Name: quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
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この分析の開発を手伝ってくださったRicardo Dolmetsch博士（スタンフォード大学医学部、現在のNovartis Institute for Biomedical Research）、Matthew Wood博士、Aihara Takuma、およびDongsook Kimの原稿の批判的読解に感謝します。

すべての動物の手技は、つくば動物管理委員会（IACUC）の承認を得て行われた。 1.解剖<ol><li>胎生13-14日のICRまたはC57BL / 6胎仔を準備するために、妊娠したマウスを頸椎脱臼により安楽死させる。子宮を取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を入れたペトリ皿に入れます。血液をすすぎ洗いしてください。 </li><li>鉗子を使用して、70％エタノールで新しいペトリ皿に子宮を移して滅菌します。 </li><li>子宮をHBSSで新しいペトリ皿に移す。消毒された解剖鉗子と手術はさみを使用して子宮から胎児を除去する。 </li><li>外科用ハサミを使って胎児を断つ。 HBSSで新しいペトリ皿に入れてください。 </li><li>皮膚と頭蓋骨を取り外し、滅菌された解剖鉗子を使用して脳を取り出します。 HBSSでペトリ皿に入れてください。 注：この手順を実行すると、手順はクリーンな状態で実行することをお勧めしますベンチ。 </li><li>ステレオ顕微鏡下で滅菌された解剖鉗子を使用して髄膜を除去する。鉗子を用いて基底核、海馬、および小脳を切断する。曲がった先端の鉗子を使用して、HBSSで新しいペトリ皿に皮質を移す。 </li><li>使い捨てのドロッパーまたは25mLのピペットを使用してすべての皮質を収集する。 15 mLのチューブに入れ、ピペットでHBSSを除去する。 </li><li>皮質を含むチューブに3mLの大脳皮質酵素溶液を加える。このチューブを水浴に入れ、37℃で5分間インキュベートする。 注：0.25％トリプシンおよび1mM EDTAを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）からなる大脳皮質培養酵素を調製する。 0.22μmフィルターで滅菌する。 </li><li>脳皮質酵素溶液3mLを皮質を含むチューブに加え、水浴中37℃でさらに5分間インキュベートする。 </li><li> 5mLのピペットを用いて大脳皮質の酵素溶液を除去し、5mLのDulbe10％ウシ胎仔血清（FBS）を含有するccoの修飾イーグル培地（DMEM）中で培養した。 </li><li>滅菌P1000チップを備えた5mLピペットを使用して上下に穏やかにピペットで皮質を解離させる。 P200先端を有する5mLピペットを用いて再度ピペットをかける。 </li><li> 40μmナイロンセルストレーナーを50mLチューブに入れ、懸濁液を濾過して残渣を除去する。 </li><li>室温で5分間420xgで遠心分離し、次いでDMEM培地を除去する。 </li><li>大脳皮質培養培地5mLを添加し、穏やかに細胞ペレットを再懸濁する。 注：1×B - 27サプリメント、2mM L - グルタミン、100U / mLペニシリンストレプトマイシンを補充したニューロン基底培地からなる大脳皮質培養培地を調製する。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を計数し、大脳皮質培養培地を用いて細胞濃度を（必要に応じて）調整する。 </li><li>プレート3.0×10 6皮質ニューロンをコーティングされた35mmのガラス底のディッシュあたり2.0mLに入れた。 注：めっきする前に、0.1mg / mLのポリ-D-リシン臭化水素酸塩（PDL）または0.01％ポリ-L-オルニチン（PLO）を含む35mmのガラス底の皿。 37℃で3時間インキュベートし、少なくとも3回PBSで洗浄する。 </li></ol>イメージングベシクルの運動性<ol><li>それぞれのタイプの小胞を標識するプラスミドを準備する。例えば、早期エンドソームにはEGFP-Rab5、後期エンドソームにはEGFP-Rab7、リソソームにはLAMP-EGFP、オートファゴソームにはEGFP-LC3を使用します8,13。 注：これらのプラスミドは、tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jpから要求に応じて入手できます。典型的には、トランスフェクション試薬を用いて3〜5日間のインビトロ （DIV）ニューロンをこれらのプラスミドでトランスフェクトすることができる。 </li><li> 4.0μgのプラスミドを200μLの無血清培地とピペットで混合する。別のチューブで、200μLの無血清培地に8μLのトランスフェクション試薬（ 表の表を参照 ）を希釈する。 RTで5分間インキュベートする。 </li><li>ステップ2.2のプラスミド溶液とトランスフェクション試薬溶液をピペットで混合する。 RTで20分間インキュベートする。 </li><li>ステップ2.3からの無血清培地および400μLのプラスミド溶液を各コートガラス底ディッシュに添加する。ニューロンを37℃、5％CO 2インキュベーターで30分間インキュベートする。 2mLの大脳皮質培養培地で培地を交換する。 1~2日間5％CO 2インキュベーターで37℃でニューロンをインキュベートする。 </li><li>トランスフェクションの1〜2日後、画像取得のためにトランスフェクションされた細胞を選択する。 注：7 DIV未満の時期尚早なニューロンは、動的小胞運動性を示す傾向がある。高度に発現するニューロンが選択された場合、鮮明な画像が得られないため、蛍光プローブを適度に発現するニューロンを選択する。また、軸索および樹状突起の同定を容易にするために、長い軸索および複雑な樹状突起を有するピラミッドニューロンなどの典型的なニューロン形状を選択する（ 図1A）。 </li><li>タイムラプス画像システムを用いた画像取得： イメージングには、40X Plan Apo 0.95NAまたは100X Plan Apo VC NA1.4対物レンズを備えた電荷結合素子（CCD）カメラを備えた蛍光顕微鏡を使用します。インキュベーションシステムを使用して37℃で温度を制御する。画像取得ソフトウェアによって制御される100秒の期間にわたって、1フレーム/ 5秒でニューロン画像を取得する。あるいは、300秒間に1秒間に1フレームなど、より短い間隔で、より長い時間間隔で画像を取得することもできます。 注記：シーケンシャル画像の撮影にはさまざまなアプリケーションがあり、その多くはこの方法に適しています。したがって、特定のアプリケーションは推奨されません。むしろ、各研究者は利用可能なアプリケーションを使用する必要があります。 </li></ol> 3.画像解析<ol><li> Manual Tracking 14を使用してImageJソフトウェアですべての連続画像を開きます。 注：これまでのところ、手動​​トラッキングはwi追跡実験15,16,17,18,19に使用されている。マニュアルトラッキングは、Dr. FabriceCordelièresによって開発されました。詳細な説明書はオンラインで入手できます20 。分析のために、十分な数の画像を用いて画像データの品質が改善される。 20枚以上の画像を使用することをお勧めします。 </li><li>連続イメージを結合するには、&lt;イメージ&gt;→&lt;スタック&gt;→&lt;イメージをスタック&gt;を選択します。 &lt;OK&gt;をクリックします。 </li><li> &lt;プラグイン&gt;→&lt;手動トラッキング&gt;を選択します。トラッキングウィンドウがポップアップ表示されます。 </li><li> &lt;Show Parameters？&gt;のチェックボックスをクリックし、パラメータセクションでトラッキングパラメータを定義します。 注：時間間隔、x / y校正、z校正、中心のスクエアサイズの検索を含むいくつかのパラメータを設定することができますドットサイズ、線幅、およびフォントサイズを指定します。この単純化されたアッセイでは、時間間隔およびx / y較正の両方が定義された。他の実験環境下では、他のパラメータも定義する必要があるかもしれない。ここで使用されるパラメータは以下のとおりです：40X Plan Apo 0.95NA対物レンズでは&lt;Time interval&gt;が5秒、&lt;x / y calibration&gt;は0.26642μm、100X Plan Apo VC NA1.4では0.10657μmです対物レンズ。 </li><li>パラメータが定義されたら、&lt;add track&gt;をクリックして新しいトラックを開始します。 </li><li>関心のある小胞（ 例えば、 図1A （右パネル）の青と赤の矢印で示される小胞）を決定した後、連続画像のシグナルの中心をクリックしてxy座標を記録する。記録されたxy座標、距離、速度の結果が新しいウィンドウに表示されます。 注：リソソームの場合、大きな明るい蛍光シグナル（ 例えば、 Fig。ure 1A（右のパネル）、オレンジの矢頭）がしばしばニューロンで観察される。これらの信号は時折、蓄積された小胞または病的な静脈瘤のいずれかを示すので、これらの信号は運動性を定量化するために避けるべきである。 </li><li>ステップ3.6を繰り返して、すべての連続画像からベシクルのxy座標を収集する。各画像は、基準点が選択された後、自動的に連続画像に進む。 </li><li>これらのデータを新しい表（スプレッドシートなど）にエクスポートします。適切なソフトウェアを使用して適切なグラフを作成します（材料表を参照 ）。 注：データを分析するには、&lt;距離&gt;列を選択し、この列のすべての値を合計し、 図1Bに示すように運動性距離を棒グラフとして表示します。さらに、このステップを繰り返し、全運動距離の平均を計算し、 図1Cのように棒グラフとして表示します。バーグラフと波形データを作成するソフトウェアは、材料のテーブル。 </li></ol>

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	<li>Nicot, A. S., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+phosphoinositides+and+human+diseases.">Endosomal phosphoinositides and human diseases.</a> Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).</li><li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+disorders+of+membrane+trafficking.">Mendelian disorders of membrane trafficking.</a> N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+endosome+motility+depends+on+lipids+via+the+small+GTPase+Rab7.">Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7.</a> EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).</li><li>Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+transport+along+the+lysosomal+pathway+in+mucolipidosis,+type+IV+disease.">Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).</li><li>Venugopal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurologic,+gastric,+and+opthalmologic+pathologies+in+a+murine+model+of+mucolipidosis+type+IV.">Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV.</a> Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanism+to+regulate+lysosome+motility+for+lysosome+positioning+and+tubulation.">A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation.</a> Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).</li><li>Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIKfyve+regulates+CaV1.2+degradation+and+prevents+excitotoxic+cell+death.">PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death.</a> J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).</li><li>Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIKfyve+mediates+the+motility+of+late+endosomes+and+lysosomes+in+neuronal+dendrites.">PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites.</a> Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).</li><li>McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3,5-bisphosphate:+low+abundance,+high+significance.">Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance.</a> Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).</li><li>Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plentiful+PtdIns5P+from+scanty+PtdIns(3,5)P2+or+from+ample+PtdIns?+PIKfyve-dependent+models:+Evidence+and+speculation+(response+to:+DOI+10.1002/bies.201300012).">Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012).</a> Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).</li><li>Chow, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+FIG4+causes+neurodegeneration+in+the+pale+tremor+mouse+and+patients+with+CMT4J.">Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J.</a> Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Vac14,+a+regulator+of+the+signaling+lipid+phosphatidylinositol+3,5-bisphosphate,+results+in+neurodegeneration+in+mice.">Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker.">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li><li>. Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> (2017)</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-independent+social+motility+of+Myxococcus+xanthus.">Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).</li><li>Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+type+IV+pilin+homologues+in+Stigmatella+aurantiaca+DSM17044+by+heterologous+expression+in+Myxococcus+xanthus.">Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).</li><li>Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+cortactin+linked+to+acute+lung+injury+impairs+lamellipodia+dynamics+and+endothelial+wound+healing.">A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).</li><li>Dahirel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+propensity+and+ability+correlate+with+ecological+specialization+in+European+land+snails:+comparative+analysis+of+a+dispersal+syndrome.">Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome.</a> J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+type+IV+pili+activity+and+exopolysaccharides+secretion+controls+motility+patterns+in+single+cells+of+Myxococcus+xanthus.">Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus.</a> Sci Rep. 6, 17790 (2016).</li><li>. Manual Tracking [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual</a> (2017)</li><li>. ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Category:Tracking">https://imagej.net/Category:Tracking</a> (2017)</li><li>Tinevez, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , (2016).</li><li>Ekvall, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles.">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).</li><li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+solutions:+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain.">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコルは、小胞の運動性を定量化するための手順を導入する。初代ニューロンにおいて、エンドソームおよびリソソームは、より若いニューロン（4-6DIV）において高い運動性を示す傾向がある。ニューロンが神経プロセスを伸長させるためにいくつかの成分を先端縁に送達しなければならないことを考えると、この段階で膜輸送が動的に起こるはずである。したがって、ニューロン樹状突起における動的運動性を観察するためには、より若いニューロンを用いることが重要である。さらに、より大きい小胞は、より若いニューロンにおいてさえ、高い運動性を示す傾向がない。ベシクルサイズの調節は、融合 - 核分裂段階の頻度に関与している可能性が高い。動的に移動しない特定の小胞は、他の小胞を容易に受け入れやすく、それらの動きを終わらせる可能性があります。従って、小胞の選択は、この分析のための重要なプロセスである。 オブジェクト21を追跡するためにいくつかのフリープラグインソフトウェアパッケージが利用可能である。たとえば、トラックメイトパッケージはオブジェクト22を追跡することができ、数学的な情報の範囲を提供する数値ソフトウェアによって修正することができる。一方、このプロトコルでは比較的簡単な画像解析には少し複雑です。 Mtrack2は別のプラグインであり、MultiTrackerプラグイン23に基づいています。 Mtrack2は、ターゲットを識別して、後続フレームのどのターゲットが最も近いかを判断できるため、便利です。このアプローチは膨大な量のデータを定量化するのに役立ちます。手動トラッキングは、より少量の画像データに対してより信頼性が高くなります。したがって、手動トラッキングを使用して、より小さなデータセットを定量化し、他のソフトウェアを使用してより大きなボリュームを監視するほうがよいことを認識することをお勧めします。 このアプローチでは、いくつかの注意が払われるべきである。第1に、厳密なデータを得るためにサンプリングレートを高くする必要があります。これは、いくつかの小胞が急速な動きを示し、融解核分裂や外観消失などの突然の変化が観察されることがあり、変化の兆候を見逃すことを避けるためには頻繁なイメージングが不可欠であることを示しています。もう一つのポイントは、走査型ディスク共焦点顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡などのハイエンド顕微鏡を使用することが、高解像度の興味深いデータを得る上で鍵となることです。ハイエンドの顕微鏡を使用して、より短い間隔で画像を撮ることをお勧めします。ここでは、機器の制約のために5秒ごとに画像が撮影されました。 実質的な研究は、膜輸送と神経障害との間の生物学的関連を示唆している2 。例えば、リソソーム欠損は、ニーマン・ピック病およびゴーシェ病などの重度のニューロン障害に関与することが実証されている24 。興味深いことに、いくつかの研究では、リソソームの動きと局在がリソソーム蓄積障害の発症6 。小胞の運動性がこれらの疾患のバイオマーカーとして使用される可能性があります。 1つの興味深いアプローチは、ヒト誘導多能性幹細胞（iPSCs）の利用可能性から生じ得る。 iPSCs由来ニューロンを用いて小胞の運動性を調べると、リソソーム蓄積障害のバイオマーカーが明らかになるかもしれない。このアプローチは、病気のリスクの根底にあるプロセスにいくつかの手掛かりを提供します。 このアッセイは単純であるので、運動性データを得ることは容易である。また、移動および形態学的変化を含む他の細胞事象の分析にも適用可能である。このアプローチには、単純さのためにいくつかの制限があることに注意することが重要です。したがって、神経細胞の人身売買の正確な生理学的関連性を理解するために、電気生理学、生化学、および電子顕微鏡分析を含む他のアプローチを用いることが必要である。それにもかかわらず、このアプローチは貴重なメソ人身売買を直接的かつ時間的に分析したい研究者に適しています。

エンドソーム - リソソームの輸送の正確な制御は、神経機能を調節するために不可欠です。特に、これらの小胞の動的な動きは、ニューロンの形態、発達および生存の調節の根底にある重要な因子である。このシステムの欠陥は、重度のニューロン障害を引き起こす1,2 。小胞輸送をニューロン疾患に結びつける分子メカニズムは複雑であると考えられ、いくつかのグループがこの関連性を調べようとしている。例えば、摂動した後期エンドソーム運動が、リソソーム欠損に起因する遺伝的神経変性疾患であるNiemann-Pick C疾患3と有意に関連することが報告されている。もう1つの例は、リソソームCa 2+チャネルの突然変異であり、これはリソソーム運動性を損ない、リソソーム蓄積疾患4,5 、 </6 。我々のグループは、PtdIns（3,5）P 2代謝回転の調節不全が、ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの運動性を抑制し、ストレス反応に対する脆弱性を増加させることを報告している7,8 。主に後期エンドソームおよびリソソームに局在するPtdIns（3,5）P 2の代謝調節は、小胞輸送および融合核分裂プロセスを含む広範囲の細胞機能において重要な役割を果たす9,10 。損傷したPtdIns（3,5）P 2代謝回転は重度の神経変性を引き起こすので、エンドソーム - リソソームの運動性の異常調節は、神経変性の病因を理解するための重要な要因となり得る。小胞の運動性の基礎をなす分子メカニズムの研究は、このようにして、我々のundeを深めることができる有望な手掛かりを提供するかもしれないいくつかのニューロン障害を呈する。 本稿では、手動トラッキングと呼ばれるフリーソフトウェアパッケージを使用して、ニューロンの小胞の運動性を定量化する貴重な方法を紹介します。目的は、小胞の運動性を分析するための高速定量法を開発することでした。この定量化は、タイムラプス映画の各フレームの基準点をクリックするという標準的なアプローチによって行われます。 Manual Trackingソフトウェアを使用することで、このアプローチは他のアプリケーションとは異なり、非常に簡単で幅広いユーティリティになります。さらに、このアプローチは、グリア細胞のような他の細胞にも適用可能である。この方法は原始的であるが、細胞運動性および形態学的変化を含む様々な分析に適用することができる。例えば、一連の画像にわたって基準点を定義した後、データ解析および画像処理ソフトを使用して、連続画像から基準点の位置および各位置における時間に関する情報を抽出することができる陶器。まとめると、この方法は単純で強力であり、エンドソーム - リソソーム機能を調べるような膜輸送に基づく研究における効率の改善の開発に寄与する。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td>Serum free medium</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptmycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplements</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsine</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Nylon cell strainer</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Polyethyleneimine &quot;Max&quot; (PEI)</td><td>polysciences</td><td>24765</td><td>Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.</td></tr><tr><td>BIOREVO BZ-9000</td><td>Keyence</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubation system INUG2-K13</td><td>Tokay Hit</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism version 6.0</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Excel version 15</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ verion 1.47</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes

脳において、膜輸送システムは、ニューロンの形態、シナプス可塑性、生存およびグリアの通信などのニューロン機能の調節において重要な役割を果たす。今日まで、これらの系の欠陥が様々なニューロン疾患を引き起こすとの多数の研究が報告されている。したがって、ベシクル動態の根底にあるメカニズムを理解することは、いくつかのニューロン障害の治療を助けることができる影響力のある手掛かりを提供し得る。ここでは、ImageJプラットフォームのソフトウェアプラグインを使用して、運動距離や移動速度などの小胞の運動量を定量化する方法について説明します。定量化のための画像を得るために、EGFP標識小胞マーカータンパク質を用いてニューロンエンドソーム - リソソーム構造を標識し、経時顕微鏡法を用いて小胞の動きを観察した。この方法は非常に有用であり、軸索および樹状突起のような神経突起ならびにニューロンおよびグリア細胞の細胞の小胞における小胞の運動性の測定を単純化する。さらにこの方法は、線維芽細胞および内皮細胞のような他の細胞株にも適用することができる。このアプローチは、膜輸送の理解の価値ある進歩を提供することができます。

このアッセイは、インビトロ培養における小胞の動態を測定するために設計された。このアッセイを利用して、ニューロンの形態および生存に関連する小胞の運動性を決定した。 図1AおよびBは、ニューロンにおけるリソソームの運動性を示す代表的なデータを示す。皮質ニューロンにリソソームマーカーLAMP-EGFPをトランスフェクションし、標準蛍光顕微鏡を用いて観察した。特定のエンドソーム - リソソーム小胞は、休止ニューロンにおいてさえ、高度に可動性であることが以前に報告されている8 。実際に、これらの結果は、同じデンドライト（ 図1AおよびB ）中の休止小胞および移動小胞の両方を示す 。通常、静止小胞は、ニューロンの樹状突起におけるブラウン運動のような振動運動を示す。対照的に、動く小胞は不規則な運動性を示す。我々は、各小胞が異なるリソソームの小胞においてさえ、機能の決定の根底にある組成的特徴8 。したがって、このアプローチを用いた小胞の分類は、有用な情報を提供し得る。このシステムを使用すると、これらの小胞の平均運動性を定量化し（ 図1C ）、このシステムを用いて小胞特性を時間効果的に分析することが容易である。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55488/55488fig1.jpg" /> 図1：ニューロン樹状突起におけるリソソーム運動性。 （ A ）マウス大脳皮質ニューロン（4DIV）をLAMP-EGFPプラスミドで2日間トランスフェクションした。この画像は、樹状突起におけるLAMP-EGFP含有小胞の運動性を示す。挿入図は、LAMP-EGFP陽性小胞の時間経過像を示す。赤い矢印は移動する小胞を示し、青い矢印は休止小胞を示します。オレンジ色の矢印は、より大きな蛍光シグナルを示している上に。スケールバー=20μm。 （ B ）は、図AのLAMP-EGFP陽性小胞の時間依存性のx軸位置である。（b）の赤丸の小胞は動いており、（a）の青い円の小胞は静止している。スケールバー：5μm（左）。棒グラフは、LAMP-EGFP移動の合計距離を示します（右）。 （ C ）棒グラフは、LAMP-EGFP含有小胞の平均運動距離を示す。 （n = 5、平均±SEMの標準誤差、スチューデントt検定による** p &lt;0.01）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55488/55488fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.0K ビュー.  University of Tsukuba. 膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。 

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

神経科学

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

培養中の細胞小器官輸送<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;細胞：S2細胞ラインと一次ニューロン。

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

生物学

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient ...

<meta charset="utf8"></head><body>GFPタグRAB-3を用いた現生 C.エレガンス における軸索輸送解析の強化

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. Consequently, loss of axonal transport impairs neuronal growth and function. Studying axonal transport therefore improves our understanding of neuronal cell biology. With recent improvements in CRISPR Cas9 genome editing, endogenous labeling of axonal cargos has become accessible, enabling to move beyond ectopic expression-based visualization of transport. However, endogenous labeling often comes at the cost of low signal intensity and necessitates optimization strategies to obtain robust data. Here, we describe a protocol to optimize the visualization of axonal transport by discussing acquisition parameters and a bleaching approach to improve the signal of endogenous labeled cargo over diffuse cytoplasmic background. We apply our protocol to optimize the visualization of synaptic vesicle precursors (SVPs) labeled by green fluorescent protein (GFP)-tagged RAB-3 to highlight how fine-tuning acquisition parameters can improve the analysis of endogenously labeled axonal cargo in Caenorhabditis elegans (C. elegans).

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:内因性軸索輸送ダイナミクスを視覚化するための高度な技術

The paper describes the optimization of fluorescence microscopy acquisition parameters to visualize the axonal transport of endogenous labeled cargos at single-neuron resolution in a living nematode.

Living Caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

要約

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