Name: three-dimensional reconstruction of the vascular architecture of the passive clarity-cleared mouse ovary
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary at JoVE.com

Bu çalışma Postdocs için hibe Çin Özel Fonu tarafından desteklenmiştir (YF için No 2014T70392), Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (YF için No 81673766), yeni öğretmen Priming Fonu, Bund'a Üniversitesi Zuoxue temeli ve geliştirme Shanghai en yüksek disiplinleri İntegratif tıp (20150407) projesi.

Tüm yordamları hayvan konular içeren hayvan Etik Komitesi Shanghai Medical College, Bund'a Üniversitesi (onay numarası 20160225-013) yönergeleri takip etti.
1. şeffaf Mouse ovarium hazırlanması
<ol><li>
Çözümler hazırlanması
	<ol>
<li>Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm (1 M, pH 7,6) % 0.1 ile hazırlamak Triton X-100 (PBST). 10 x PBS hisse senedi çözüm 1 L yapmak, 87 gram NaCl, NaH2PO4 · 3.1 g mix 2H2O ve 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. dH2O 1 L ve heyecan ~ 2 h. ayarlama pH 7.4 için 1 N NaOH ile ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın. Bu 10 x hisse senedi çözüm 1/10 tarafından seyreltik dH2O kullanarak ve % 0.1 yapın PBS Triton X-100.</li>
		<li>Mixings % (wt/vol) 4 paraformaldehyde (PFA) çözüm, %4 (wt/vol) Akrilamid, % 0.05 (wt/vol) bisacrylamide ve % 0.25 (wt/vol) VA-044 başlatıcı buz üzerinde çift distile suda hidrojel çözüm (pH 7.5) hazırlayın.</li>
		<li>Takas çözüm (pH 8,5) 200 mM sodyum Borat arabellek içeren %4 (wt/vol) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) çift distile su karıştırılarak hazır olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transcardial perfüzyon ve yumurtalık hazırlık
	<ol>
<li>Buz üstünde tüm çözümleri tüm işlemler sırasında tutmak.</li>
		<li>Yetişkin kadın vahşi türü C57BL/6 fare mayi enjeksiyonu Fentobarbital (0.35 mg/kg) çözüm ile anestezi. Toe-çimdik yanıt gösterir sonra fare düzgün anestezi.</li>
		<li>Kullanım fare ile bacaklarda düzeltmek için bant bir düz köpük tahta üzerine uzanmış.</li>
		<li>Kalp makas ile bir kesik göğüs, cilt ve kemik xiphoid süreci tarafından ortaya çıkarmak.</li>
		<li>Hayvanın Sağ atrium içine bir kesi yapmak ve buz gibi 1 x PBS 10 mL/dk 20 mL ile sol ventrikül sıvı.</li>
		<li>En az 20 mL hidrojel çözeltisi 10 mL/dk hayvanla sıvı.</li>
		<li>Cilt medioventral hattı boyunca karın üzerinde bütün enterocoelia ortaya koyar, makas ile deşmek ve bağırsak kaldırın. Yumurtalık yumurtalık Morfoloji bütünlüğünü korumak için rahim toplamak.</li>
		<li>Mikroskop altında yumurtalık etrafında yağlı doku kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gaz Giderme
	<ol>
<li>3 gündür fiksasyon için 4 ° C'de 10 mL hidrojel çözüm yumurtalıklar yerleştirin.</li>
		<li>Yumurtalık 5 mL tüp içine aktarmak ve tüp hidrojel çözüm ile doldurun. Parafilm tüp üst üzerinde streç ve sonra parafilm tüp boyun etrafında sarın. Dikkat: hava kabarcığı yok parafilm ve hidrojel çözüm arasında olduğundan emin olun.</li>
		<li>Bir shaker en fazla polimerize hidrojel izin vermek için 3 h 37 ° C'de kuluçka tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Yumurtalık bir spatula kullanarak jel kaldır ve yumurtalık etrafında gelen jel aşırı doku kağıt tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. Yumurtalık dört kez 1 x PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pasif takas
	<ol>
<li>10 ml Temizleme çözüm yumurtalık daldırın. 37 ° C'de temizleme işlemini başlatmak için 80 rpm'de hafifçe sallayın.</li>
		<li>İlk haftasında 3 günde çözüm değiştirin. Bir hafta öncesine kadar yumurtalık açık olur sonra bir hafta sonra takas çözüm yenileyin. Genellikle bu süreç yaklaşık 2-3 hafta sürer. Not: Yumurtalık immunostained olabilir doğrudan veya immunostaining önce birkaç hafta 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir sodyum azid (%0.02).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunostaining
<ol><li>Yumurtalık bir shaker olarak 37 ° C'de 1 günde iki kez PBST yıkayın.</li>
	<li>Bir shaker gün 2-3 37 ° C'de (Tablo 1) birincil antikorlar/PBST çözümünde tarihinde yumurtalık kuluçkaya İş burada, birincil antikorlar trombosit endotel hücre adezyon molekül 1 (CD31) sunuldu ve tirozin hidroksilaz sırasıyla 1:10 ve 1:50 PBST içinde seyreltilmiş. Dikkat: birincil antikor iki veya daha fazla tür kullandıysanız, farklı hayvan kaynakları olduğundan emin olun.</li>
	<li>PBST arabellek 37 ° C'de ile birincil antikorlar kapalı gün 4 bir shaker tarihinde yıkayın.</li>
	<li>Gün 5-6 bir shaker olarak 37 ° C'de PBST içinde istediğiniz ikincil antikorlar ile yumurtalık kuluçkaya. Burada sunulan çalışma, ikincil antikorlar tirozin hidroksilaz ve Alexa un 594 1:50 PBST de seyreltilmiş CD31 için Alexa un 488 içindi.</li>
	<li>PBST arabellek 37 ° C'de ile ikincil antikorlar kapalı bir shaker üzerinde 7 günü yıkayın.</li>
	<li>Doku Kırılma indisi homojenizasyon günde 8 için Kırılma indisi eşleşen çözüm içine aktarın. Kılavuz çizgilerini kılavuz çizgileri görülebilir olup olmadığını kontrol ederek onun görsel netlik kontrol etmek için bir kağıt doku koymak. Bir kez doku tam olarak açıklık vardır, yansıma.</li>
	<li>Sadece çevreler olabilir bir macun silindir doku yapmak ve bir at nalı Şekil şekil ve dış ridge bir cam slayt üzerine sıkıca kapalı bir yer açmak için tuşuna basın. Macun yüksekliğini yumurtalık biraz daha uzun olmalı.</li>
	<li>Açıklanan yumurtalık dikkatle macun ortasına yerleştirin ve Kırılma indisi çözüm eşleme ekleyin. Cam-alt çanak sıkıca macun koymak ve macun yemek düzeltmek için kullanın.</li>
</ol>3. confocal mikroskobu
<ol><li>Confocal mikroskop ile görüntüleme için uygun çalışma mesafesi (içinde bu durumda 2.0 mm) ile (Bu durumda su daldırma 25 X objektif lens, 1.1-NA, 2 mm-WD) lens "Ni-E" panelinde seçin.</li>
	<li>
"Satın alma" panelinde kanal sayısını seçin. Burada, üç kanal kullanın.
	<ol>
<li>İlk olarak, "göz port" sekmesini ve XY denetleyicisi joystick ile mikroskop göz mercekleri kontrol ederek alanın ortasına doğru doku taşımak için kullanın.</li>
		<li>Çekim ışığı kapatıp açtıktan sonra "lazer gücü", "HV (kazanç)", ayarlamak için "canlı" sekmesini tıklatın ve "ofset ' her biri için ayrı ayrı kanal. Yüksek lazer gücü ve HV daha yüksek sinyalleri açabilir ve daha yüksek ofset arka plan gürültü azaltabilir.</li>
		<li>Uygun "tarama boyutu" ve "Count" seçin. Tarama boyutu 1024 x 1024 µm2 ve 4-8 sayısını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doku derinliği panelinde tanımlamak için görüntü kalitesi "Z yoğunluğu düzeltme" ayarladıktan sonra ve sonra Yumurtalık (doku Center'da) en üst tabakası üzerinde objektif bulma ve üst katmanı edinmesinin ayarlama "artı" tıklayın üst katmanı tanımlamak için düğmesine basın.
	<ol>
<li>Lens aşağı taşı ve uygun HV ve lazer güç dokunun alt için ayarlayın ve en düşük katman bilgisi Z-yoğunluk düzeltme tabloya ekleyin. Bu ayar "ND edinme" paneli ile eşitlemek için "için ND" tıklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İçinde "ND edinme" paneli, ilk seti tarama sayısını adımlar. O zaman, belgili tanımlık tabs "Z" ve "Büyük resmi" kene.
	<ol>
<li>Doku sınır doku görselleştirme yoluyla göz mercekleri yardımıyla göre alanın boyutu tanımlamak için "İnceden inceye gözden geçirmek büyük görüntü" penceresine gidin. Tarama alanının ("alanlar") boyutunu girip % 10 ve % 15 arasında örtüşme seçmek için "ND edinme" paneli geri dön.</li>
		<li>"Run Z düzeltme", "otomatik olarak uygun HV, lazer güç ve ofset her bir katman için ayarlamak ve görüntüyü işlemek beklemek değil çalışma şimdi",'ı tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 3D imar bireysel köklerinin ve onların Vasculatures
<ol><li>İlk olarak, ImageJ5 özgün NIS dosyasının açmak için kullanın. "Görüntü" düğmesini tıklatın ve "Renk" ve "Bölünmüş Kanallar" seçin. Ardından, "dosya" ve "Kayıt" "Görüntü sıralarını" seçeneğini kullanarak TIFF dosya serisi ayrı ayrı kanallar kaydedin.</li>
	<li>TIFF dosyası dizilerinde birini açmak için Imaris kullanın. "Düzenle" düğmesini tıklayın ve "Ekle Kanallar" Seç gerisi kanalları eklemek için. Kanalın rengini ve adı "Ekran ayarlama" sekmeleri değiştirebilirsiniz. Doku kalınlığı "Düzenle" altında aşağı açılan listesinde "Görüntü özellikleri" panelinde düzeltilmesi gerekebilir.</li>
	<li>3D son görüntüleri ve aşırı bölümleri kaldırılması kırpma için "Düzenle" düğmesini tıklayın ve "Ürün 3D" seçin. Alanın büyüklüğü kenarlığı sürükleyerek ayarlanabilir.</li>
	<li>
Gemi sinyalleri Surpass Masası'ndaki filamentler algoritması ile yeniden oluşturmak için yeni bir Filament oluşturmak ve İleri'yi tıklatın "Filamentler" düğmesini tıklatın.
	<ol>
<li>En büyük ve en ince çapı tanımlamak için "Dilim" Masası'na gidin ve izleme Taşıyıcıyı bulmak. Mesafe, "Ölçü" panelde iki noktada en büyük genişliğe geminin seçerek otomatik olarak gösterilecek.</li>
		<li>Tekrar "Surpass" Masası'na gidin ve ölçülen genişliği girin ve İleri'yi tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başlangıç ve tohum noktası eşik ayarlayın. "Kamera" panelinde, "Seç". Bazı otomatik olarak üretilen küreler kaldırılması gerekiyorsa, Shift tuşunu basılı tutun ve üzerinde noktasını tıklatın. "Bul" seçme ve fareyi hareket ettirerek, yapısı doğru noktaları muhafaza edilmiştir ve İleri'yi tıklatın emin olmak için döndürülebilir.</li>
	<li>Yerel kontrast için en yüksek eşik seçin ve İleri'yi tıklatın. Değil "Tespit Spines" seçin ve kan damarı silindir yeniden inşası sonuçlandırmaya devam. Rengi "Renk" sekmesine tıklayarak düzenlenebilir. İstatistik verilerini yeniden oluşturulan Filament "İstatistik" panelinde elde edilebilir. Aşırı parça-ebilmek var olmak çıkarmak "Düzenleme" paneline. Not: Toplam köklerinin veya Folliküler duvarlar ses düzeyini ölçmek için diğer algoritmalar kullanılabilir. Burada sunulan çalışma, yumurtalar her iki ikincil antikorlar autofluorescence tarafından işaretlenen. Büyük miktarda veri nedeniyle bir iş istasyonu sunucu veri analizi için kullanıldı.</li>
</ol>5. istatistiksel analiz
Not: Görüntü analiz veri ± standart hataları aracı olarak sunulmaktadır.
<ol><li>Bağımsız örnek t-testi kullanarak köklerinin arasında karşılaştırmalar yapmak ve Pearson korelasyon testi korelasyon katsayıları foliküler duvar ve kılcal damar uzunluğu karşılaştırmak için kullanın. P değeri < istatistiksel anlamlılık sınırı olarak 0,05.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brown, H. M., Russell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+vasculature+in+the+ovary:+development,+function+and+disease.">Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease.</a> Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).</li><li>McFee, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+signal+transduction+blocks+follicle+progression+but+does+not+necessarily+disrupt+vascular+development+in+perinatal+rat+ovaries.">Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries.</a> Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).</li><li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ,+the+gonad.">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji: an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+platelet+endothelial+cell+adhesion+molecule-1-null+mice.">Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice.</a> Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).</li><li>Manni, L., Holm&#228;ng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+expression+of+alpha+(1)-+and+beta+(2)-adrenoceptors+and+p75+neurotrophin+receptors+in+rats+with+steroid-induced+polycystic+ovaries.">Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries.</a> Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).</li><li>Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annual+and+periovulatory+changes+in+tyrosine+hydroxylase+activity+in+the+ovary+of+the+catfish+Heteropneustes+fossilis.">Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis.</a> Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).</li><li>Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Serotonergic+Fibers+in+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+the+CLARITY/CUBIC+Technique.">Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique.</a> J Vis Exp. (108), e53673 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Sci Rep. 6, 26013 (2016).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+pathological+angiogenesis.">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).</li><li>Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+ovarian+follicular+antrum+and+follicular+fluid.">Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid.</a> Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).</li><li>Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-follicle+barrier+(BFB)+in+disease+and+in+ovarian+function.">The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function.</a> Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clear(T):+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Lai, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationalisation+and+validation+of+an+acrylamide-free+procedure+in+three-dimensional+histological+imaging.">Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging.</a> PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-acrylamide+SDS-based+tissue+clearing+(FASTClear):+A+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualisation+of+human+brain+tissues.">Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+three-dimensional+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue.</a> Sci Rep. 7, 9895 (2017).</li><li>Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+an+essential+role+of+vasoconstriction+in+rupture+of+the+ovarian+follicle+at+ovulation.">In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).</li><li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-mount+approach+for+accurate+quantitative+and+spatial+assessment+of+fetal+oocyte+dynamics+in+mice.">A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice.</a> Biol Reprod. 93 (113), (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut çalışmada, kılcal damarlar ve bireysel büyüyen köklerinin arasındaki ilişkileri değerlendirmek için görüntüleme 3D tanıtacağız. Önceki çalışmalarda, aynı protokolü 9kullanarak rolleri büyük damarlara, köklerinin ve köklerinin olduğu gibi fare yumurtalık içinde konumunu arasındaki etkileşimler okudu. Pasif NETLİK yaklaşımı mikro ve makro vasculatures, folliculogenesis ve karşılıklı ilişkileri arasında corpora lutea ve köklerinin de yumurtalık mimarisi farklı gelişim dönemleri yeniden olarak çalışmaya izin verdi.
3D görüntü verileri olduğu gibi dokuların elde etmek için takas işleminin ilk önemli adımdır. İki ana strateji vardır — dehidratasyon ve hidrofilik reaktif tabanlı yöntemleri, pasif NETLİK10gibi. Su kaybı yöntemleri genellikle floresan sinyallerini azalmasına yol ve genellikle zehirli organik çözüm atık üretmek çünkü dikkatimizi pasif NETLİK yöntemi kullanmak için bazı adımlar çeşitli doku tipleri ile basitleştirilmesi üzerinde odaklanmıştır.
İlk kritik takas işleminin transcardial perfüzyon işlemdir. Perfüzyon sırasında kalp pompalama arka plan Floresans azaltmak için kan floş PBS ve hidrojel çözümün tüm vücut dolaşımda önemli bir rol oynar. Böylece, perfüzyon ameliyat doğru bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken ve hızlı bir şekilde hayvan hidrojel önce erken ölümü önlemek için tamamen hayvan dağıtılır. Tüm ajanlar buza tüm deneme sırasında Liang et al. tarafından belirtildiği gibi tutulmalıdır 11veya perfüzyon tamamlanmadan önce polimerize başlayacak. Önemli bir adım hidrojel kaldırıyor ve mümkün olduğunca çok fazla jel olarak antikorlar korur çünkü kaldırmak gereklidir. Doku temizlenir sonra takas çözümden kaldırıldı ve takas çözüm çok fazla zaman çok fazla protein kaybolmasına neden olacağından PBS 4 ° C'de depolanan gerekir. Confocal mikroskobu görüntülemede Z-ayarlar her zaman önce X-Y aralığı ayarlamanız gerekir. İlk önce X-Y aralığı ayarlarsanız, Z-ayarlar X-Y alanın tamamı eşitlenemiyor.
Pasif NETLİK ilk Yang vd tarafından kullanılmıştır 12 onların protokolündeki onlar perfüzyon adım gerçekleştirmedi ve bunun yerine azot ile degassed. Buna ek olarak, onların takas çözüm bisacrylamide hidrojel çözüme eklemek değil, onlar % 8 SDS takas çözümde kullanılan ve Kırılma indisi için medya eşleşen jantlar kullandılar. Bu yöntem daha sonra SDS konsantrasyon13artan, perfüzyon adım ve nitrojen içermeyen gaz giderme yordamı14ekleme ve PARS mPACT15gibi diğer Temizleme yöntemleri yöntemiyle birleştirerek tarafından geliştirildi. Burada, daha fazla iletişim kuralı transcardial perfüzyon birleştiren ve nitrojen içermeyen gaz giderme, % 4 takas çözümde SDS azalan ve FocusClear kırılma daha kaliteli sağlayan medya, eşleşen dizin olarak kullanarak geliştirdiğimiz mikroskopi görüntüler.
Pasif NETLİK sonra yumurtalık foliküler damarlara sağlam 3D mimari elde etmek için confocal multiphoton mikroskobu ve görüntü analizi gerçekleştirilebilir. Bu iletişim kuralı tarafından antikorlar16oluştururlar penetrasyon için uygun bir optik şeffaf hidrojel melezleşmiştir nanoporous formu ışığı geçirgen olduğu gibi yumurtalık dönüstürür. Klasik 2D Seksiyonel histolojik analizler pasif NETLİK ve belirli işaretleri ile boyama kılcal damarlar ve bireysel büyüyen köklerinin arasındaki bağlantıların 3D eşleme sağlar.
Yetişkin dokularda etkin vasküler remodeling ve anjiogenezi ağırlıklı oluşur yara iyileşmesi, kırık tamir, tümör ve metastaz oluşumları, retinopathies, fibroses ve romatoid artrit17gibi patolojik süreçler sırasında. Ancak, folliculogenesis sırasında döngüsel değişiklikler damarlara remodeling için benzersiz kapasite temsil eder. İkincil foliküller test oluşumu sonra foliküler sıvısı doldurur ve oosit olgunlaşma ve foliküler gelişim18için uygun bir microenvironment sağlayan oosit ferahlık veriyor. Önceki 2D çalışmaları Imaging yumurtalık köklerinin bir ağ kılcal granulosa olaraktan19ile çevrili gösterdi. Granulosa katman nonvascular ve her folikül kendi kılcal damarlar tarafından çevrilidir. CD31 önemli rol vasculogenesis6ile tutarlı, artış kılcal damar uzunluğu folliculogenesis birincil ikincil foliküller (rakamlar 2 g ve 2 H) geçiş sırasında bulduk. Yerine rasgele bir dağıtım kapiller çevresinde bireysel birincil veya ikincil foliküller kapiller 3D imar kılcal damar dalları folikülleri içinde dağıtılmış büyük köklerinin algılanabilir olduğunu gösterdi ve bunlar çoğu durumda kılcal damar dalları içi boş alan (şekil 3) kurdu.
Bir büyük endişe adapte yöntemi yumurtalık temizlemek için oldukça uzun bir zaman alır, ama uzun süre için en iyi etkisi temizlenmesi gereklidir. Biraz zaman kazanmak için tüm gerekli örnekleri aynı anda toplama ve temizlenen doku PBS ve %0.02 sodyum azid 4 ° C'de birkaç ay için saklanabilecek olan çünkü onları birlikte temizlemek öneririz. Çalışma mesafesi confocal mikroskop başka bir kısıtlamadır. Yüksek büyütme objektif lensler görüntüleme kalın örnekleri için bir engel olabilir daha kısa çalışma mesafeler var.
Birkaç protokol şeffaf ve sağlam dokular, BABB20, ölçek21, 3DISCO22, berrak23, SeeDB24, NETLİK16, pasif açıklık da dahil olmak üzere görüntüleme için ortaya konan (4 ya da hidrojel25), tüm yumurtalık dokusu temizlenmesi ve değerlendirme9PAKTI12, kübik26,27, FASTClear28ve aslında29, ama sadece üç tane kullanılmaya başlandı, 30,31. SeeDB30 ve ScaleA231 tüm yumurtalık dokuları görüntüleme için getirilmiştir, ancak bu iletişim kuralları yalnızca bir tek immunostaining adım. Pasif NETLİK, ancak, bu da çalışmanın ve bizim önceki çalışma9gösterildiği gibi birden fazla protein etiketleme reaksiyonlar için sağlar.
Sonuç olarak, foliküler katmanları ve kan damarları tamamen açıklık yumurtalık dokusu kullanarak 3D yapısal ilişkisi belirlenmesi için adapte bizim protokol angiogenez farklı yumurtalık hastalıkları gibi çalışmak için yeni bir yaklaşım sağlar polikistik over sendromu ve yumurtalık kanserleri.

Folikül temel yapısal ve Fonksiyonel yumurtalık birimidir ve onun gelişme son derece yumurtalık içinde damarlara ilgilidir. Kan damarları beslenme ve hormonlar köklerinin sağlamak ve böylece büyüme ve olgunlaşma köklerinin1önemli rol oynarlar.
Seçici kan damarı işaretleri, transgenik fare modelleri ve ilaç geliştirme teknolojileri kombinasyonu yumurtalık damar ağları, anjiogenez ve kan damarlarının fonksiyonu hakkında bilgimizi artmıştır folliculogenesis. Bu remodels çeşitli doku ve damar ağları folliculogenesis ve yumurtlama sırasında yumurtalık etkin bir organ bilinir. Boyutu ve yapısı damarlarının etkin böyle remodeling geliştirme ve köklerinin işe biyolojik fonksiyonu için gereklidir.
Yumurtalık bölümler ve immunolabeling kan damarlarının kullanarak geleneksel histolojik ve histomorphometric yöntemleri için iki boyutlu (2B) görüntüleri2sınırlıdır. Üç boyutlu (3D) imar teknolojilerinin gelişmesiyle birlikte, dokusu dilimlerin 2D görüntüleri 3D bir yapı yapmak için örtüşen, ancak bu yöntem, hala bazı sınırlamalar vardır — doku kesit microstructures, bazı kısımları yok doku genellikle eksik ve önemli emek dilimleri elde edilen görüntülerden 3B rekonstrüksiyonlar yapımında ilgilenmektedir. Bütün doku 3D görüntüleme confocal mikroskobu ile bu sınırlamaların çoğunu üstesinden gelebilir, ama bu yöntemlerin angiogenez embriyonik Over3değerlendirilmesi ile sınırlıdır. Bütün doku NETLİK4 gibi yöntemleri takas kullanarak doğum sonrası ve yetişkin yumurtalık bu sorunları çözmek için görüntülenmeyecektir birimin artırabilir ve optik izni olmadan herhangi bir yapısal deformasyonlar yumurtalık tür yöntemler sağlar. Sağlam yumurtalık 3D mimari görüntüleme için görüntü analiz yazılımı, bu çalışmada kullanılan Imaris yazılım paketi gibi bir doğru görüntü veritabanı sağlar.
Yumurtalık yetişkinlik boyunca remodeling dinamik bir fizyolojik sistemin ve bu yönetmelik angiogenez soruşturmalar için mükemmel bir model yumurtalık yapar. Ayrıca, polikistik over sendromu veya yumurtalık kanserleri gibi kadın üreme sisteminin patolojik koşullarında yumurtalık kan damarları rolünün değerlendirilmesi tüm yumurtalık dokusu görüntüleme aracılığıyla okudu. Pasif NETLİK yöntem geliştirilmesi ve gelişmiş görüntü analizi yazılımı kullanımı olması koşuluyla detaylı mekansal bilgi kan damarları ve köklerinin gibi yumurtalık yapıları arasındaki ilişkileri.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide</td><td>Vetec</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 (Dilution 1:50)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Alexa Flour 594 (Dilution 1:50)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>Bisacrylamide</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>Black wall glass bottom dish (Willco-Dish)</td><td>Ted Pella</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10004818</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&amp;amp;BRDarea=1</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>80096618</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td></tr><tr><td>PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>Photoinitiator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>30166428</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

three-dimensional reconstruction of the vascular architecture of the passive clarity-cleared mouse ovary

Yumurtalık kadın üreme sisteminin ana organ ve kadın gamet üretim için ve endokrin sistem, karmaşık yapısal ilişkiler ve üç boyutlu (3D) damarlara mimarileri, ama kontrol etmek için önemlidir Yumurtalık de açıklanan değildir. 3D bağlantıları ve bozulmamış yumurtalık kan damarlarının mimarisini görselleştirmek için ilk önemli adım yumurtalık optik açık hale getirmektir. Doku büzülme önlemek amacıyla, biz hidrojel kullanılan pasif NETLİK fiksasyon tabanlı (Akrilamid melezleşmiştir Rigid temizleyin Lipid değiş tokuş görüntüleme / Immunostaining/In situ hibridizasyon-uyumlu doku hidrojel) protokol yöntemi sağlam bir yumurtalık temizlemek için . Immunostaining, Gelişmiş multiphoton confocal mikroskobu ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu yumurtalık damarlarının ve foliküler kılcal görselleştirme için kullanılmıştır. Bu yaklaşımı kullanarak, önemli bir pozitif korelasyon gösterdi (P < 0,01) foliküler kılcal damarlar ve foliküler duvar hacmi uzunluğu arasında.

Biz pasif yumurtalık foliküler ve vasküler mimari koruma ve damarları ve köklerinin etiketli işaretleri en yüksek floresan sinyal alma sırasında takas için hızlı ve basit bir yöntem pasif NETLİK yöntemi uyarlanmış. Foliküler damarlara 3D mimari CD31, endotel hücreleri6avans için immunostaining tarafından tespit edilmiştir. Yetişkin fareler yumurtalıklarda CD31 boyama Filament algoritmasıyla ve foliküler kılcal damarlar ve birincil ve ikincil foliküller (şekil 1) arasındaki karşılıklı ilişkileri gösterdi takip ettiler.
Yüzey algoritmaları ve nokta dönüştürme tirozin hidroksilaz-immunostained yumurta ve granulosa ve thecal Katmanlar algılamak ve köklerinin7,8toplam hacmini hesaplamak için kullanılmıştır. Köklerinin sıkıştırma nedeniyle, bazı bölümleri kırpılmış köklerinin yarı el ile tespit edilmiştir. Nokta dönüştürme bireysel foliküler birim ve yumurta ve foliküler duvar katmanların yüzey yeniden yapılanma ve gemilerin inşası Filament sonra bireysel foliküler vasculatures ve diğer arasındaki ilişkileri temizleyin ölçülen endeksi, özellikle granulosa ve thecal katman birimleri, (Şekil 2) tespit edildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56141/56141fig1.jpg"> Resim 1 : Bir bozulmamış yetişkin mouse ovarium yüksek çözünürlüklü görüntü adapte pasif NETLİK protokolü ile takas sonra. (A-B) Bölümler ve XYZ büyük-edinme inceden inceye gözden geçirmek. Üç boyutlu (3D) kesilmiş orta (C) ve birincil (D) köklerinin (üst satır) ve 3D yeniden kılcal damarlar, yumurta ve granulosa/thecal (alt satır) aynı folikül hücrelerinin Filament tarafından tanımlandığı gibi gösterilir yüzey, ve Nokta dönüştürme algoritmaları. Ölçek çubukları 200 µm (A-B), 50 µm (C), 30 µm (D) =.  <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56141/56141fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56141/56141fig2.jpg"> Resim 2 : Birincil ve ikincil yumurtalık köklerinin ve onların vasculatures arasındaki ilişkileri karşılaştırmalı endeksleri. Oosit birim(a)foliküler birim ve yumurta nokta dönüştürme algoritması tarafından belirlenen bireysel folikülleri içinde 3D rekonstrüksiyonlar sonra ayıklandı ve (B) foliküler duvar birim yüzey tarafından belirlendi algoritma ve kılcal Filament algoritması tarafından takip edildi. Foliküler birim (C), oosit birim/kılcal uzunluğu oranı (D), foliküler duvar birim/kılcal uzunluğu oranı (E), foliküler birim/kılcal damar uzunluğu oranı (F), kapiller süre (saat) ve kılcal damar uzunluğu ve foliküler duvar hacim (G) korelasyon hesaplanan uygun araçları yazılım paketi kullanarak. Hata çubukları temsil eden standart hataları anlamına gelir. n = 6; * P < 0,05; ** P < 0,01. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56141/56141fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56141/56141fig3.jpg"> Şekil 3: Mouse ovarium ikincil köklerinin kılcal üç boyutlu rekonstrüksiyon. Bu ortaya (beyaz kareler göster alanı sınırları) köklerinin oosit yan üstüne içi boş bir boşluk. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56141/56141fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary at JoVE.com

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Görüntüleme.  Fudan University. Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.

Video: Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all gynecologic malignancies among US women 1,2,3. Serous tumors are the most widespread forms of ovarian cancer and 4,5 the Tg-MISIIR-TAg transgenic represents the only mouse model that spontaneously develops this type of tumors. Tg-MISIIR-TAg mice express SV40 transforming region under control of the Mullerian Inhibitory Substance type II Receptor (MISIIR) gene promoter 6. Additional transgenic lines have been identified that express the SV40 TAg transgene, but do not develop ovarian tumors. Non-tumor prone mice exhibit typical lifespan for C57Bl/6 mice and are fertile. These mice can be used as syngeneic allograft recipients for tumor cells isolated from Tg-MISIIR-TAg-DR26 mice.
Objective: Although tumor imaging is possible 7, early detection of deep tumors is challenging in small living animals. To enable preclinical studies in an immunologically intact animal model for serous ovarian cancer, we describe a syngeneic mouse model for this type of ovarian cancer that permits in vivo imaging, studies of the tumor microenvironment and tumor immune responses.
Methods: We first derived a TAg+ mouse cancer cell line (MOV1) from a spontaneous ovarian tumor harvested in a 26 week-old DR26 Tg-MISIIR-TAg female. Then, we stably transduced MOV1 cells with TurboFP635 Lentivirus mammalian vector that encodes Katushka, a far-red mutant of the red fluorescent protein from sea anemone Entacmaea quadricolor with excitation/emission maxima at 588/635 nm 8,9,10. We orthotopically implanted MOV1Kat in the ovary 11,12,13,14 of non-tumor prone Tg-MISIIR-TAg female mice. Tumor progression was followed by in vivo optical imaging and tumor microenvironment was analyzed by immunohistochemistry.
Results: Orthotopically implanted MOV1Kat cells developed serous ovarian tumors. MOV1Kat tumors could be visualized by in vivo imaging up to three weeks after implantation (fig. 1) and were infiltrated with leukocytes, as observed in human ovarian cancers 15 (fig. 2).
Conclusions: We describe an orthotopic model of ovarian cancer suitable for in vivo imaging of early tumors due to the high pH-stability and photostability of Katushka in deep tissues. We propose the use of this novel syngeneic model of serous ovarian cancer for in vivo imaging studies and monitoring of tumor immune responses and immunotherapies.

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

To study in vivo tumor growth and tumor microenvironment, we used a syngeneic and orthotopic mouse model of ovarian cancer in immunocompetent animals. We transduced a mouse tumor cell line (MOV1) with Katushka fluorescent protein (MOV1KAT) and here we show its orthotopic implantation in ovary and in vivo imaging.

Immünkompetan Fare Seröz Yumurtalık Kanseri bir Ortotopik Model In vivo</emTümör Bağışıklık Yanıtları> Tümör Görüntüleme ve İzleme

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Gelişim Biyolojisi

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Nörobilim

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Biyoloji

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

Yetişkin Fare Yumurtalıklarında Doğru Folikül Numaralandırması

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Retinal Pericytes Visualization Using Tissue-Clearing and Fluorescent Labeling

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Biyokimya

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...