The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).

<ol>
	<li>Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+rules+for+diffusive+drug+delivery+in+tumor+and+normal+tissues.">Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery.">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).</li><li>Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+tissues+on+a+chip+for+drug+discovery.">Biomimetic tissues on a chip for drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).</li><li>Jeon, J. S., Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation.">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).</li><li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion.">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2016).</li><li>Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Self-Assembled+Microvascular+Networks+with+Microfabricated+PEG-Based+Hydrogels.">Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Biomimetic+Patterning+in+Hydrogels+to+Guide+Cellular+Organization.">Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization.</a> Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+functional,+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip.">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).</li><li>Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Hydrogels+with+Immobilized+EphrinA1+for+Therapeutic+Angiogenesis.">Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).</li><li>Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-demanded+release+of+VEGF+from+synthetic,+biointeractive+cell-ingrowth+matrices+for+vascularized+tissue+growth.">Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth.</a> FASEB J. , (2003).</li><li>He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+assembly+of+3D+perfusable+microfluidic+hydrogels.">Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).</li><li>Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+mixing+in+three-dimensional+microvascular+networks+fabricated+by+direct-write+assembly.">Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly.</a> Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).</li><li>Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omnidirectional+Printing+of+3D+Microvascular+Networks.">Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks.</a> Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).</li><li>Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+of+Vascularized,+Heterogeneous+Cell-Laden+Tissue+Constructs.">3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs.</a> Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).</li><li>Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function.">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li><li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems.">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).</li><li>Dawson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+laws+for+capillary+vessels+of+mammals+at+rest+and+in+exercise.">Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise.</a> Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).</li><li>Vogel, A., Noack, J., H&#252;ttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues.">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li><li>Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Photoablation+of+Guidance+Microchannels+into+Hydrogels+Directs+Cell+Growth+in+Three+Dimensions.">Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions.</a> Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).</li><li>Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+guidance+of+DRG+neurite+outgrowth+using+multi-photon+photo-ablation.">Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation.</a> , 116-119 (2009).</li><li>Applegate, M. B., Coburn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-based+three-dimensional+multiscale+micropatterning+of+biocompatible+hydrogels+for+customized+tissue+engineering+scaffolds.">Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).</li><li>Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-generated+microtracks+in+3D+collagen+lattices:+principles+of+MMP-dependent+and+-independent+collective+cancer+cell+invasion.">Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion.</a> PB. 8 (2), (2011).</li><li>Naik, P., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Blood-Brain+Barrier+Models:+Current+and+Perspective+Technologies.">In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies.</a> J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).</li><li>Choe, Y., Mayerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+Preparation,+Imaging,+and+Analysis+Protocols+for+Knife-edge+Scanning+Microscopy.">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy.</a> JoVE. (58), (2011).</li><li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+macro-scale+transmission+imaging+of+microvascular+networks+using+KESM.">Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM.</a> Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).</li><li>Chung, J. R., Sung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Exploration+of+Mouse+Brain+Microstructures+Using+the+Knife-Edge+Scanning+Microscope+Brain+Atlas.">Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas.</a> Front. Neuroinform. 5, (2011).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).</li><li>Slater, J. H., Culver, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Slater, J. H., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted,+Micropatterned+Surfaces+and+Image-Guided+Patterning+Using+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography.</a> Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).</li><li>DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+immobilization+of+RGDS+on+hydrogel+surfaces+to+direct+cell+alignment+and+migration.">Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration.</a> J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).</li><li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically-tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions.">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+Hydrogels+for+Dynamic+Tuning+of+Physical+and+Chemical+Properties.">Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li><li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+two-photon+photodegradation+of+PEG+hydrogels+to+study+and+manipulate+subcellular+interactions+on+soft+materials.">Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials.</a> Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı bozulması için sanal maskeler kullanımını etkinleştirmek için mikroskop yazılımı standart fonksiyonları geçersiz kılma Kritik, mikroskop makro kurulumu ve dikkatle manipüle olmalıdır. Nasıl mikroskop makro ile mikroskop yazılım arayüzleri bazen sezgilere aykırı olabilir ve çok çaba bu yöntemi geliştirmek için her iki programda en iyi ayarları belirlenmesinde yatırım oldu. Temel lazer tarama konfokal mikroskop kullanımı genel bir anlayış özellikle &quot;Sahne&quot; ve bulma ve doğru lazer tabanlı bozulması başlamadan önce, x, y ve z boyutlarında hidrojel konumlandırılması için &quot;Focus&quot; pencereler ile tavsiye edilir. Ayrıca, bir giriş kanalının imalat protokolü için kritiktir; asma floresan türlerin başarılı görüntüleme ve ağ karakterizasyonu için mikroakışkan sistemleri girmek gerekir. Protokol, spesifik bir geçerli olduğu not etmek önemlidir, lazerlitarama konfokal mikroskop özel mikroskop yazılımı sürümlerini ve mikroskop makro (Belirli Malzemeleri / Ekipman Listesi ayrıntılarını görmek) çalıştıran, belirli bir femtosaniye darbeli lazer ile yapılandırılmış. Biz mikroskop makro yeni sürümleri görüntü kılavuzluğunda lazer kontrolü için gerekli olan gerekli kontrol ve işlevsellik eksikliği olduğunu keşfettiler. Diğer mikroskop platformları ve darbeli lazer kaynaklar kullanılabilir olsa da, bu protokol bu sistem özellikle geçerlidir ve uygulanan bir platform, lazer kaynağı ve yazılımlara göre değişiklik gerekir. Bu protokol boyunca temel ilkeleri Fakat hala uygulanır. Bu protokole olası değişiklik hidrojel kompozisyonunu değiştirerek içerir. PEG&#39;lenmiş fibrin dahil sentetik ve doğal hidrojeller, hem de aşağılamak için uygulamaya konmuştur Burada 5 ağırlıkça% 3.4 kDa PEGDA hidrojeller, kullanılan ama (mikroakışkan ağ nesil kenara amaçlar için) lazer tabanlı bozulma21,22 ogen, ipek proteini 23 hidrojeller ve kollajen 24. lazer gücü, tarama hızı, Z-dilimleri arasındaki aralık ve tekrarlama sayısının ayarlanması diğer hidrojel formülasyonlarda mikroakışkan ağları imal etmek en uygun parametrelerin belirlenmesinde yardımcı olacaktır. tekniğin bir akım sınırlama zaman uygun bir miktarda parçalanabilir hidrojel genel hacmidir. Açık boşlukları veya hidrojel içinde mikroakışkan özellikleri oluşturmak için, lazer 37.7 nJ / mikron 2 bir lazer dozu kullanırken zaman (/ ms veya 0.021 mikron bir lazer tarama hızı) veya 8.96 us / piksel üzerinde olmalıdır yaşamak. (Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi) bu ayarlar ile, 0.014 mm 3 hacmi içindeki damarları aşağılamak için 1.4 saat sürer. Aşağıdaki 4.48 us / piksel veya bir lazer bekleme süresi kullanılarak, iletilen enerji burada kullanılan hidrojel formülasyonunun tam bozulması için yeterli değildir. Farklı hidrojel uygulanmasıkompozisyon bu sınırlamanın üstesinden gelebilir. Işığa duyarlı bileşenler 34-36 veya büyük multiphoton kesitleri 21-24 olan hidrojeller ihtiva fotolabil jellerin kullanılması daha az enerji kullanılmasını sağlayacak ve daha hızlı düşmesine neden olur iyi seçeneklerdir. Boyutsal kısıtlamalar ile ilgili olarak, özellikler, hidrojel 7 derin 1.5 mm&#39;ye kadar imal edilmiştir. Derinlik elde objektif çalışma mesafesi bir fonksiyonudur ve in vivo görüntüleme için optimize edilmiş ultra uzun çalışma mesafesi hedefleri kullanarak arttırılabilir. Küçük ölçülen kanal 7 20X (NA1.0) suya daldırma hedefi Şekil 1&#39;de oluşturulan küçük kanalların büyüklüğü ile eşit olan 8.9 um 3.3 mikron genişliği ve derinliği vardı kullanarak oluşturdu. Diğer laboratuarları düşük NA hedeflerini 21,23,24 kullanmış olsa da, biz daha küçük özelliklere sahip mikroakışkan ağlar yüksek kullanılarak oluşturulabilir tahminazaltılmış çalışma mesafesi pahasına er NA hedefleri. Sonuç olarak, bununla birlikte, teknik çözümü odaklanmış lazer ışınının nokta dağılım fonksiyonunun bir fonksiyonudur, lazer tarama özellikleri, lazer tarafından sağlanan enerji miktarı ve malzemenin, lazer emme özellikleri düşürmektedir. sentetik genel protein bazlı: Bundan başka, lazer özellikleri (hız, akıcılık sanal maskeleri ve tekrar sayısı arasındaki mesafe) (çapraz bağlanma yoğunluğu, makromer / monomer molekül ağırlığı, ağırlıkça yüzde ve hidrojel hidrojel özelliklerine göre optimize edilmelidir ), bu doğal lazer ve böylece sürecin nihai kararı ile etkileşimlerini değiştirmek gibi. teslim enerjisi de kullanılır amaç etkilenir olarak hedefleri arasında geçiş yaparken, ek optimizasyon gereklidir. masrafları ile ilgili olarak, darbeli bir lazer ile mikroskop erişim gereklidir ve birçok farklı objec isetives yüksek Na ve (in vivo görüntüleme için) uzun bir çalışma mesafesi olan pahalı olabilir, kullanılabilir. Yukarıda ve burada ayrıntılı protokol ötesinde, bu teknik kullanılarak üretilebilir mikroakışkan ağlar da endotelyal hücre yapışma ve lümen oluşumu 7 uyarılması için hücreye yapışan peptidlerin sonrası kanal üretim fonksiyonalize edilebilir. Ayrıca, bozulmasını kanal dökme malzemenin 9 öncesinde hücre-bozunur peptid dizilerinin birleştirilmesi içine ve hidrojel yoluyla hücre göç çalışma için izin verebilir. Şekil 2 ve 3&#39;te 7 gösterildiği gibi hidrojel içinde mikroakışkan ağ sürekli akışkan hale getirme için, hidrojel, daha büyük bir akışkan cihazları veya yuvalara foto polimerize edilebilir. Vaskülojenik veya anjiyojenik kendini montaj 8-12 yoluyla vasküler ağların nesil va ikna etmek için basit yaklaşım sağlarnispeten büyük bir hidrojel hacmi boyunca scularization. Bu yaklaşım, perfusable akışkan ağlar neden olsa da, doğrudan boyutu, eğrilik, yoğunluğu ve genel olarak ağ mimarisi kontrol etmek zordur. Bu sınırlama nedeniyle, damarsal akış profili ve kesme hızları deneyler arasında farklılık gösterebilir. Alternatif olarak, imalat teknikleri 13-16 ağ mimarisi üzerinde doğrudan kontrol için izin ancak genellikle küçük, kılcal ölçekli kanallar veya in vivo vasküler mimarisinde taklit yoğun ağların imalat üretmek için kendi yetersizlik ile sınırlıdır. Burada özetlenen lazer tabanlı hidrojel bozulması tekniği yeni mikroakışkan nesil için repurposed olsa da, aynı anda, mimari kontrol ve yoğunluğu, kıvrımlı özetlemek 3D biomimetic microfluidic ağlarının oluşturulmasını sağlayarak mevcut mikroüretim yöntemlerinin boyutu tabanlı sınırlamaları hem üstesinden boyut aralığı ve genel architecturin vivo damar örn. Ayrıca, birden fazla akışkan ağlar arası ağ taşıma 7 çalışma sağlayan tek bir hidrojel oluşturulabilir. Daha yakından in vitro, in vivo taşıma süreçlerinde çoğaltmak için çalışıyoruz doku mühendisliği uygulamaları için, burada özetlenen yüksek çözülmesi hidrojel gömülü mikroakışkan ağlar uygundur. Biz bu protokol doku yapıları geliştirilmesinde yararlı olacağını tahmin uyuşturucu tarama cihazları gibi ve in vitro hastalık modellerinde kullanılmak üzere daha doğru taklit in vivo ulaşım.

lenfatik ve cardiovasculature hem oluşan damar sistemi, form besin ve oksijen taşınması için ve metabolik atıkların uzaklaştırılması için gerekli olan son derece yoğun ağlar. Buna göre, vaskülarize dokularda yaşayan hücreler daha fazla 50-100 mikron uzaklıkta bir teknenin 1 asla. In vitro, in vivo vasküler mimarisini yeniden yeteneği doğru tasarlanmış yapılar kullanılarak in vivo taşıma işlemleri modellemek için çok önemlidir. 3,4 ve hastalık modelleme 5,6 tarama yüksek verimli ilaç organ-on-a-chip cihazlar 2 geliştirmek için yeni bir sürücü ile, yöntem çizim sentetik veya doğal hidrojeller in vivo benzeri ulaşım özetlemek mikroakışkan ağlar oluşturmak için önemli ilgi. Bu cihazlarda kullanılan microtissues bir biyomimikri artırmak için, üç-dimensiona kullanan bir görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı hidrojel bozulması yöntem geliştirdişablon olarak yerli damarların l (3D) görüntü yığınlarının 7 hidrojeller PEGDA gömülü vasküler kaynaklı mikroakışkan ağları oluşturmak için. Bu protokol görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı bozulması yoluyla PEGDA hidrojellerin vasküler kaynaklı, biomimetic microfluidic ağlar imal etmek bir femtosaniye darbeli lazer ile donatılmış bir piyasada mevcut lazer tarama konfokal mikroskop kullanımını özetliyor. Hidrojeller akışkan hale getirilmesi için güncel yaklaşımlar endotelizas- 13-16 için önceden tanımlanmış kanalları oluşturmak için vaskülojenik 8-10 veya anjiyojenik 10-12 endotel hücre kendinden montaj ve mikroüretim teknikleri indüksiyon yer alıyor. Kendi kendini monte ağlar yoğunluğu ve mikrovasküler karmaşık mimarisi özetlemek olsa da, sık sık ilaç tarama uygulamaları için modelleme taşımacılığında sorunlu olabilir, in vivo ağlar 11,17,18, daha geçirgendir. Kendi kendine monte ağlar physiolog oluşmaktadırically ilgili, kılcal boyutlu gemiler, ama onlar yüzünden büyük arteriole boyutlu gemiler üreten sınırlamalara toplu sıvı akışı ile entegre etmek zor olabilir. Bu ağların montajı üzerinde doğrudan kontrolü yoktur gibi, nihai mimari tekrar tekrar aynı sıvı akışı ve ulaşım özelliklerine sahip ağları üretmek güçleştirir, numuneden numuneye değişebilir. 3D, tekrarlanabilir geometri ve iyi tanımlanmış bir mimariye sahip hidrojel gömülü mikroakışkan ağları oluşturmak için, mikroüretim bir takım teknikler modüler montaj 13, kurbanlık malzemeler 16, doğrudan yazma montaj 14 ve çok yönlü baskı 15 3D baskı da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Bu yöntemler, mikroakışkan mimari ve bundan dolayı, sıvı akışı ve iletim özellikleri uygulama, arka arkaya bir çok yapılar arasında imal edilebilir. Bu yaklaşımların önemli bir sınırlama, ancak, mikro fiber oluşturmak için yetersizlikkılcal boyutlu özellikler luidic ağlar, 4 10 um ile 19. En çok imalat teknikleri, genellikle çapı 13,16 150 650 | im arasında değişen özelliklere sınırlıdır. Bazı mevcut teknikler doğrudan yazma montaj 14 10 mikron 300, geniş çaplı aralığında kanalları ile hiyerarşik ağlar üretme yeteneğine sahiptir ve çok yönlü baskı 15 18-600 mikron, ancak yoğun ağlar veya oluşturmak için kendi yeteneği sınırlıdır tek bir yapı 7 içinde yakın birden mikroakışkan ağları üretmek. Bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek için, biz biomimetic tekrarlanabilir üretim, in vivo mikrovasküler mimarisini özetlemek hiyerarşik mikroakışkan ağlar sağlayan bir görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı hidrojel bozulması tekniği geliştirdi. Yani bir 790 nm, 140 femtosaniye (fs) 80 MHz&#39;de çalışan darbeli lazer yapmak raster taranan iin vivo damarların görüntüleri ile tanımlanan n, bir hidrojel içinde 3D yerleri arzu. Bu su 20 genişlerken bozunma proses suyu lazer endüklenmiş bir ışıksal bozulma, elde edilen plazma oluşumu, su daha sonra hızlı bir termoelastik genişleme ve hidrojel yerel olarak bozulmasına aracılığıyla çalışır speküle. Bu mekanizma protein bazlı hidrojellerin 21-24 lazer tabanlı bozulması biraz değişir. Düşük multiphoton enine kesite sahiptir PEGDA farklı olarak, proteinler, genellikle büyük multiphoton kesite sahiptir ve bu yüzden, bir multiphoton emilimi ile indüklenen kimyasal kırılma 23 yoluyla degradasyona uğrar. Görüntü kılavuzluğunda mikroakışkan ağları oluşturmak için, lazer deklanşör mikroakışkan mimarisini tanımlayan ilgi 9 bölgelerin bir mozaik oluşur görüntü türetilmiş sanal maskeleri, tarafından kontrol edilir. Bu yaklaşımı kullanarak, 3D vasküler kaynaklı biomimetic mikroakışkanlar imal yeteneğini göstermiştiramacıyla, in vivo damarların yoğun ve dolambaçlı mimarisi özetlemek ic ağlar, yerel bozulması sırasında verilen enerji miktarını değiştirerek hidrojellerin gözenekliliğini kontrol eder. Biz de yakın (15 mikron) iç içe geçmiş ancak doğrudan 7 bağlamak asla iki bağımsız mikroakışkan ağları oluşturmak mümkün olmuştur. Ayrıca, arginin-glisin-aspartik asit-serin (RGDS), endotelyal hücre yapışma ve lümen oluşumu 7 teşvik etmek için, integrini bağlanması peptid dizisi ile sonrası bozunma işlevsellik üzerinden lazer bozulmuş mikrokanallar endoteliyalize yeteneğini göstermiştir. Bu protokol ile, PEGDA hidrojeller karmaşık mikroakışkan ağların nesil birçok üniversite kampüslerinde erişilebilir piyasada bulunan bir mikroskop kullanılarak görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı bozulması ile mümkün olmaktadır. bozulma süreci, dijital, sanal maskeleri tarafından yönlendirilir gibi, bu fabricayon tekniği geniş bir uygulama çeşitli kullanımına izin veren, mikroakışkan ağların reklam dizaynı uygun. Biz burada anlatılan yöntem modelleme ilaç taşıma 2 önemli biyolojik taşıma süreçleri kopyalayan yeteneğine biomimetic organa ve insan-on-a-chip cihazları tasarlama en avantajlı olacağını tahmin ediyoruz. Bu imalat tekniği, kanser metastazı, 5,6 ve kan-beyin bariyeri modelleri 25 de dahil olmak üzere, in vitro bir hastalık modellerinin oluşturulması için ilgi çekici olabilir. Lazer tabanlı hidrojel bozulması önceden nöronal gelişim 21-23 rehberliği için parça oluşturmak için kullanılan edildiği gibi, bu tekniğin görüntü kılavuzluğunda uzatma kullanıcı tanımlı 3D uzamsal düzenlemeler hücreleri konumlandırmak için gelişmiş doku mühendisliği stratejileri faydalı olabilir.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>named &quot;programming software&quot; in protocol; refer to source 9 for details on algorithm</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td><td>NIH</td><td>version 1.51a</td><td>named &quot;image processing software&quot; in protocol</td></tr><tr><td>LSM 780 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>named &quot;laser-scanning confocal microscope&quot; in protocol; for laser-based hydrogel degradation</td></tr><tr><td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>release version 6.0</td><td>named &quot;microscope software&quot; in protocol; for use on Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td><td>named &quot;microscope macro&quot; in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen)</td></tr><tr><td>Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>for use on Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>named &quot;high-powered pulsed laser&quot; in protocol</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine (TEOA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 &amp;micro;m PES Membrane</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td>synthesized in house</td><td></td><td>refer to source 33 for synthesis methods; store under argon</td></tr><tr><td>Eosin Y disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood</td></tr><tr><td>3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>backing for handling of double coated tape</td></tr><tr><td>Model SC Plotter (adhesive cutter)</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes</td></tr><tr><td>60 mm Petri Dish with 20 mm Hole</td><td>MatTek Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>High Intensity Illuminator (white light source)</td><td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td>Power Meter</td><td>Newport</td><td>1916-R</td><td>detect power at 524 nm when using white light source</td></tr><tr><td>Slim Profile Wand Detector</td><td>Newport</td><td>918D-ST</td><td>for use with power meter</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods</td></tr><tr><td>TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round</td><td>synthesized in house</td><td></td><td>refer to source 7 for methods</td></tr><tr><td>Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td><td>can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel</td></tr><tr><td>1 mL Syringe, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc Syring Filter, 0.2 &amp;micro;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide VI&lt;sup&gt;0.4&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>microfluidic devices that can be used to house hydrogels</td></tr></tbody></table>

image-guided, laser-based fabrication of vascular-derived microfluidic networks

Bu ayrıntılı bir protokol PEGDA hidrojeller gömülü vasküler kaynaklı mikroakışkan ağlar imalatı için görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı hidrojel bozulması uygulanmasını özetliyor. Burada, görüntü kılavuzluğunda lazer kontrolü için izin sanal maskeleri oluşturulmasını açıklar; mikroakışkan ağ imalat ve basınçlı odaklı akışı için uygun bir micromolded PEGDA hidrojel, fotopolimerizasyon; Bir femtosaniye darbeli Ti ile eşleştirilmiş bir piyasada mevcut lazer tarama konfokal mikroskop kurulum ve kullanım: hidrojel bozulmasını teşvik S lazer; ve fabrikasyon mikroakışkan ağların görüntüleme floresan türleri ve konfokal mikroskopi kullanılarak. Bu inceliklerini bir dizi içerir mikroakışkan imalat amaçlı ticari bir mikroskop kullanılarak çok önemli adımlar olarak protokol çok, mikroskop yazılımı ve mikroskop makronun doğru kurulumu ve uygulanması üzerine odaklanmıştır. Bu techniqu görüntü kılavuzluğunda bileşenE böylece yaratıcı mikroakışkan tasarım ve hemen hemen tüm yapılandırma karmaşık mikroakışkan sistemlerin imalatı için izin 3D görüntü yığınlarının veya kullanıcı tarafından oluşturulan 3D modelleri uygulama olanağı sağlar. Doku mühendisliği beklenen etkisiyle, bu protokolde belirtilen yöntemler organa ve insan-on-a-chip cihazlar için gelişmiş biomimetic microtissue yapılarının üretiminde yardımcı olabilir. In vivo damarların karmaşık mimarisi, eğrilik, boyut ve yoğunluk taklit ederek, temel biyolojik taşıma süreçleri ilaç farmakokinetiği ve hastalığın daha doğru in vitro modelleme neden bu yapılarda çoğaltılmış olabilir.

3D, vasküler kaynaklı mikroakışkan ağını oluşturmak için görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı hidrojel bozulması uygulanmasını göstermek için, bıçak kenarlı tarama mikroskobu (KESM) 26, 27 üzerinden satın alınmıştır fare beynin damarsal bir 3D görüntü yığını kullanılan . Yukarıda açıklandığı gibi büyük mikrovasküler veri kümesi A seçilmiş 3D bölgesi, görüntü kılavuzluğunda mikroakışkan ağ oluşumu için sanal maskeleri bir dizi haline getirilmiştir. imalattan sonra elde edilen mikro-akışkan ağ FITC işaretli, 2.000 kDa dekstran çözeltisi ile perfüze edildi ve konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir. Ağ mimarisi (Şekil 1 A ve C) ve imal mikroakışkan ağı (Şekil 1B, D) gibi tanımlanmıştır, in vivo damar görüntü yığını Z çıkıntılar (Şekil 1 A ve B) ve 3D render (Şekil 1C üretilmesi için kullanılmıştır ve D </strong&gt;). Görüntülerin karşılaştırılması o görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı hidrojel bozulması boyutu, kıvrımlı ve in vivo damarların karmaşık mimarisi özetlemek 3D biomimetic microfluidic ağların imalat sağlar göstermektedir. tekniğin geniş bir çap aralığı içeren ağların üretimi için uygun olduğu; Şekil 1 içinde, 3.3 ile çapı 28,8 um arasında değişen kanal oluşturulmuştur. Şekil 1B sol üst ve Şekil 1D sol köşesinde büyük dikdörtgen yapı ağına akışını tanıtmak için giriş kanalı olduğunu unutmayın. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> Şekil 1: mikroakışkan Ağı Vasküler-Türetilmiş. Fare beyin damar (A ve C) bir görüntü yığını elde edilen sanal maskelerinin bir dizi, Fabrica&#39;ya kullanıldıgörüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı bozulması üzerinden PEGDA hidrojel (B ve D) gömülü bir 3D biomimetic microfluidic ağı te. mikroakışkan ağ 2.000 kDa FITC etiketli dekstran ile perfüze ve konfokal mikroskobu ile görüntülendi. Z-projeksiyonları (A ve B) ve iki ağların 3D render (C ve D) yoğunluğu, organizasyon ve in vivo damarların genel mimarisini özetlemek mikroakışkan ağları oluşturmak için yeteneğini göstermek. Ok (D) dekstran tanıtmak için oluşturulan dikdörtgen giriş işaretler. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Biz sıvı f başlatmak için iki yöntem, basınç kafaları ve şırınga pompaları, hayata geçirdikBu gömülü mikroakışkan ağlarda düşük. Örneğin, 30 30 ile um dikdörtgen kanal basınç kafası 7 üzerinden tahrik edilen akışkan akışı, bir micromolded PEGDA hidrojel iki kuyu (Şekil 2A) bağlamak için imal edilmiştir. iyi sol oluşturulan basınç kafasının sağda mikrokanal yoluyla ve kuyuya akışını kaynaklı. Şekil 2A, tetrametilrodamin (TRITC) bir başlangıç ön -etiketli olarak, 70 kDa dekstran zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak kanal üzerinden hareket gözlenmedi. Sağdaki kuyuya, kanaldan, iyi soldan Daha sonra, Şekil 2B&#39;de, 10 mikron çaplı floresan polistiren küre aktı. girişinde de micromolded sıvı mevcut hacmi kontrol akış süresi ve giriş arasında üretilen hidrostatik gradyanı ile kontrol edilen akış oranı ile ve de çıkış, micromolded hidrojellerin basınçlı tahrik akımı basit bir yöntem sağlar akış içintim, bir dış gövde ve bir şırınga pompası gerek olmadan. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> Şekil 2: Micromolded PEGDA Hidrojel Basınç Baş-Driven Akış. PEGDA gömülü mikrokanal ile bağlı iki kuyu içeren bir hidrojel oluşturmak üzere micromolded edildi. Bir basınç iyi bir ila 30 ile 30 um, dikdörtgen kanal boyunca akışını başlatmak için de sol TRITC-etiketli, 70 kDa, dekstran (A1-A3) ve 10 mikron polistiren küre (B1-B3) &#39;de oluşturulan diğer. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Alternatif olarak, mikroakışkan ağlar içinde sabit sıvı akışını oluşturmak için, şırınga pompası odaklı fDüşük şırınga pompası arabirim için giriş ve çıkış delikleri ile ikincil bir mikroakışkan cihazın içine hidrojel polimerizasyonu yoluyla başlatılabilir. Şekil 3A&#39;da, bir ticari olarak temin edilebilir, önceden imal mikroakışkan cihaz, 7 genişliği boyunca foto polimerize hidrojelin bir 1 mm bir bant ile gösterilmiştir. Lazer tabanlı bozulma hidrojeller solo için burada açıklanan aynı protokolü kullanarak ev sahipliği hidrojellerin mikroakışkan kanalları ve ağları imal etmek uygulanmıştır. Şırınga pompası tarafından üretilen akım, 20 mikron çaplı silindir şeklindeki kanal mikroakışkan cihaz içine yerleştirilmiş bir hidrojel imal edilmiştir Şekil 3B, görülebilir. 5 uL / s debi uygulandığında, küreler görüş alanı içinde hareket ise çizgiler ile kanıtlandığı gibi bu 20 mikron çaplı kanalında, bireysel 2 mikron floresan polistiren küreler kolayca, sıvı akışı olmadan (Şekil 3B1) çözümlenir (Şekil 3B2 &lt;/ Strong&gt; &#39;). Aynı yaklaşım, TRITC etiketli akışını izlemek için bir 2D, vasküler türetilmiş ağ akışı başlatmak için kullanılmıştır, çevredeki hidrojel (Şekil 3C), ağ ve difüzyon yoluyla 65 kDa dekstran. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> Şekil 3: mikroakışkan Konutlar PEGDA Hidrojellerinin Polimerize Şırınga Pompası-Driven Akış. 17 x 3.8 x 0.53 mm (x, y, z) mikrokanal ile ticari olarak temin edilebilen, önceden imal edilmiş mikro-akışkan cihazı (A) ile belirtilen bir Fotopolimerize 1 x 3.8 x 0.53 mm (x, y, z) PEGDA hidrojel, ev siyah ok. Bir 20 mikron çaplı silindirik bir kanal hidrojel ile hazmedilmiştir ve 2-mikron polistiren küreler aygıtı (B) aracılığıyla pompalanmıştır. Küreler açıkça sıvı akışı (B1) olmadan çözümlenir, ancak 5 uL / s akış hızında çizgiler olarak görünür(B2). Başka bir yer hidrojel, 2B vasküler türetilmiş ağı imal edilmiş ve TRITC-etiketli, 65 kDa dekstran ağı (C) ile pompalanmıştır. Time-lapse mikroskopi bu kanalları doldurdu ve çevredeki hidrojel içine yayılmış olarak floresan dekstran izlemek için kullanılmıştır. (B) ve (C) &#39;de beyaz oklar sıvı akış yönünü göstermektedir. (C) kalibrasyon çubuğu floresan dekstran yoğunluğunu gösterir. Ölçek çubukları (C) &#39;de (B1)&#39; de 20 um ve (B2) ile 50 um temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks at JoVE.com

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

image-guided-laser-based-fabrication-vascular-derived-microfluidic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K Görüntüleme.  University of Delaware. This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Video: Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Biyomühendislik

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Mikroakışkan Tabanlı Vaskülarize İnsan Mikro Tümör Modelinin Hazırlanması

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

Yazar Spotlight: Translasyonel Kanser Araştırmaları için Model Olarak İnsan Vaskülarize Mikro Tümörleri Oluşturma 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Kanser Araştırmaları

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, structures, phenotypes, and performance depending on each specific perfused tissue. The field of tissue engineering, which aims to repair or replace damaged or missing body tissues, relies on controlled angiogenesis to create a proper vascularization within the engineered tissues. Without a vascular system, thick engineered constructs cannot be sufficiently nourished, which may result in cell death, poor engraftment, and ultimately failure. Thus, understanding and controlling the behavior of engineered blood vessels is an outstanding challenge in the field. This work presents a high-throughput system that allows for the creation of organized and repeatable vessel networks for studying vessel behavior in a 3D scaffold environment. This two-step seeding protocol shows that vessels within the system react to the scaffold topography, presenting distinctive sprouting behaviors depending on the compartment geometry in which the vessels reside. The obtained results and understanding from this high throughput system can be applied in order to inform better 3D bioprinted scaffold construct designs, wherein fabrication of various 3D geometries cannot be rapidly assessed when using 3D printing as the basis for cellularized biological environments. Furthermore, the understanding from this high throughput system may be utilized for the improvement of rapid drug screening, the rapid development of co-cultures models, and the investigation of mechanical stimuli on blood vessel formation to deepen the knowledge of the vascular system.

Engineered tissues heavily rely on proper vascular networks to provide vital nutrients and gases and remove metabolic waste. In this work, a stepwise seeding protocol of endothelial cells and support cells creates highly organized vascular networks in a high-throughput platform for studying developing vessel behavior in a controlled 3D environment.

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem