Yazarlar değerli çalışmalar ve tartışmalar için Cobb laboratuarı eski ve eski üyelerine ve idari yardım için Dionne Ware&#39;e teşekkür ederler. Bu çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüsü Hibe R37 DK34128 ve MHC&#39;ye Welch Vakfı Grant I1243 tarafından desteklenmiştir

1. Kinaz Saflaştırma Kaynakları ve Genel İmmünopresipitasyon Boru Hattı NOT: Bu testle birlikte kullanılacak kinazlar, kültürlenmiş hücrelerin immüno çöktürmelerinden veya afinite etiketli saflaştırma gibi rekombinant vasıtalarla elde edilebilir 6 . Aşağıda, ilgilenilen kinaza bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilecek bayrak etiketli immüno çökeltme için genel bir protokol bulunmaktadır. Mümkün olduğunca her şey buz üzerinde tutulmalıdır. <ol><li> Salgılanırken hücre lizatlarının 200 μL&#39;sine (genellikle ~ 1 mg / mL toplam protein konsantrasyon) 2 μL 1 mg / mL antikor ekleyin ve 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Protein A sefaroz boncuklarını lizis tamponu ile yıkayın (aşağıya bakın), 5,000 xg&#39;de (&quot;dokunmatik sıkma&quot;) 30 saniye ila 1 dakika süreyle 4 ° C&#39;de kısaca döndürünüz, bir pipet ile süpernatantı çıkarıp, tamponda boncuklar yeniden süspansiyon haline getirerek . <ol><li> Lizis tamponu hazırlayın: 50 mM HEPES pH 7.7, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA,% 10 gliserol, 0.2 mM sodyum ortovanadat, 100 mM sodyum florür, 50 mM β-gliserofosfat,% 0.1 Triton X 100 veya% 0.1 NP-40. </li></ol></li><li> Lizis tamponundaki lisinatlara protein A sefaroz boncuklarının% 50 bulamaçından 30 uL ekleyin; Sallanırken 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Boncukları pelet haline getirmek ve süpernatanı çıkarmak için 4 ° C&#39;de döndürmeye dokunun. </li><li> 3 kez 1 mL boncuk yıkama tamponu (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7.4) ile yıkayın. </li><li> Bir kere 1x kinaz reaksiyon tamponu (10 mM HEPES pH 8.0, 10 mM MgCl2) ile yıkayın. Boncukları çıkarmadan mümkün olduğunca fazla tampon çıkarın. </li></ol> 2. Kinaz Tepkimelerinin Başlatılması NOT: IP kinaz tahlillerinde, ~ 15 μL susuz boncuklar tipik bir başlangıç ​​örneğidir. Rekombinant protein kinaz tahlilleri için, tipik başlangıç ​​miktarları 25-50 uL&#39;lik nihai reaksiyon hacimleri için 1-10,1-1,0 μg aralığında değişir. Rekombinant protein örneğinin hacimlerini ayarlayınS, tayini başlatmadan önce saklanan tampona eşit olmalıdır. Yüksek miktarda kinaz kullanırken, test süresince protein stabilitesinin korunmasına yardımcı olmak için BSA gibi bir taşıyıcı protein ekleyin. <ol><li> Aşağıda verilen 5x kinaz reaksiyon tamponunu hazırlayın: 50 mM HEPES pH 8.0 50 mM MgCI2 50 mM Benzamidin (proteaz inhibitörü) 50 mM DTT (redüksiyon ajanı) 250 uM ATP (etiketsiz veya &quot;soğuk&quot;) </li><li> 1.5 mL tüpler içinde buz üzerinde kinaz örnekleri tutun. Aşağıdaki reaksiyon karışımını ayrı, soğutulmuş 1.5 mL tüplerde hazırlayın: 21 uL H20 6 uL 5x kinaz reaksiyon tamponu 1 μL radyoaktif işaretlenmiş (&quot;sıcak&quot;) ATP 2 uL substrat (~ 5 mg / mL) NOT: Rekombinant kinaz tahlillerinde, hacim saflaştırılmış proteine ​​uyacak şekilde ayarlanabilir. Nihai reaksiyon hacmi 30 mcL olacak şekilde hesaplayın. Bir tarifi hazırlamak için bu tarifi kullanınkarıştırın. Etiketli ATP&#39;nin alınması üzerine, tepkime karışımına ilave edilmeden önce H20&#39;da 0.01 mCi / μL&#39;lik spesifik bir aktiviteye seyreltilmiş stok. </li><li> Testi başlatmak için, reaksiyon karışımının tamamını kinaz numunesine ekleyin ve reaksiyona giren kinazın aktivitesine bağlı olarak 30 ° C&#39;de 5 dakika ila 1 saat reaksiyon inkübe edin. NOT: Etkinliği önceden test edilmemiş olan bir kinaz ile çalışırken, zaman noktaları arasında 5 dakika aralıklarla bir süre kinaz aktivitesi gerçekleştirin. </li></ol> 3. Reaksiyon Sonlandırma ve SDS-PAGE <ol><li> Buz koyarak ve 7.5 uL 5x Laemmli numune tamponu 6 ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> Isı bloğunda 30 saniye ila 2 dakika boyunca 100 ° C&#39;de ısıtın. </li><li> Dokunmaya basın ve% 10-15 SDS-PAGE jelinde oyuk başına 20 mcL yükleyin. Kinazı ve alt tabakayı ayırmak için yeterince uzun süre jel edin (normalde 5 W sabit gücünde 1 saat) Jel ​​aygıtı, 32&#39;ye maruz kalma oranını sınırlandırmak için korumalı olduğundan emin olun. </sus&gt; p. <ol><li> Burada, ev yapımı jel aparatlarını kullanın, ancak piyasada bulunan standart mini jeller kusursuz bir şekilde uygundur. Boyutları aşağıdaki gibi kullanın: Jeller: 8 cm genişlik, 5.5 cm uzunluk (özünürlük), 1.5 mm kalınlık. Taraklar: 15 oyuk, 1,5 mm kalınlık, 2,9 mm genişlik, 16 mm derinlik </li></ol></li></ol> 4. Jel boyama ve kurutma Dikkat: Tüm basamaklarda, radyoaktif ekran kullanan ve kişisel koruyucu ekipman giyerek kişisel maruziyeti 32 P&#39;ye düşürdüğünüzden emin olun. Belirli adımlarla ilgili daha fazla bilgi için bazı yararlı referanslar bulunmaktadır. <ol><li> Jel cam / alumina plakalarından çıkarılır ve 50 rpm&#39;ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 saat süreyle 50 mL Coomassie lekesi (% 10 glasiyal asetik asit,% 50 metanol,% 0.25 R-250 boya) yerleştirilir. Bu adım için, jelden biraz daha büyük bir kap kullanın. 8 </li><li> Jeli lekeden sabitleme solüsyonuna (% 10 buzlu asetik asitD,% 20 metanol) de leke giderildi. Gece 50 rpm&#39;de orbital çalkalayıcıda 600-700 mL sabitleme solüsyonunda jel salınır. Coomassie boya 8 , 9 emmek için köpük parçaları veya düğümlü laboratuar mendilleri jel ile kaba yerleştirin. </li><li> Sabitleme çözeltisinden jel çıkarın ve jöle sarımsı beyaza dönene dek 1-2 dakika hafifçe karıştırarak 200 mL metanol içine batın. Bu kurutma işlemi sırasında çatlamayı önlemeye yardımcı olacaktır. </li><li> Metanol ile kalitatif bir filtre kağıdı 14 cm x 14 cm&#39;lik bir parça ıslatın ve kütük jel vakumlu kurutucuya yerleştirin. Jelin filtre kağıdının ön tarafı yukarı bakacak şekilde bırakın. </li><li> Kırışıklıkların ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için jel plastik ambalajla dikkatle örtülmelidir. Kurutucuyu 80 ° C&#39;de 1.5 saat çalıştırın. Vakum elde edildikten sonra kapağı açın ve gerekirse herhangi bir hava kabarcıklarını yumuşak bir kauçuk köpük ile püskürtün. </li></ol> 5. Otoradyogram ve Sintilasyon Sayıları <ol><li> Dri&#39;yi kaldırJelin kenarındaki filtre kağıdına bir autorad markörü, fotoselli cetvel veya noktalar ekleyin. Nokta kullanılıyorsa bunların asimetrik bir biçimde olduğundan emin olun. Bu, pozlamadan ve geliştirildikten sonra jel ile filmi hizalayacaktır. </li><li> Sinyal yoğunluğunu kontrol etmek için Geiger sayacı kullanın. Zayıf sinyaller için yoğunlaşan bir ekranla -70 ° C ila -80 ° C arasındaki pozlama film band yoğunluğunu artıracaktır. </li><li> Karanlık bir odada kurutulmuş jel, filmle birlikte bir film kasetine, üstten alta doğru yoğunlaşan bir ekrana yerleştirin: jel, film, yoğunlaştırıcı ekran. </li><li> Yoğunlaştırma ekranını kasetin kapağına takın ve bu adımı kolaylaştırmak için jeli bantlayın. Yoğunlaştıran ekran, 32 P&#39;den gelen beta partikülleri tarafından ışınlandığında ışık yayar. Bu ışık emisyonları, filmi beta partiküllerinden daha verimli şekilde geçirir. <ol><li> Yoğunlaştırıcı ekranın yaydığı dalga boyununGölet filmi en hassas dalga boyuna kadar. </li><li> Maruz kalmanın ne kadar süreceğini belirlemek için Geiger sayacı kullanın: cpm sayısı ~ 100 veya daha düşükse, gece boyunca -70 ° C&#39;de deneyin. Sayım ~ 10.000 ise, 1 saat pozlama ile başlayın ve oradan optimize edin. </li></ol></li><li> Pozlamanın sonunda filmi çıkarın ve bir tıbbi / X-ışını film işlemcisinde gelişir. Pozlama -70 ila -80 ° C arasında gerçekleştirildiyse, film üzerindeki yoğunlaşmayı en aza indirgemek için yoğunlaştırma oluşmadan hemen önce kaseti oda sıcaklığına getirmesine izin verin 10 . </li><li> Filmi kurutulmuş jel / filtre kağıdı üzerine yerleştirin ve işaretli / noktalı görüntüleri kurutulmuş jel üzerindeki işaretleyiciler / noktalar ile hizalayın. Filmde protein standartlarına karşılık gelen bantları işaretleyin. Protein standartlarını ve reaksiyonların gelecekteki referanslar için hangi hatları etiketleyin. </li><li> Filmdeki ilgi bantlarına karşılık gelen bantları jelden ayırın ve onları yerleştirin7 mL sintilasyon flakonlarında. 4 mL sintilasyon sıvısı ekleyin ve sıvı sintilasyon sayacı ile sayın. Sayıcının, 32 P için doğru enerji spektrum penceresini izleyecek şekilde ayarlandığını teyit edin. NOT: Ayrıca, no-kinase kontrol şeridinden substrata karşılık gelen bandı çıkardığınızdan emin olun. Bu, tüm numune sintilasyon sayımlarından çıkarılacak olan arka plan radyasyonunun hesaplanması için kullanılacaktır. </li></ol> 6. Sonuçların Analizi NOT: Otoradyogram, sonuçların niteliksel olarak görselleştirilmesini sağlar. Doğru kantitasyon için, bir sintilasyon sayacı ile 32 P birleşmesi ölçülebilir. Veriler, Şekil 1B&#39;de gösterildiği gibi, genellikle göreceli etkinlik açısından ifade edilir. Tüm numuneler için muntazam koşullar sağlandığı sürece, spesifik aktivitenin göreceli ölçümleri, tedavileri karşılaştırmak için yeterlidir. <ol><li> Mutlak spesifik aktivite değerlerini hesaplarken bir sertlik gerçekleştirinBir süre boyunca ( örn., 2 x [kinaz] = 2 x spesifik aktivite) lineer bir aktivite aralığı sağlamak için, kinaz, substrat ve soğuk ATP konsantrasyonları dahil tüm reaksiyon koşullarının optimizasyonu. Yüksek spesifik aktiviteye sahip kinazlar için, kinaz aktivitesinin substrat miktarı ile sınırlanması durumunda artırılmış substrat konsantrasyonu ile tahliller yapın. </li><li> Mg kinaz başına dakikada aktarılan nanomole fosfat birimleri cinsinden ilgili kinazın spesifik aktivitesini hesaplayın. <ol><li> Sayılmış bantlardaki boşlukları cpm&#39;den çıkarın. </li><li> Sıcak ATP&#39;nin bozunumunu hesaplayın: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 Burada t referans tarihinden bu yana geçen gün sayısıdır (satıcı tarafından sağlanmalıdır), t 1/2 , Yarılanma ömrü 32 P olan 14.3 gün ve 0.95, sintilasyon sayacının verimliliğini yansıtıyor. Örnek: 28 günlük sıcak ATP kullanılıyorsa, bozunma değeri 0.245 olmalıdır. </li><li> CalcTahlil hacmi (μL) x [soğuk ATP] (μM) = toplam ATP (pmol): toplam ATP&#39;nin pikomollerini (pmol) tahlilde ölçün (genellikle reaksiyondaki soğuk ATP miktarına eşittir). Örnek: 30 uL x 50 uM = 1500 pmol </li><li> Cpm / pmol ATP&#39;yi hesaplayın: [sıcak ATP x μL (2.2 x 10 7 ) x bozunma faktörü] / pmol soğuk ATP. NOT: 2,2 x 10 7 değeri 0.01 mCi / μL ATP&#39;yi cpm&#39;ye dönüştürür. </li><li> Deneydeki kinaz miktarını mg cinsinden hesaplayın. Hem rekombinant kinaz hem de immüno-çökeltilmiş kinazlar için başlangıç ​​konsantrasyonlarının belirlenmesinde BCA tahlilleri gibi standart metotlar uygundur. Örnek: 50 μL kinaz reaksiyonunda wtERK2 0.0002 μg / μL, 0.01 μg veya 1 x 10-5 mg&#39;dir. </li><li> Testte toplam cpm&#39;yi hesaplayın. 30 μL reaksiyonları monte edin ve her reaksiyondan bir jel üzerinde 20 μL çalıştırın. Sayılan toplamı (boş çıkarma sonrasında) yüklenen toplam tahlil hacmi / hacmi faktörüne çarpın. Yukarıdakilere devam etmekÖrneğin, tüm sayıları 1,5 ya da 30/20 ile çarpın. </li><li> Test edilen kinazın spesifik aktivitesini hesaplayın: Deneyde toplam cpm) / (cpm / pmol ATP) / (tahlil süresi dakika olarak) / (kinaz miktarı mg cinsinden) NOT: Yukarıdaki değeri 1.000&#39;e bölmek, spesifik aktiviteyi nanomole / dakika / mg cinsinden verir </li></ol></li><li> Bir substrata kaç molekül fosfat eklendiğini hesaplayın (molekül ağırlığı biliniyorsa). Bu, reaksiyon tamamlandıktan sonra belirli bir proteindeki fosfosit sayısını belirlemek için kullanılır. Deneyde toplam cpm) / (cpm / pmol ATP)] / (pmol cinsinden alt tabaka miktarı) </li></ol>

<ol>
	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kinazlar sayısız bağlamda kapsamlı işlevsellik geliştirdiler proteinlerin bir ailesidir ve kinaz tahlilleri birkaç sinyal protein incelenmesi için inanılmaz faydalı olmuştur ve hücresel iletişim mevcut mevcut anlayışımıza büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Özellikle yapı ve aktivitede büyük farklılıklara rağmen iki farklı kinazın karakterizasyonunda aynı temel tahliller kullanılmıştır. WNK1 kinazı, kritik lizin eşsiz bir konuma kaymış ve hem kinaz hem de iskele işlevleri yoluyla...

Protein kinazlar, hücresel sinyallerin uygun cevaplara iletilmesi için kritik olan sofistike enzimlerdir 1 . Homeostazın korunması ve hastalık durumlarının önlenmesi veya yükseltilmesindeki rolleri göz önüne alındığında, kinaz aktivitesini değerlendirmeye yönelik biyokimyasal yöntemler, ökaryotik işaretlemenin ayrıntılarını açıklamak için güçlü araçlar olmaya devam etmektedir 3 . Fosfoya özgü antikorları kullanan stratejiler, farklı tedavi koşullarının hücre sinyal durumu 4 üzerindeki etkilerini ölçmek açısından son derece bilgilendirici olmasına rağmen, bir kinaz tahlili, farklı tedavi koşullarının doğrudan bir kinaz enzim aktivitesi açısından ölçülmesini sağlar. faiz. Benzer tahliller için radyoaktif materyal 5&#39;i kullanmayan çeşitli seçenekler olsa da, sonuçların sağlıklı bir şekilde ölçülmesi için bu metoda güveniyoruz. Orada, Bu tahlilin, farklı nedenlerle değerli olan iki tipik uygulamasıdır: immüno çökeltilmiş (IP) kinaz tahlili ( Şekil 1 ) ve rekombinant protein kinaz tahlili ( Şekil 2 ). IP kinaz tahlili, spesifik protein kinazları aktive edebilen faktörleri tanımlamak ve inhibe edici tedavi koşullarını belirlemek için çok yararlıdır. Kısaca, ilgilenilen bir epitopla etiketlenmiş kinaz kültürlenmiş ökaryotik hücrelere aktarılır, çeşitli tedavilere tabi tutulur, immüno-çökeltilir ve radyoaktif işaretlenmiş fosfatın bir model substrata ( örn., Miyelin bazik protein (MBP)) dahil edilme yeteneği açısından denenmiştir. IP kinaz tahlili, endojen proteinin immüno-çökmesi veya herhangi sayıda genom düzenleme tekniği ile aşırı ekspresyona başvurmadan da yapılabilir. Tedaviler kültüre uygulandığından, bu yöntem çok sayıda yukarı akış faktörü aracılığıyla iletilen uyarıları tespit edebilirVeya paralel yolaklarda in vitro okuma yoluyla. Bu yöntemin en önemli bir avantajı, direkt yukarı akış veya aşağı akış faktörlerine veya fosforilasyon bölgelerine ilişkin önceden bilgi gerektirmediğidir. Dahası, ilgilenilen bir kinaz için spesifik substratlar belirlendikten sonra, aynı kinaz tahlil protokolü, doğal substratlara karşı spesifik aktiviteyi ölçmek ve rekombinant bileşenlerle birlikte kütle spektrometresi analizi ile birleştirildiğinde spesifik fosforilasyon yerlerini belirlemek için kullanılabilir. Bu şekilde tanımlanan bölgeler, substrat mutantlarını kullanan kinaz tahlilleriyle daha da doğrulanabilir. Son olarak, bu yöntem otofosforilasyonu saptamak ve ölçmek için de kullanılabilir. Burada verilen protokol, kültürlenmiş hücrelerde ilgi çekici bir etiketlenmiş kinazın ekspresyonu için optimize edilmiş bir protein saflaştırma şeması veya transfeksiyon yöntemi varsayar. Transfeksiyon, lizis, immüno çökeltme ve protein saflaştırma protokolünün daha ayrıntılı sergilenmesi içinOcols, Cold Spring Harbor Protocols 6&#39;ya atfen öneriyoruz. Test geliştirme ve modifikasyonu hakkında daha fazla bilgi için, Protein Fosforilasyonu: Enzimolojide Seçilmiş Yöntemler 7&#39;ye bakın .

<table><tbody><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled [&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive shielding</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 dye (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Slab gel vacuum dryer</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583 Gel Dryer #1651745&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autorad marker</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent ruler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent dots</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 with 44-9 detector</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Cassette 8 x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Film 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Intensifying Screen 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Medical/X-ray film processor</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation vials</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation fluid</td><td>MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

Protein kinazlar, kompleks uyarı dizilerine yanıt olarak büyük ölçekli hücresel değişiklikleri yönetebilir ve düzenlemelerinin allosterik ayrıntılarını açığa çıkarmak için çok çaba harcanmıştır. Kinazlar, kusurları çoğunlukla birden fazla kanser türü ve ilgili hastalıkların özelliklerini gösteren işaret şebekelerini içerir ve bu sayede iyileştirici terapötik araştırmalarında kritik olan reaksiyon gereksinimlerinin geçerliliği için bir analiz platformu oluşturulabilir. Burada, biyokimyasal ve farmakolojik ajanlar, mutasyon ve silme gibi genetik manipülasyonların yanı sıra hücre kültürü koşulları ve problara uygulanan tedavilerin testleri de dahil ancak bunlarla sınırlı olmayan spesifik deneysel sorulara uyacak şekilde kolayca adapte edilebilen basit bir kinaz testini açıkladık Hücre sinyal mekanizmaları. Bu tahlil, niceliksel karşılaştırmalara ve sonuçların net görselleştirilmesine imkan tanıyan radyoaktif işaretlenmiş [γ- 32 P] ATP&#39;yi kullanır ve mod olabilirImmüno-çökeltilmiş veya rekombinan kinaz, spesifik veya tipik substratlar ile birlikte kullanım için geniş bir yelpazede reaksiyon koşullarına sahiptir.

WNK1 IP kinaz tahlilleri Myc etiketli WNK1, HEK293 hücrelerine transfekte edildi ve bir anti-Myc antikoru 11 ile immüno-çökeltildi. İmmünopresipitat model substrat MBP&#39;ye ve kendisine doğru kinaz aktivitesini göstermiştir ( Şekil 1A ). Daha sonra WNK1 mutantları aynı usulle MBP&#39;ye karşı kinaz aktivitesi için test edildi, bu kez GST etiketli yapılar kullanıldı ( <s...

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

assaying-protein-kinase-activity-with-radiolabeled-atp

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

18.3K Görüntüleme.  University of Texas Southwestern Medical Center.  Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir. 

Video: Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Biyokimya

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

<meta charset="utf8"></head><body>Radyoaktif Olmayan İn Vitro Kardiyak Miyozin Hafif Zincir Kinaz Testleri

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Radyoaktif Olmayan İn Vitro Kardiyak Miyozin Hafif Zincir Kinaz Testleri

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biyoloji

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Radyoaktif Olmayan İn Vitro Kardiyak Miyozin Hafif Zincir Kinaz Testleri

Radyoaktif Olmayan İn Vitro Kardiyak Miyozin Hafif Zincir Kinaz Testleri

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller