaları <ol><li>Cryosectioning kas dokusu seri kesitleri toplamak için <ol><li>örnekleri-80 ° C dondurucudan bir cryostat için sıvı azot içeren bir Dewar yerleştirerek Transfer.</li>
		<li>Cryostat bir örnek teker teker ele. Soğuk jilet ile (cryostat içinde depolanan bıçak), iki kez, 1-2 mm kalınlığında kas bir parçasını üretmeye TA kas orta göbek örnek kesti. Cryostat bölümleri yapmak için bu Segmentte tutmak ve kas kalan bölümlerini kendi cryovial için iade.</li>
		<li>Bileşik buz gibi optimum kesim sıcaklık ile (OCT), doku cryostat numune diske kalın parçasını güvenli. Örnek disk yer numune tutucu üzerinde.</li>
		<li>Kaba-yüz kesme 20 µm bölümler örnek. Cam slaytlara cryostat bölümler için bir kaç 20 µm bölümlerde toplamak.</li>
		<li>Kalitesi 20 µm bölümlerinin yeterli, değilse kesme kalınlığı 5 mikron değiştirmek ve kalitesini değerlendirmek için birkaç bölümlerde toplamak. 5 µm bölümler kalite tatmin edici ise, seri bölümler toplamak. Slayt başına 2-3 bölüm toplamak ve 3 slayt için yeterli bölümleri toplamak.</li>
		<li>Deneysel (sol) ve denetim (sağda) TA kas her hayvan--dan bölümler toplamak.</li>
	</ol></li> <li>Okuyan GFP ifade Not: kas lifleri GFP ifadede çalışmaya hazırlıklı slaytların (Bölüm 7.1) bir seti belirtmek.
	<ol><li>~ 50 µL Anti-fade orta bölümlerinde uygulamak ve bir cam coverslip uygulayın. Coverslip kenarları açık oje ile mühür.</li>
		<li>Hafif ve floresan mikroskop kullanarak (bkz. Tablo malzemeler), 10 X amaç ve GFP görüntülenmesi için uygun bir filtre bölümlerle çalışma.
		Çakışan alanları tüm kesit TA kas karşılamak için visual <ol><li>toplamak dijital görüntüler (~ 15). Faz kontrast görüntüler visual alanların her biri için faz kontrast tarz üstünde mikroskop Floresans geçerek toplamak.</li>
		</ol></li> <li>Tek bir bileşik görüntü; üretmek için tek tek görüntüleri döşeyebilirsiniz uygun görüntüleme yazılımı ile görüntüleri açın örneğin, kullanım &#34; Fotoğraf Birleştir &#34; görüntüleme yazılımı seçeneğinde Dosya menüsü altında listelenen Tablo reçetesi.</li>
		<li>Bir uygun görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ) GFP Floresans görüntüleri açın. Daire bireysel kas lifleri kullanarak &#34; yatırım Getirisi aracı &#34; ve demek floresan yoğunluğu her lif için kayıt.
		<ol><li>Demek floresan yoğunluğu yüksek GFP ifade gösteren ve normal morfoloji var 10 liflerinin ortalamasını alarak maksimum GFP (floresan) yoğunluk hesapla. Demek Variety yoğunluğu her lif için maksimum GFP yoğunluğu tarafından bölünüp 100 ile çarpımı her lif için maksimum GFP yoğunluğu % hesaplamak. Her TA kas için GFP analiz sonuçları şekil 3E içinde gösterildiği gibi çizelgeye geçirmek.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>4 ve desmin immünfloresan etiketleme tarafından kas lif bütünlüğü ve myonuclear konum eğitim &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), sırasıyla. 
	Not: hazırlanan, yukarıda da belirtildiği gibi kas lifleri desmin etiketleme çalışmaya slaytların bir seti belirtmek.
	10 dakika süreyle PBS içinde % 2 paraformaldehyde <ol><li>düzeltme bölümlerle yıkama bölümlerle üç kez PBS. 
		Dikkat: Giymek uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) paraformaldehyde işlerken işlerken.</li>
		<li>Blok bölümleri ile % 3 sığır serum albümin % 0,01 içeren PBS seyreltilmiş Triton-X100 30 dk için. Bu engelleme çözüm ahiret için denir birincil seyreltici.</li>
		<li>Birincil seyreltici (1: 200) tavşan anti-desmin immünoglobulin G (IgG) oranında seyreltin.</li>
		Engelleme işlemi tamamlandıktan sonra <li>ilgili bölümlerde seyreltilmiş birincil antikorlar uygulamak ve gecede %0,1 içeren PBS ile bölümleri bir kez (5 dk) ~ 4 ° c yıkama bir buzdolabında kuluçkaya Triton X-100. Bu çözüm ahiret ilk yıkama tampon olarak anılacaktır.</li>
		<li>Bölümleri PBS ile 3 kez (yıkama başına 5 dk) yıkayın.</li>
		<li>Keçi anti sulandrarak tarafından ikincil antikor tavşan (kırmızı floresan boya için Birleşik) IgG % 0,01 içeren PBS içinde hazırlama Triton X-100.</li>
		<li>Seyreltilmiş ikincil antikor bölümlerinde uygulamak ve oda sıcaklığında (~ 23 ° C) 60 dakika süreyle kuluçkaya</li>
		<li>Bölümleri bir kez (5 dk) ilk yıkama arabellek ile yıkayın. PBS ile 3 kez (yıkama başına 5 dk) bölümleri yıkayın.</li>
		<li>Uygula DAPI 3 dakika süreyle bölümleri 3 kez (yıkama başına 1 dk) PBS ile yıkayın. Geçerli ~ 50 µL Anti-fade orta bölümlerinde ve cam coverslip uygulayın. Coverslip kenarları açık oje ile mühür.</li>
		<li>Hafif ve floresan mikroskop kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), çalışma seri halinde bölümleri kırmızı 10 X amaç ve görüntülenmesi için uygun bir filtre ile floresan boya.</li>
		<li>Tüm kesit TA kas kapsayacak şekilde alanların örtüşen visual dijital görüntüler (~ 15) toplamak. DAPI visual alanların her biri için uygun filtre ayarına geçiş yaparak etiketleme, Floresans görüntüleri toplamak.</li>
		<li>Aç ve adımlarda 7.2.3 - 7.2.4 açıklandığı gibi uygun bir görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleri analiz. 
		Not: Çalışma tanımlamak için hangi kas lifleri hasarlı (desmin negatif) olduğu, görüntüler, hangi kas lifleri Merkezi çekirdekleşme (dahili yerine periferik bulunan DAPI etiketli çekirdeği olan desmin pozitif lifleri) var ve hangi alanlarda bölümünün inflamasyon ve/veya fibrozis (birlikte kümelenmiş, DAPI etiketli birçok hücre çekirdeği, ancak kas lifleri yoksun olan alanlarda).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li><li>Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+aspects+of+murine+skeletal+muscle+regeneration+using+local+and+whole+body+irradiation.">Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation.</a> J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).</li><li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration.">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).</li><li>Brack, A. S., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+stem+cells:+lessons+from+the+skeletal+muscle+satellite+cell.">Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell.</a> Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).</li><li>Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level+of+muscle+regeneration+in+limb-girdle+muscular+dystrophy+type+2I+relates+to+genotype+and+clinical+severity.">Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity.</a> Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).</li><li>Skuk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+expression+in+myofibers+of+Duchenne+muscular+dystrophy+patients+following+intramuscular+injections+of+normal+myogenic+cells.">Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells.</a> Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).</li><li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source.">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li><li>Sakellariou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+electrical+stimulation+promotes+development+in+mice+of+mature+human+muscle+from+immortalized+human+myoblasts.">Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts.</a> Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).</li><li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+function,+self-renewal,+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche.">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).</li><li>Juhas, M., Engelmayr, G. C., Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+engineered+muscle+with+capacity+for+vascular+integration+and+functional+maturation+in+vivo.">Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Latil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+stem+cells+adopt+a+dormant+cell+state+post+mortem+and+retain+regenerative+capacity.">Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity.</a> Nat Commun. 3, 903 (2012).</li><li>Maykel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD-scidIl2rg+(tm1Wjl)+and+NOD-Rag1+(null)+Il2rg+(tm1Wjl)+:+a+model+for+stromal+cell-tumor+cell+interaction+for+human+colon+cancer.">NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer.</a> Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).</li><li>Casar, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+are+increased+during+skeletal+muscle+regeneration:+requirement+of+syndecan-3+for+successful+fiber+formation.">Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).</li><li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Injury+Models+for+Studying+Muscle+Regeneration+in+Mice.">Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).</li><li>Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+duration+of+myogenic+precursor+cell+replication+in+transplants+of+intact+skeletal+muscles:+an+autoradiographic+study+in+mice.">Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice.</a> Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).</li><li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+muscle+injury,+repair,+and+regeneration.">Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration.</a> Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Burada, donör kas dokusu ana kas dokusuna implant MIME, bizim laboratuvarda geliştirilen olarak bilinen roman deneysel tekniği için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu zaten bir ana kas9,10,17myogenesis donör-Hücre-aracılı teşvik etkili olduğu kanıtlanmıştır tekniği aşılama açık bir kas bir uyarlamasıdır.
MIME donör kas dokusuna kendisi (biz şu anda bu oluşup oluşmayacağını bilmiyorum) ana kas engraftment etkinleştirmemeyi ama oldukça myogenesis m teşvik koşullar altında ana kas katkıda bulunabilir SCs donör kaynağı sağlamak için hedeftir uscle rejenerasyon. Umudumuz MIME en iyi duruma getirilmiş ve temel ve preklinik çalışmalarda test sonra klinik tedaviler myogenic kas kaybı geçirmiş iskelet kasları kas rejenerasyon artırmaya yönelik rehberlik için değerli bilgiler sağlayabilir.
Nasıl MIME klinik bir terapiye örneğin tercüme edilebilir ile ilgili olarak cevaplanması için henüz çok sayıda sorular: nasıl donör doku kalitesini denetlemek? Nasıl donör doku ve hücreleri bağışıklık reddi kontrol? Donör doku hücreleri myogenesis için sağladıktan sonra temizlenir veya fibrotik bir yara izi mi? Donör ve/veya ana kas lif türü donör-Hücre-aracılı myogenesis etkiler mi? Hangi kas pratik olarak MIME seçeneğinden yararlanabilir? Şu anda çalışmalarımız MIME güvenli ve etkili olup olmadığını değerlendirmek, donör kaynaklı myogenesis artırmak ve yukarıda listelenen soruları, birçoğu cevap ek tedaviler tanımlamak için arttırıyoruz.
Fare fare allojeneik nakli MIME testlerimiz tamamladıktan sonra sonraki adım kadavra kas dokusu myogenic potansiyelini değerlendirmek için insan fare MIME kadavra insan dokusu ile gerçekleştirmektir. Biz bu deneyler bağışçılardan eğitim için vücut miras programı ve organ bağışı hayat hediye programı gibi girişimleri içinde kayıtlı kas dokusu içeren temel ve translasyonel araştırma, yeni bir satır sağlayacaktır tahmin .
Bu el yazması sunulan temsilcisi verinin MIME sonra 14 gün GFP eksikliği veya GFP düşük düzeyine sahip birkaç uygun myofibers olduğunu düşündürmektedir. Bu veriler bizim yorum GFP-donör uydu hücrelerin ana kas myogenesis katkıda olduğunu. Bir ana bilgisayar fare kas içine insan Kadavra doku implantasyon için hazırlık Bu deney yapılır. Tümden donör uydu hücreleri MIME aşağıdaki ana kas myogenesis katkıda göstermek için (örneğinGFP kolayca ayırt edilebilir, floresan bir muhabir ifade donör doku implantı yararlı olacaktır Kırmızı floresan protein) donör doku GFP + ana kas içine implante ifade.
Bu teknik özellikle SCs donör dokuda mevcut doğası ile sınırlıdır. SCs donör doku tekniğidir donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştırmak için büyük olasılıkla uygun iseniz, eğer onlar are değil uygun, myogenesis gerçekleşemez tamamlayın. SCs çok esnektir ve yaklaşık 2 hafta otopsi için uygun beri Ancak, deneysel amaçlar için donör-Hücre-aracılı myogenesis13 hasat sonra birkaç dakika içinde implante donör doku kolaylaştıracaktır görüneno ki . Ayrıca, yukarıdaki için sorar gibiydi (içeren SCs, olgun kas lifleri yanı sıra kas yerleşik fibroblastlar) tüm kas dokusu beri fibrozis oluşabilir ana kas gömülü mümkündür. Ancak, bu varsayımı ampirik olarak incelenmesi gereken. Zararlı kasılmalar, cryoinjury ve deneysel myotoxins kaynaklanan kas hasarı edebiyat bağışıklık hücreleri (esas olarak makrofajlar) etkili bir şekilde hasarlı liflerinden hücresel enkaz açıklıkta ve remodeling yeteneğine olduğunu göstermektedir hücre dışı matriks18. Bu nedenle, ana bilgisayar bağışıklık hücreleri donör kas lifleri, oluşan bozucu erişiminiz olduğu sürece MIME ve BaCl2 enjeksiyon sonra onlar sadece donör SCs bırakarak enkaz, açık mümkündür. Son olarak, donör kaynaklı myogenesis ölçüde ana kas gömülü donör kas dokusu miktarına bağlıdır. Sırayla tamamen donör-hücre kaynaklı myofibers tarafından yeniden yerleştirilmesi ana kas yuvası, bir yöntem gibi X - veya gama-ana kas SCs ablate ve aynı zamanda tekrarlanan MIME yordamlar gerektirir için Işınlama gerektirecektir.
Cerrahi olarak ana kas teşhir ve donör doku ana kas üzerine bir parça dikiş donör-Hücre-aracılı myogenesis9,10,17kolaylaştırabilir kanıtlanmıştır. Bu açık cerrahi yaklaşım geçmişte myogenesis ilerlemesini izlemek ve insan kas hastalıkları fare modelleri oluşturmak için kullanılmıştır. MIME tekniğin yenilikçi fark minimal invaziv ve cerrahi olarak ana kas açığa anlamına gelmez yönüdür. Bu iyatrojenik enfeksiyon ve bu nedenle yapım o MIME tekrar tekrar gerekirse aynı ana kas üzerinde gerçekleştirmek için daha uygun konak hayvan rahatsızlık derecesine riskini azaltır.
Biz MIME tekniği uygun bir arıtma şu anda donör kas dokusu bir ana bilgisayar fare implant takip açık cerrahi yaklaşım olabilir tahmin. Bu ana bilgisayar fare kas biyopsi insan kas gömerek insanlaşmış fare modellerin üretimi hızlandırmak. Ayrıca, fare fare aşılama üzerinden bizim ön verilere dayanarak, MIME donör SCs olduğu sürece uygun donör-Hücre-aracılı myogenesis insan Kadavra donör dokusundan ulaşmada etkili olacaktır tahmin. Son olarak, ek sınama ve doğrulama ile biz MIME tekniği donör-Hücre-aracılı myogenesis kas hastalığı olan insanlarda kolaylaştırmak için yeni tedaviler geliştirmek yardımcı olacağını umuyoruz.
MIME teknik başarısı tam olarak donör doku ana kas Fasial yuvası (epimysium) içinde katıştırma üzerine eleştirel bağlıdır. Sadece donör doku ana kas bölme içinde yerleştirilmiş olması durumunda, kesin bir biçimde ana kas SCs sağlamak mümkün olacaktır. Donör doku dışında ana kas yerleştirilmiş olması durumunda, onun kaderi ne olurdu olarak belli değil. Ondan beri onun'önemli ve yüzeysel olarak yerleştirilmiş bacağın anterolateral yönüyle MIME için bizim deneysel modelinde, biz ana kas TA kas kullanın. Boyutunu, yönünü ve anatomik TA kas konumunu donör doku doğru MIME sonra konak TA kas içinde yerleştirilir onaylamak yapmayı kolaylaştırır. Bu yazıda, biz deneysel kanıt sağladı bu donör doku yenidendonör-Hücre-aracılı myogenesis ana kas 14 gün sonrası MIME, konak TA kas 3 gün sonrası MIME ve bu orada gömülü şebeke var.

Sağlıklı kas iskelet, sonrası Mitotik olsa bile, doku yerleşik myogenic hücreleri uydu hücreleri (SCs)1,2olarak bilinen varlığı nedeniyle mükemmel rejeneratif kapasite sahip; ve gözden geçirilen3,4. Ancak, kas dystrophies, travma ya da hızlandırılmış yaşlanma tarafından neden olduğu patolojik şartlar altında kas rejenerasyon kas arıza ile tutmak değil ve bu nedenle5aşamalı kas lif kaybı oluşur. SCs kas yalıtmak ve kültür myoblasts (ve daha sonra myotubes) çok sayıda oluşturmak için bunları genişletmek için etkili yöntemler geliştirilmiştir rağmen ana kas kas liflerinin fizyolojik ilgili numara oluşturmak için girişimleri var Sadece çok az başarı6vermiştir. Myoblasts tek başına ana bilgisayar doku enjekte edildiğinde olarak birçok hücre tipleri ile hücrelerin çoğu7,8engraft değil. Nöromüsküler elektriksel stimülasyon (NMES) donör-hücre kaynaklı myogenesis insan myoblasts8ile enjekte rejenerasyon eksikliği ana bilgisayar fare kas kolaylaştırır göstermiştir. Diğerleri cerrahi olarak aşılama biyopsi kas veya tek kas lifleri ile ekli SCs, orta myogenesis bile NMES tüm kas lifleri ile SCs Reproduction yerleştirilmesi daha daha avantajlı olabilir düşündüren, olmadan kolaylaştırmak göstermiştir myogenic hücreleri tek başına9,10. Donör veya ana bilgisayar kasına aşılı mühendislik kas dokusu hücreleri yalnız nakli daha iyi sonuçlar üretir beri dokusu veya doku benzeri yapılar çok önemli ipuçları için donör hücreli engraftment sağlayabilir mümkündür; çeşitli hücre türleri10,11,12içeren hücre tedavisi çalışmalarda giderek belirgin hale geliyor bir kavram.
Son veriler SCs insanlardan elde daha fazla 2 hafta post mortem myotubes kültür13' te oluşturmak olduğunu göstermektedir. Bu nedenle kas doku hasat öldükten sonra implantasyon içine bir yaşam ana kas lif kaybı tersine çevirir olmadığını değerlendirmek istiyoruz. Donör-hücre kaynaklı myogenesis tanıtmak için bir yaşam ana iskelet kas dokusuna donör kas dokusu implant MIME adında bir roman teknik geliştirdik. MIME ile cerrahi iğne iğne parça oluşturmak için ana bilgisayar kas ile ilgilidir; donör kas doku iğne parça ile küçük bir parça çizme; donör doku bırakarak ana kas gömülü; ve doku yapıştırıcı ile iğne delikleri yaklaşıyor. Ötenazi farelerde tekniği uygulamak okudu sonra diğer deneylerde şimdi MIME immünyetmezligi canlı farelerde yapılan ve ubiquitously yeşil flüoresan protein (GFP) hızlı ve doğumdan 3 ve 14 gün sonra takip sonrası Mim. 3 gün sonrası MIME donör fare (GFP-) Edi kas (GFP +) TA kas, ana kas gömülü kalır ana bilgisayar fare implante onaylayın. 14 gün sonrası MIME hasar ve myogenesis, ikna etmek için BaCl2 myotoxin yaralanma sonra biz yaklaşık % 5, % 26, % 26 ve % 43 tek konak TA kas liflerinin göstermek hiçbir ana bilgisayar katkı, en az ana bilgisayar katkı, orta ana bilgisayar onaylamak katkı ve en büyük katkısı, sırasıyla ev sahipliği. Merkez çekirdekleşme (dejenerasyon ve sonraki rejenerasyon bir işaretleyici) TA kas lifleri yaklaşık % 95 MIME ve myotoxin enjeksiyon sonra görülür.
Rejenere lifler çoğunluğu merkezi olarak parçalanmayabilir zaman bu zaman noktası rejenerasyon, ara sahne yakalar çünkü MIME + BaCl2 ' den sonra 14 gün TA kas inceleriz. Böylece biz sonunda ana bilgisayar fare insan Kadavra kas nakli ne zaman biz kas lifleri ana bilgisayar ve donör kökenli kolayca ayırt edebilecektir için MIME, konukçu GFP + fare inceleriz. Bu kas lifleri tek TA kas9' dan büyük myogenic potansiyel göstermiştir bu yana fareyi Edi kas deneysel donör doku kullanın. Edi kas da TA kas sinerjik ve benzer fiber türü kompozisyon vardır. Ön verilerimiz MIME donör-hücre kaynaklı myogenesis ana kas kolaylaştırmak yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>NSG-GFP mice</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td><td>Stock #021937</td><td>Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein</td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)&amp;nbsp;</td><td>Stock #000664</td><td>Control donor mice</td></tr><tr><td>Tabletop isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>VetEquip (Livermore, CA)</td><td>Item #901801</td><td>Inhaled anesthesia system</td></tr><tr><td>Magic depilatory crea</td><td>Softsheen Carson (New York, NY)</td><td>N/A</td><td>Razorless hair removal cream</td></tr><tr><td>4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures</td><td>Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)</td><td>SUT106631</td><td>Guiding sutures for donor tissue</td></tr><tr><td>VetBond veterinary tissue adhesive</td><td>3M (Maplewood, MN)</td><td>Catalog #1469Sb</td><td>Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure</td></tr><tr><td>Barium chloride&amp;nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company (Arlington, TX)</td><td>Product #R0854000-500A 854-16&amp;nbsp;</td><td>Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration</td></tr><tr><td>Deltaphase isothermal gel heating pad&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific (Braintree, MA)</td><td>&amp;nbsp;Item #39DP</td><td>Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia</td></tr><tr><td>HM525NX cryostat&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog #HM525NX&amp;nbsp;</td><td>Cryostat to make frozen sections of muscle</td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA)</td><td>Catalog Number: H-1000</td><td>Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples</td></tr><tr><td>Rabbit anti Desmin Antibody</td><td>Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA)</td><td>RB9014P</td><td>Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling</td></tr><tr><td>Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog#: A-21069</td><td>Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Seracare (Milford, MA)</td><td>Catalog #5930-0006 or 71-03-01</td><td>Reagent for fluorescent labeling of nuclei</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1 microscope</td><td>Carl Zeiss (Peabody, MA)&amp;nbsp;</td><td>Product #Axio Scope.A1</td><td>Light and fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Adobe Systems (San Jose, CA)</td><td>Photoshop CS4</td><td>Imaging Software for perform image tiling</td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td><td>Image J for Windows 64-bit Operating System</td><td>Imaging Software for quantitative fluorescence analysis</td></tr></tbody></table>

minimally invasive muscle embedding (mime) - a novel experimental technique to facilitate donor-cell-mediated myogenesis

İskelet kas doku yerleşik, kas lif üreten (myogenic) uydu doğru koşullar altında yeni kas lifleri oluşturan hücreleri (SCs), nedeniyle yeniden üretim kapasitesi sahiptir. SCs kas dokusundan hasat ve vitrokültürlü olsa da, elde edilen myoblast hücreler ana kas nakledilen zaman myogenesis teşvik çok etkili değildir. Cerrahi olarak ana kas teşhir ve segmentleri donör kas dokusu veya izole kas lifleri ile onların SCs ana kas, üzerine aşılama daha iyi myogenesis myoblast nakli için karşılaştırıldığında teşvik etmektedir. Minimal invaziv kas katıştırma (MIME) dediğimiz bir roman tekniği geliştirdik. MIME ana kas cerrahi bir iğne geçirerek, donör kas doku iğne parça ile bir parça çizim ve SCs ana kas için bir kaynak olarak hareket edebilir böylece ana kas gömülü donör doku bırakarak içerir. Burada biz ayrıntılı adımları yeşil flüoresan protein (GFP) ifade eder bir immünyetmezligi fare modelinde MIME gerçekleştirmede dahil onun hücrelerin tümünü tanımlamak. Ana bilgisayar Mouse immün yetmezlik bağışıklık donör Doku reddi riskini azaltır ve ana kas lifleri (GFP +) ve kas lifleri (GFP-) donör-hücre kaynaklı kolay tanımlanması GFP ifade sağlar. Bizim pilot verileri MIME ekstansiyon digitorum longus (EDL) kas bir donör fareden tibialis anterior (TA) kasına bir ana bilgisayar fare implant için kullanılabilir göstermektedir. Bizim veri aynı zamanda bir myotoxin (Baryum klorür, BaCl2) MIME sonra ana kas içine enjekte edildiğinde, orada olduğunu donör-hücre kaynaklı myogenesis yaklaşık % 5, % 26, % 26 ve % 43 tek konak TA liflerinin ana kas kanıtı göstermektedir hiçbir ana bilgisayar katkı, en az ana bilgisayar katkı, orta ana bilgisayar katkı ve maksimal ana bilgisayar katkı, sırasıyla gösteren kas.

3 gün sonrası MIME donör MIME tarafından implante Edi konak TA kas yuvası (şekil 2A-C) içinde yer alıyor. Beklendiği gibi kesit TA kas donör fareler, üzerinden Floresans optik altında okudu, GFP (şekil 2B) ifade değil çünkü yeşil Floresans gösteri değil. Buna ek olarak, kesit TA kas donör doku ile implante değil ana bilgisayar fare üzerinden göstermek Tekdüzen yeşil Floresans TA kas lifleri lifler GFP (şekil 2E) hızlı gibi. MIME tarafından donör kas dokusu ile implante kas kesit içinde sınır ana kas lifleri (GFP +) ve donör kas lifleri (GFP-) arasında bir çizgi vardır. Görsel şekil 2B-F içinde gösterilen alanları faz kontrast görüntülerini şekil 2Eiçinde sunulan '-F' ve gerçekten kas lifleri bölgelerde mevcut olduğunu göstermektedir yok GFP olduğu sinyal.
14 gün sonrası MIME ve BaCl2 enjeksiyon, kalan bölümleri TA kas etiketsiz veya desmin (şekil 3), antikorlar ile etiketlenir seri çapraz okuyan tarafından GFP sinyal içinde tüm kas lifleri tarafından ifade edilir öğrenin tedavi edilmemiş kas ana bilgisayar fare, ama (kırmızı desmin etiketleme kalıcı kas lifleri algılar) değil MIME tedavi kas. MIME ve BaCl2 enjeksiyonu ile tedavi konak TA kas donör-hücre kaynaklı myogenesis tespit GFP sinyal göstermek pek çok desmin(+) kas lifleri varlığı belirgindir (şekil 3 c-D, 3 C' -D'). Chimeric kas lifleri ev sahibi ve donör myogenic hücre füzyon olasılığı ortaya çıkan bu lifleri tarafından sergilenen GFP Floresans orta düzeyde düşük tarafından tespit edilebilir. Çok sayıda chimeric lifler TA kas düşündüren donör SCs birkaç yüz mikron ana kas epimysium içinde geçirme yeteneğine sahip tüm çapı arasında görünür. Nefelometri liflerinin GFP + şekil 3Eiçinde gösterilir. Şekil 4 seri kesitleri bir tüm MIME + BaCl tedavi2 TA kas yüksek büyütme görüntüleri gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig1.jpg"> 
Resim 1 . Minimal invaziv kas katıştırma (Mim) adımlar. MIME genel anestezi altında gerçekleştirilir. ~ 10 mg donör kas (donör fare EDL) zil çözümde yerleştirerek ve uçlarından (A)için yol gösterici dikiş bağlama içerir. Bir 18'lik iğne ana kas (B) uzun eksen geçirilir ve donör doku iğne parça (C)ile çizilir. Donör doku sol ana kas (D)gömülü, yol gösterici dikiş kesilir ve iğne delikleri doku yapıştırıcı ile mühürlü (E). Mühürlü iğne yaralar (F)oklarla gösterilir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55731/55731fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig2.jpg"> 
Resim 2 . TA kas çalışmaları 3 gün sonra MIME. Ana kas 3 gün sonra MIME toplanan; Not iğne izleri ana TA (oklar; A-B). Daha fazla veri Edi gömülü donör fare TA kas yuvası (ABC) içinde yerleşmişti onaylayın. Floresans görüntüleri TA kas yok yeşil Floresans vahşi tipi TA kas (D), parlak yeşil Floresans NSG GFP TA kas (E)ve ana bilgisayar ve donör arasında bir ayrım 3 gün NSG GFP TA kas kas kesitleri göster (F)sonrası Mim. D-F visual alanlarında faz kontrast görüntülerini D'-F içinde gösterilir ', anılan sıraya göre. Kırmızı çizgi panelleri F ve F' ev sahibi ve donör doku arasındaki sınır satır gösterir. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55731/55731fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig3.jpg"> 
Şekil 3 . Çalışmalar TA kas 14 gün sonra MIME. Toplanan verileri 14 gün sonrası MIME sunulmaktadır. Kırmızı sinyaldir immünfloresan desmin etiketleme üzerinden (desmin pozitif bir sinyal gösterir myofibers uygun), mavi sinyal DAPI (lekeleri çekirdeği) ve yeşil sinyal GFP. Denetim TA kas beklendiği gibi ana bilgisayar fare--dan hasat (değil hindlimb), neredeyse tüm myofibers bu myofibers uygun olduğunu düşündüren desmin için (A; kırmızı sinyal) olumludur. Ayrıca, DAPI boyama dayanarak, bu açıktır neredeyse tüm myofibers o myonuclei periferik bulunduğu, sağlıklı kas (A; mavi sinyal) beklenenden farklı olması gibi. Denetim TA kas seri bölümlerini neredeyse tüm kas lifleri parlak yeşil, GFP için pozitif olduklarını ima olduğunu göster. MIME + BaCl2 -TA kas (sol hindlimb), tedavi donör-Hücre-aracılı myogenesis yok algılanabilir GFP Floresans göstermek pek çok desmin(+) kas lifleri varlığı belirgindir (C-D, C'-D'). Desmin(+) kas lifleri ile düşük orta GFP floresan (chimeric kas lifleri) olarak MIME donör TA kas epimysium içinde göç ve teşvik SCs sağlar düşündüren tüm TA kas çapı mevcuttur donör-hücre kaynaklı myogenesis. A'-D' yüksek büyütme görüntülerdir mavi kutu A - d Berisi bölgeler GFP(+) lifleri ve merkezi olarak çekirdekli lifleri Nefelometri Eiçinde gösterilir. Ölçek çubukları = 100 µm (A-D) ve 50 µm (A'-D'). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55731/55731fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" s alt="Figure 4" class="xfigimg"></img alt="Figure 4" class="xfigimg" s>RC="/Files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / > 
Şekil 4 . Yaygın hasar ve rejenerasyon MIME ve BaCl2 enjeksiyon sonra 14 gün. Yüksek büyütme, seri kesitleri bir tüm MIME + BaCl tedavi2 TA kas sunulmaktadır. Birçok kas lifleri, orta derecede olan veya güçlü GFP + merkezi bir konuma sahip bu çekirdek verileri göstermek (A-B; kırmızı işaret a mi desmin, a mavi sinyal DAPI ise b yeşil sinyal GFP). Bu verileri bu dejenerasyon göstermektedir ve BaCl2 enjeksiyon GFP ifade etkilemez sonra yenilenme. Bu bağlamda, merkezi olarak çekirdekli kas lifleri ile hayır küçük GFP ifade, MIME + BaCl tedavi2 TA kas varlığı bu elyaf myogenesis (veya yeniden oluşturma), büyük olasılıkla sonucu olan önemli katkı ile öneriyor GFP - myogenic hücreleri. Bu gözlemler daha fazla seçili alanları (C-F; yüksek büyütme Albümdeki doğrulanabilir C ve D, E ve F, sırasıyla, seri kesitleri bölgelerden üst üste gelen; resim kenarlıklarının rengini renk kodlaması bölgelere a konumunu belirtmek ve B). Ölçek çubukları = 100 µm (A-B) ve 50 µm (C-F). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55731/55731fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis at JoVE.com

Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

minimally-invasive-muscle-embedding-mime-novel-experimental-technique

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

7.7K Görüntüleme.  Wayne State University. Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.

Video: Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Biyomühendislik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Gelişim Biyolojisi

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle degeneration1, 2. In patients, the ability of resident muscle satellite cells (SCs) to regenerate damaged myofibers becomes increasingly inefficient4. Therefore, transplantation of muscle progenitor cells (MPCs)/myoblasts from healthy subjects is a promising therapeutic approach to DMD. A major limitation to the use of stem cell therapy, however, is a lack of reliable imaging technologies for long-term monitoring of implanted cells, and for evaluating its effectiveness. Here, we describe a non-invasive, real-time approach to evaluate the success of myoblast transplantation. This method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes (firefly luciferase [fluc], monomeric red fluorescent protein [mrfp] and sr39 thymidine kinase [sr39tk]) whose expression can be imaged with different imaging modalities9, 10. A variety of imaging modalities, including positron emission tomography (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetic resonance imaging (MRI), optical imaging, and high frequency 3D-ultrasound are now available, each with unique advantages and limitations11. Bioluminescence imaging (BLI) studies, for example, have the advantage of being relatively low cost and high-throughput. It is for this reason that, in this study, we make use of the firefly luciferase (fluc) reporter gene sequence contained within the fusion gene and bioluminescence imaging (BLI) for the short-term localization of viable C2C12 myoblasts following implantation into a mouse model of DMD (muscular dystrophy on the X chromosome [mdx] mouse)12-14. Importantly, BLI provides us with a means to examine the kinetics of labeled MPCs post-implantation, and will be useful to track cells repeatedly over time and following migration. Our reporter gene approach further allows us to merge multiple imaging modalities in a single living subject; given the tomographic nature, fine spatial resolution and ability to scale up to larger animals and humans10,11, PET will form the basis of future work that we suggest may facilitate rapid translation of methods developed in cells to preclinical models and to clinical applications.

A non-invasive means to evaluate the success of myoblast transplantation is described. The method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes whose expression can be imaged with different imaging modalities. Here, we make use of a fluc reporter gene sequence to target cells via bioluminescence imaging.

Nakledilen Muscle Progenitör Hücreler Hedefleyecek Moleküler Görüntüleme

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

Tıp

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

İmmün eksik farelerde İnsan İskelet Kası Ksenogreftlerinin

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biyoloji

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle mass and strength in healthy individuals and in patient populations. There is a need for precision rehabilitation tools to test the safety and effectiveness of PRT to maintain and/or restore muscle mass and strength in preclinical studies on small and large animal models. The PRT methodology and device described in this article can be used to perform dosage-adjusted resistance training (DART). The DART device can be used as a standalone dynamometer to objectively assess the concentric contractile torque generated by the ankle dorsiflexors in mice or can be added to a pre-existing isokinetic dynamometry system. The DART device can be fabricated with a standard 3D printer based on the instructions and open-source 3D print files provided in this work. The article also describes the workflow for a study to compare contraction-induced muscle damage caused by a single bout of DART to muscle damage caused by a comparable bout of isometric contractions (ISOM) in a mouse model of limb-girdle muscular dystrophy type 2B/R2 (BLAJ mice). The data from eight BLAJ mice (four animals for each condition) suggest that less than 10% of the tibialis anterior (TA) muscle was damaged from a single bout of DART or ISOM, with DART being less damaging than ISOM.

The present protocol describes a unique technique called dosage-adjusted resistance training (DART), which can be incorporated into precision rehabilitation studies performed in small animals, such as mice.

Kas hasarı riski azaltılmış farelerde dozaj ayarlı direnç eğitimi

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle ...