Name: isolation of circulating tumor cells in an orthotopic mouse model of colorectal cancer
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer at JoVE.com

Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (We 3548 / 4-1) ve Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) tarafından desteklenmiştir.

Burada sunulan hayvan deneyleri bağımsız olarak gözden geçirildi ve bir kurumsal ve resmi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından izin verildi ve FELASA ( Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu ) kurallarına göre gerçekleştirildi. Anestezi ve analjezi ya da gerekirse erken ötanazi dahil olmak üzere acıyı en aza indirmek için olası tüm önlemler alındı. 1. Hücrelerin ve Organoidlerin Hazırlanması NOT: Her bir enjeksiyon için 100.000 hücre ile 20 μL&#39;lik bir hacim kullanın. Sızıntıyı önlemek ve standart enjeksiyon yapılmasını sağlamak için bazal membran matrisini (BMM) kullanın. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için düzenli aralıklarla hücre hattı kimlik doğrulama analizlerini yapın ( örneğin STR profillemesi yoluyla ). <ol><li> Taze dokulardan primer hücre süspansiyonlarının hazırlanması NOT: Steril koşullar altında daima çalışın. Yeni derhal transferHücrelerin yüksek canlılığını sağlamak için ameliyathaneden buz üzerinde laboratuara rezeke edilen doku gereklidir. Hastanın refahı ve optimal tedavisi her zaman öncelik olmalıdır. Bu nedenle, araştırma için doku numuneleri, sonraki patolojik inceleme ve rezeke edilen tümörün evrelemesine müdahale etmeyecek bir şekilde elde edilmelidir. Çoğu durumda, patolojik tanıya müdahale edilmemesi için, eğitimli bir patolog tarafından elde edilen araştırma numunelerinin olması mantıklıdır. <ol><li> Rezeke edilen örneğin (ideal olarak ~ 1 cm 3 ) steril çıkarılmasından hemen sonra, doku örneğini, önceden 20-30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 50 mL tüp içine yerleştirin. Tüpü buz üzerinde saklayın ve derhal laboratuara nakledin. </li><li> Doku bir Petri kabına koyun ve kalan kanları çıkarmak için iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> Dokuyu küçük parçalar halinde (~ 2-4 mm) bir sca ile kesinLpel ( örneğin # 20 veya # 36 bıçakla). </li><li> Tümör dokusunu tek hücreli bir süspansiyona daha da ayırmak için ayrıştırıcıyı üreticinin talimatlarına göre kullanın. Alternatif olarak, enzimatik tümör sindiriminin diğer protokollerini kullanın. </li><li> Elde edilen tek hücreli süspansiyonun hücrelerini sayın ( örn. , Bir coulter sayacı veya bir hemocytometer). </li><li> Santrifüj (1,500 xg&#39;de 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 5 x 10 6 hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyonda BMM&#39;deki hücreleri tekrar süspanse edin ve buz üzerinde saklayın. </li></ol></li><li> Enjeksiyon için hücre hatlarının hazırlanması <ol><li> Standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO 2 ) tüm kolorektal kanser hücre çizgilerini büyütün ve ameliyat gününde hazırlayın. </li><li> Hücreleri standart hücre kültürü protokollerine göre hasat edin, hücreleri sayın ( örn . Bir coulter sayacı veya hemocytometer&#39;de) ve gerekliliğini hesaplayınEnjekte edilecek hayvan sayısına bağlı olarak tüm enjeksiyonların miktarı. </li><li> Pipetleme kayıplarını ve enjektör şırıngasının ölü hacmini hesaplamak için gerçekten gerekli hacmin 3-5x&#39;i hazırlayın. </li><li> Santrifüj (1,500 g&#39;da 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 5 x 10 6 hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyonda BMM&#39;deki hücreleri tekrar süspanse edin ve buz üzerinde saklayın. </li></ol></li><li> Organoit preparasyonu NOT: Tüm 3D organoid kültürler, standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO 2 ) yetiştirilir. Organoid kültürü için ayrıntılı protokoller daha önce yayınlanmıştır. 18 , 19 , 20 Konvansiyonel hücre hatlarına benzer şekilde, enjeksiyon başına 100.000 hücre ile 20 uL BMM hacmi önermekteyiz. Organoidler ameliyat gününde aşağıdaki şekilde hazırlanır: <ol><li> Aşağıdaki ortamı hazırlayın (aşağıda belirtilenlerGelişmiş DMEM / F12 +% 1 HEPES (1M) +% 1 Glutamin (200 mM) +% 1 Penisilin / Streptomisin. </li><li> 15 mL tüpleri 1 mL DMEM / F12 +++ ile önceden doldurun. </li><li> Kültür plakasının yüzeyinden organoidleri dikkatlice aspire edin ve 3 ila 5 kuyu içeriğini bir 15 mL tüp içine aktarın. </li><li> Organoidleri, genişletilmiş bir cam pipetle aşağı yukarı pipetleyerek dikkatli bir şekilde daha küçük parçalara ayırın. </li><li> Tüp 5 mL DMEM / F12 + + + ekleyin, bunu takiben 5 dakika 1000 xg&#39;de santrifüj uygulanır. </li><li> Santrifüjden sonra süpernatantı alın, pelleti 600 μL enzimatik ayrışma tamponu içinde tekrar süspansiyon haline getirin ve süspansiyonu bir 6 oyuklu plakalardan birine iyi bir şekilde aktarın. </li><li> 1-5 dakika 37 ° C&#39;de inkübe edin ve daha sonra organoidleri çözmek için süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin. NOT: Mikroskop ile sindirimi doğrulayın; Tüm hücre kümeleri ayrıştığında tamamlanırD tek hücrelere. </li><li> Sindirim işlemini başarıyla tamamladıktan sonra sindirimi durdurmak için 1.4 mL DMEM / F12 +++ ekleyin. Daha sonra sindirilmiş organoidlerin tüm kuyularını 50 mL&#39;lik bir tüpe aktarın. </li><li> Hücreleri sayın ve tüm enjeksiyonlar için gerekli miktarı hesaplayın. </li><li> Pipetleme kayıplarını ve enjektör şırıngasının ölü hacmini hesaplamak için gerçekten gerekli hacmin 3 - 5 katı kadarını hazırlayın </li><li> Santrifüj (1,500 xg&#39;de 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> BMM&#39;deki hücreleri 5 x 10 6 hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyona kadar yeniden askıya alıp buzda tutun. </li></ol></li></ol> 2. Ortotopik Fare Modeli <ol><li> Ameliyat için alıcı hayvanların hazırlanması NOT: Alıcılar olarak 6-8 haftalık NOD.Cg-Prkdc scid IL2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gama, NSG) farelerini kullanın. 21 NSG, olgun B, T ve NK hücrelerinden yoksun en bağışıklığı baskılanmış fareler arasındadır, bunun yanında çoklu bağışıklık sistemi de fazladırtama yaptığı. 21 Onlar güvenilir düşük hücre sayıları enjekte bile tümörleri büyümeye ve uzak metastaz son derece yatkındır. NSG fareleri mükemmel yetiştiricilerdir ve geleneksel spesifik patojen içermeyen (SPF) birimler içerisinde tutulabilirler. <ol><li> İlk insizyon öncesinde subkutan olarak 0.05 mg / kg buprenorfin enjekte edin. </li><li> Genel anestezi için sevofluran&#39;ı% 3-3.5 hacimde kullanın. Parmak çakma refleksi kaybı, yeterli anestezi anlamına gelir. </li><li> Korneanın kurutulmasını önlemek için anestezi uygulanmış farelerin gözlerini oftalmik merhemle örtün. </li><li> Fareleri küçük bir masanın üzerinde yatay bir konumda tutun. </li><li> Karını elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin (alternatif olarak kaşıntı kremi kullanılabilir) ve en az 3 kez klorheksidin / iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte edin. </li><li> Cerrahi alanı steril perdeler ile örtün. NOT: Perioperatif antibiyotik kullanımı isteğe bağlıdır ve kurumsal yönergelere tabidir. </li></ol></li><li> Orta hat laparotomisi ve çekumun maruziyeti <ol><li> Alt karın cildinde küçük bir orta hat kesisi (3-5 mm) yapmak için makas kullanın (alternatif olarak kepek kullanılabilir). Forseplerle karın duvar kaslarını kaldırın ve makasla dikkatli bir şekilde kesip karın boşluğunu açın. </li><li> Atrofik forseps ile çekumun belirlenmesi ve dikkatli bir şekilde dışa vurulması. Kornere işaret eden karnın üzerindeki çekumun körü kesecek keseğini kafa yuvasına yerleştirin. </li><li> Dışa aydınlatıldıktan sonra, çekmeceyi sıcak salin svapları kullanarak nemli tutun. </li></ol></li><li> Ortotopik enjeksiyon, karın kapanması ve postoperatif iyileşme <ol><li> İntracekal enjeksiyon için, 30 G kanül içeren standart bir 1 mL şırınga kullanın. Bu şırıngayı, bir mikromanipülatöre monte edilen bir mikroenjeksiyon pompasına monte edin. </li><li> Çekumatik forseps ile çekumun ucunu dikkatlice tutun ve aşağı doğru vurarak hafifçe pürüzsüz hale getirinD ikinci kez forseps ile sıcak salinle nemlendirildi. </li><li> Kanül doğrudan çekumun üzerine yerleştirin. </li><li> Görsel kontrol altında binoküler bir cerrahi mikroskop ile aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Çekumun dışarı çekilmiş kısmının her iki ucuna iki atravmatik forseps kullanarak çekumun dikkatli bir şekilde kavranmasını hafifçe gerin ve ardından paralel ve doğrudan yukarıda bulunan kanül üzerine yavaşça çekin. Sızıntıya ve peritoneal yayılıma yol açacağı için tüm bağırsak duvarını perfore etmek (böylece lümen içine hücreleri enjekte etmek) değil, serozayı başlangıçtaki penetrasyonun ötesine perfore etmek için de önemlidir. <ol><li> Bağırsağı kanüle doğru, bağırsağa doğru götürünüz. Bağırsağı iki forseps arasında tutun ve gerin. Sarsıntıyı azaltmak için cerrahın elleri bir yüzey üzerine oturmalıdır. </li></ol></li><li> Hücreleri seroza enjekte edin (çok ince, şeffaf astar olarak görülüyor.E intramural kan damarları) ve muskularis. Bu nedenle kanül, kan damarlarının üstünde ve yarı saydam zarın altında görsel olarak yerleştirilmelidir. </li><li> Kanül bağırsak duvarı içerisindeyken titreme azaltmak için enjeksiyona başlamak için bir ayak anahtarı kullanın. </li><li> Kanül yerleştirildikten sonra enjeksiyona başlayın. Pompanın kontrol ünitesinde 1 μL / s ayarla sonuçlanan 20 saniye süreyle kullanın. NOT: Hasarlı bir kan damarına veya yakınına yapılan enjeksiyon doğrudan intravasküler yayılım ve uzak metastaz yol açar ve bu nedenle kaçınılmalıdır. </li><li> Enjeksiyonun tamamlanmasından sonra, kanülü geriye doğru çekerek dikkatlice çıkarın. </li><li> Sızdırılmış hücreleri kirletmek ve böylece suni peritoneal yayılımı önlemek için çekumun altına kuru bir çubuk yerleştirin ve ardından çekumun damıtılmış suyla iyice durulayın. </li></ol></li><li> Karın kapanması ve postoperatif iyileşme <ol><li> R sonraİçeri çekerken, çekumu hafifçe karın boşluğuna geri verin. </li><li> Karın duvarını 6-0 hızlı emilebilen koşu sütürleri ile kapatın. </li><li> Cerrahi yara klipsleri ile cildi kapatın. </li><li> Fareyi, anesteziden tamamen kuruyana kadar 38 ° C&#39;ye ayarlanmış ısıtma haritasına yerleştirin. </li><li> Farelerin postoperatif koşullarını 48 saat boyunca yakından izleyin. Sıkıntı yaşarsanız, 12 saatte bir 0.05 mg / kg buprenorfin ile tedavi edin. </li><li> Fareler, tümör gelişimine bağlı olarak sıkıntı işaretleri için günde en az bir kez izleyin. </li></ol></li></ol> 3. Tüm Kan Örneklerinden Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu NOT: Anestezi uygulanmış farelerde transkutanöz kardiyak ponksiyon ile kan alın ve bunu ötanazi izlemelisin. İdeal olarak, 100 μL antikoagülan (Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) veya heparin) ile önceden doldurulmuş bir şırınga içine 1.000 μL kan çekilir. Bir anti-insan-EpCAM (epitel hücre adezyonuMolekül) antikorunu belirtir. Fare modelinde insan epitelyal hücre hatları kullanılıyorsa, bu çok iyi çalışır. Diğer aletler için farklı antikorlar gerekebilir. <ol><li> CTC zenginleştirmesi: <ol><li> 15 mL&#39;lik tüpleri 5 mL yoğunluk dereceli ortam ile önceden doldurun ve dikkatli bir şekilde 15 mL tüp içine kan aktarın. </li><li> Santrifüjleyin (frensiz 300 xg&#39;de 30 dakika) ve dikkatli bir şekilde üst üst fazı çıkarın. </li><li> Geri kalanını yeni bir 15 mL tüp içine boşaltın ve santrifüjleyin (15 dakika, frenli 300 xg). </li><li> Mononükleer hücreleri içeren ara fazı kurtarın (gerisini atın) ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> Pelet 200 uL PBS /% 1 EDTA içinde süspansiyon haline getirin ve 4 μL EpCAM antikoru ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. </li></ol></li><li> Eleme ve toplama <ol><li> Aşağıdaki tamponu hazırlayın (aşağıda toplama tamponu olarak anılır): PBS +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) +% 1 penisilin / STreptomisin (% 1) +% 0.8 EDTA. </li><li> 6 cm&#39;lik steril bir Petri kabında (akışkanın çanakta dağılmasını önleyen) ~ 1 cm&#39;lik bir daire çizmek için bir PAP kalemi kullanın ve bu daire içine tampon toplamanın pipet 700 μL&#39;ini kullanın. </li><li> Daire içerisinde 700 mcL toplama tamponuna 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Mikroskop ile hücrelerin yoğunluğunu kontrol edin. Çok yoğunsa, numuneyi farklı yemeklere bölün. </li><li> Hücrelerin çökelmesini bekleyin (~ 5 dak). </li><li> Lekeli (= EpCAM-pozitif) hücreler için hücre süspansiyonunun damlasını tarayın. </li><li> Bir hücre bulundu sonra, mikromanipülatör ile hücreyi seçin ve amaçlanan aşağı akım analizine ( örn. , RNA ekstraksiyon tamponu veya kültür ortamı) bağlı olarak 50 μL tampona koyun. </li><li> İstenen aşağı akım analizlerine bağlı olarak, EpCAM negatif hücreleri ve / veya ortamı negatif kontroller olarak izole edin. </li><li> Aşağı akım analizleri ile devam edin ( örn. , Hücre kültürü, PCR). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2016.">Cancer statistics, 2016.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li><li>Weitz, J., Koch, M., Debus, J., H&#246;hler, T., Galle, P. R., B&#252;chler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer.">Colorectal cancer.</a> Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).</li><li>Sch&#246;lch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+of+colorectal+cancer.">Circulating tumor cells of colorectal cancer.</a> Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).</li><li>Steinert, G., Sch&#246;lch, S., Koch, M., Weitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+significance+of+circulating+and+disseminated+tumour+cells+in+colorectal+cancer.">Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer.</a> Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).</li><li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+minimal+residual+disease+in+colorectal+cancer.">Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer.</a> World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).</li><li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+and+outcome+in+non-metastatic+colorectal+cancer:+a+prospective+study.">Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study.</a> Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).</li><li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+differences+of+circulating+tumor+cells+in+colorectal+cancer.">Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer.</a> Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).</li><li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+Spread+Emerging+From+Liver+Metastases+of+Colorectal+Cancer:+Does+the+Seed+Leave+the+Soil+Again?.">Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?.</a> Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).</li><li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+shows+that+detection+of+circulating+tumor+cells+indicates+poor+prognosis+in+patients+with+colorectal+cancer.">Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).</li><li>Steinert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Escape+and+Survival+Mechanisms+in+Circulating+Tumor+Cells+of+Colorectal+Cancer.">Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer.</a> Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).</li><li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Roper, J., Hung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priceless+GEMMs:+genetically+engineered+mouse+models+for+colorectal+cancer+drug+development.">Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development.</a> Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).</li><li>Sch&#246;lch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+combined+with+TLR7/8+activation+induces+strong+immune+responses+against+gastrointestinal+tumors.">Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors.</a> Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).</li><li>Sch&#246;lch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+activation+and+ionizing+radiation+induce+strong+immune+responses+against+multiple+tumor+entities.">TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities.</a> Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).</li><li>Sch&#246;lch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+exhibit+stem+cell+characteristics+in+an+orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).</li><li>Nanduri, L. K., Garc&#237;a, S., Weitz, J., Sch&#246;lch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Colorectal+Cancer-Derived+Circulating+Tumor+Cells.">Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells.</a> Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).</li><li>van Noort, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Drug+Candidates+for+the+Treatment+of+Metastatic+Colorectal+Cancer+through+Global+Inverse+Gene-Expression+Profiling.">Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling.</a> Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/gamma(c)(null)+mouse:+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Simon, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+phenotypic+and+genomic+analysis+of+C57BL/6J+and+C57BL/6N+mouse+strains.">A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains.</a> Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).</li><li>Kalish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C57BL/6N+Mice+Are+More+Resistant+to+Ehrlich+Ascites+Tumors+Than+C57BL/6J+Mice:+The+Role+of+Macrophage+Nitric+Oxide.">C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide.</a> Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).</li><li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J Vis Exp. (10), e484 (2007).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+PI3K/MEK+inhibition+promotes+tumor+apoptosis+and+regression+in+PIK3CA+wild-type,+KRAS+mutant+colorectal+cancer.">Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer.</a> Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).</li><li>Coffee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+BRAF+and+PI3K/mTOR+blockade+is+required+for+effective+treatment+of+BRAF(V600E)+colorectal+cancer.">Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer.</a> Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).</li><li>Belmont, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+dual+blockade+of+the+kinases+PI3K+and+mTOR+in+KRAS-mutant+colorectal+cancer+models+results+in+combined+sensitivity+to+inhibition+of+the+receptor+tyrosine+kinase+EGFR.">Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR.</a> Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).</li><li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment.">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li><li>Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Inducible,+Large-Intestine-Specific+Transgenic+Mouse+Model+for+Colitis+and+Colitis-Induced+Colon+Cancer+Research.">An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research.</a> Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).</li><li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine.">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research.">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Deri altındaki fare modellerinde klinik olarak kanıtlanmış etkinliklerine rağmen yeni bileşiklerin büyük çoğunluğu klinik araştırmalarda başarısız olur ve kliniğe asla ulaşmazlar. 11, deri altı fare modellerinde bu bariz yetmezliği doğru tümörlerin biyoloji ve büyüme kalıpları doğrudan orijinal organ, tümör hücrelerinin enjeksiyonundan göre ortotopik fare modellerinin geliştirilmesine yol açmıştır simüle edilmiştir. Ortotopik far...

Kolorektal kanser (CRC), batı ülkelerinde kanser ölümünün en yaygın nedenlerinden biridir. Primer tümör genellikle rezeke edilebilir olsa 1, uzak metastaz oluşumu önemli ölçüde ölüme götürecek sıklıkla prognozu kötüleştirir ve. 2 , 3 Metastazın biyolojik korelasyonu, tümörden ayrılan dolaşımdaki tümör hücreleridir (CTC&#39;ler), dolaşımda hayatta kalır, hedef organdaki epitele bağlanır, organı istila eder ve nihayetinde yeni lezyonlara doğru büyür. Dolaşımda bulunan tümör hücreleri prognostik alaka, 5, 6, 7, 8, olduğu bilinmektedir, ancak 4, 9 biyoloji kısmen CRC bunların çok nadir bir sonucu olarak anlaşılmaktadır. 10 Fare modelleri güçlü bir tOol kanser biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek. Klasik, subkütan tümör modelleri, alıcı camlara tümör hücrelerinin subkütan enjeksiyonuyla üretilir; bu, bağışıklık kazandıran (eş merkezli tümör hücreleri kullanılıyorsa) veya immün yetmezlik gösterebilir. Subkütan tümör modelleri ucuzdur ve verileri hızlı bir şekilde üretir; Uç nokta tümör büyümesi kolaylıkla ve invaziv olarak ölçülebilir. Bununla birlikte, bu tür modellerde antitümör aktivite sergileyen yeni bileşiklerin% 88&#39;i klinik araştırmalarda başarısız olur. 11 Bu kısmen insanlarla fare arasındaki farklılıklar nedeniyle; Bununla birlikte, bu başarısızlığın büyük bir kısmı subkutan fare modellerinin düşük prediktif değerinden kaynaklanmaktadır. Tümör hücrelerinin orijin organına enjekte edildiği ve böylece orijinal mikro ortamda büyüdüğü ortotopik fare modelleri, kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılır. 11 , 12 , </sUp&gt; 13 , 14 Ortotopik modeller sadece lokal tümör büyüme koşullarını simüle etmekle kalmaz; Ortotopik fare modelleri, tümör büyümesinin anatomik olarak doğru bir yerinin bir sonucu olarak, metastazın gerçekçi simülasyonunu sağlar ve bu nedenle CRC&#39;deki farklı tedavilere 8 , 15 , 16 veya CTC biyolojisini incelemek için kullanılır. 13 , 17 Ortotopik fare modellerinin en büyük dezavantajı, teknik karmaşıklığıdır. Hücrelerin enjekte edileceği organa bağlı olarak, deneyci, tekrarlanabilir tümörleri indükleyene kadar öğrenme eğrisinin oldukça uzundur. Bu, özellikle tümör hücrelerinin bağırsak duvarına enjekte edilmesi gerektiği için kolorektal kanser modelleri için geçerlidir, bu genellikle perforasyon, tümör hücresi sızıntısı veya endoluminal tümör hücre kaybına neden olur. Bu birBu makale, birincil doku numunelerinden, 2D hücre çizgilerinden ve 3D organoid kültüründen hücre hazırlama yöntemini ve bunların farelerin çekumuna enjekte edilmesini amaçlamaktadır. Burada tarif edilen teknik, enjeksiyon için kullanılan hücre hattının tümör biyolojisine bağlı olarak, alıcı farelerde uzak metastazların ve CTC&#39;lerin tekrarlanabilir formasyonuna yol açarak, oldukça tekdüze tümörlere yol açar. 15

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture Media and Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Glutamax-I Supplement (200 mM)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>TrypLE Express enzymatic dissociation buffer</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>6-/48-well plates with lid</td><td>CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>cell culture flask 75 cm&amp;sup2;, 250 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>cell culture flask 150 cm&amp;sup2;, 600 mL</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>15 mL, 50 mL centrifuge tubes</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes (glass, 150 mm)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>thinly pulled by using a bunsen burner</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>Human Tumor Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>352350</td><td>for primary tumor tissue preparation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>AbbVie Germany GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Medical oxygen</td><td>Air Liquide Medical GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Temgesic</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen - opthalmic ointment</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Normal saline 0.9% (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Braun</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>30G injection needle</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>cellulose swabs</td><td>Lohmann &amp;amp; Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissor - ToughCut</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Needle Holder</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Kit</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture)</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicro Pump with Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Footswitch for SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>15867</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Three-axis Manual Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Magnetic Stand for Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand</td><td>World Precision Instruments</td><td>5479</td><td>equipment for highly controlled orthotopic injection</td></tr><tr><td>Hot Plate 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Hair shaver</td><td>AESCULAP - Braun</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Binocular Surgical Microscope</td><td>Parkland Scientific</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;CTC isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient medium &amp;ndash; Ficoll</td><td>StemCell - Lymphoprep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish, &amp;oslash; 60 x 15 mm, 21 cm&amp;sup2;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Cell Culture Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>aspiration pump connected to the micromanipulator</td></tr><tr><td>Dmz Universal Microelectrode Puller</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration</td></tr><tr><td>Prism Glass Capillaries</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>picking buffer</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>picking buffer</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>picking buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>picking buffer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunohistochemistry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td></tr><tr><td>HRP rabbit anti-mouse IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)</td></tr></tbody></table>

isolation of circulating tumor cells in an orthotopic mouse model of colorectal cancer

Kolay uygulanabilirlik ve maliyet etkinliğinin avantajlarına rağmen, subkutan fare modelleri ciddi sınırlamalara sahiptir ve tümör biyolojisi ve tümör hücresi yayılımını doğru bir şekilde simüle etmemektedir. Ortotopik fare modelleri bu sınırlamaların üstesinden gelmek için sunulmuştur; Bununla birlikte, bu tür modeller teknik olarak özellikle büyük bağırsak gibi içi boş organlarda talep ederler. Güvenilir bir şekilde büyüyen ve metastaz yapan tek tip tümörler üretmek için, standartlaştırılmış tümör hücresi hazırlama teknikleri ve enjeksiyon önemlidir. Oldukça üniform bir tümör geliştiren ve tümör biyolojisi çalışmaları ve terapötik denemeler için kullanılabilen bir ortotopik fare modelinde kolorektal kanser (CRC) geliştirdik. Primer tümörler, 2 boyutlu (2D) hücre dizileri veya 3 boyutlu (3D) organoidlerden gelen tümör hücreleri çekum içine enjekte edilir ve enjekte edilen tümör hücrelerinin metastatik potansiyeline bağlı olarak oldukça metastatik tümörler oluşturur. Ek olarak,CTC&#39;ler düzenli olarak bulunabilir. Burada, 2D hücre çizgilerinin ve 3D organoidlerin yanı sıra primer tümör dokusundan, cerrahi ve enjeksiyon tekniklerinin yanı sıra tümörlü farelerden CTC&#39;lerin izolasyonu ve mevcut sorun giderme ipuçlarından tümör hücresi hazırlama tekniğini açıklıyoruz.

Bu modelde başarılı ve tekrarlanabilir nesil kolorektal tümörlerin oluşması, hücrelerin dökülmeden veya sızıntı olmadan doğru şekilde enjekte edilmesine bağlıdır. Bu elde edilirse, bu model son derece güvenilirdir ve nadiren yapay periton yayılımı ile sonuçlanır. Tümörlerin büyüme kinetiği ve yayılma şekilleri, kullanılan organoidlerin ve hücrelerin biyolojisine bağlıdır. HCT116 hücreleri güvenilir, bu modelde, karaciğere metastaz ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer at JoVE.com

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC&#39;lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.9K Görüntüleme.  Technische Universität Dresden.  Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz. 

Video: Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Kanser Araştırmaları

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Kolorektal Kanser Ortotopik Fare Modeli

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

Biyoloji

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an urgent need to understand the mechanisms behind metastasis development, and thus to propose efficient treatments for advanced cancer. Metastatic cancers are hard to treat, as biopsies are invasive and inaccessible. Recently, there has been considerable interest in liquid biopsies including both cell-free circulating deoxyribonucleic acid (DNA) and circulating tumor cells from peripheral blood and we have established several circulating tumor cell lines from metastatic colorectal cancer patients to participate in their characterization. Indeed, to functionally characterize these rare and poorly described cells, the crucial step is to expand them. Once established, circulating tumor cell (CTC) lines can then be cultured in suspension or adherent conditions. At the molecular level, CTC lines can be further used to assess the expression of specific markers of interest (such as differentiation, epithelial or cancer stem cells) by immunofluorescence or cytometry analysis. In addition, CTC lines can be used to assess drug sensitivity to gold-standard chemotherapies as well as to targeted therapies. The ability of CTC lines to initiate tumors can also be tested by subcutaneous injection of CTCs in immunodeficient mice.
Finally, it is possible to test the role of specific genes of interest that might be involved in cancer dissemination by editing CTC genes, by short hairpin ribonucleic acid (shRNA) or Crispr/Cas9. Modified CTCs can thus be injected into immunodeficient mouse spleens, to experimentally mimic part of the metastatic development process in vivo.
In conclusion, CTC lines are a precious tool for future research and for personalized medicine, where they will allow prediction of treatment efficiency using the very cells that are originally responsible for metastasis.

Culturing CTCs allows a deeper functional characterization of cancer, through assaying specific marker expression, and assessing drug resistance and the ability to colonize the liver among other possibilities. Overall, CTC culture could be a promising clinical tool for personalized medicine to improve patient outcome.

Dolaşımdaki Tümör Hücre Hatları: Temel ve Çevirisel Araştırmalar için Yenilikçi Bir Araç

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the tumor microenvironment, play a crucial role in metastatic CRC progression and predict poor patient prognosis. However, there is a lack of satisfactory mouse models to study the crosstalk between metastatic cancer cells and CAFs. Here, we present a method to investigate how liver metastasis progression is regulated by the metastatic niche and possibly could be restrained by stroma-directed therapy. Portal vein injection of CRC organoids generated a desmoplastic reaction, which faithfully recapitulated the fibroblast-rich histology of human CRC liver metastases. This model was tissue-specific with a higher tumor burden in the liver when compared to an intra-splenic injection model, simplifying mouse survival analyses. By injecting luciferase-expressing tumor organoids, tumor growth kinetics could be monitored by in vivo imaging. Moreover, this preclinical model provides a useful platform to assess the efficacy of therapeutics targeting the tumor mesenchyme. We describe methods to examine whether adeno-associated virus-mediated delivery of a tumor-inhibiting stromal gene to hepatocytes could remodel the tumor microenvironment and improve mouse survival. This approach enables the development and assessment of novel therapeutic strategies to inhibit hepatic metastasis of CRC.

Portal vein injection of colorectal cancer (CRC) organoids generates stroma-rich liver metastasis. This mouse model of CRC hepatic metastasis represents a useful tool to study tumor-stroma interactions and develop novel stroma-directed therapeutics such as adeno-associated virus-mediated gene therapies.

Karaciğer Metastazı Stromasını İncelemek için Kolorektal Kanser Organoidlerinin Portal Ven Enjeksiyonu

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D tumoroids. Since patient derived tumor organoids can retain the characteristics of the original tumor, these reliable preclinical models enable cancer drug screening and the study of drug resistance mechanisms. However, CRC related death in patients is mostly associated with the presence of metastatic disease. It is therefore essential to evaluate the efficacy of anti-cancer therapies in relevant in vivo models that truly recapitulate the key molecular features of human cancer metastasis. We have established an orthotopic model based on the injection of CRC patient-derived cancer cells directly into the cecum wall of mice. These tumor cells develop primary tumors in the cecum that metastasize to the liver and lungs, which is frequently observed in patients with advanced CRC. This CRC mouse model can be used to evaluate drug responses monitored by microcomputed tomography (&#181;CT), a clinically relevant small-scale imaging method that can easily identify primary tumors or metastases in patients. Here, we describe the surgical procedure and the required methodology to implant patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice.

This protocol describes the orthotopic implantation of patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice. The model recapitulates advanced colorectal cancer metastatic disease and allows for the evaluation of new therapeutic drugs in a clinically relevant scenario of lung and liver metastases.

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Tıp

Intracecal Tumor Cell Injection: A Technique to Deliver Cancer Cells for Establishing Orthotopic Colorectal Cancer Mouse Model

Source: Kochall, S., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55357"> Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer </a> J. Vis. Exp. (2017)
The video describes the technique for intracecal injection of cancerous cells to develop an orthotopic mouse model with highly uniform tumors. Therefore, the orthotopic mouse model allows realistic simulation of metastasis, providing a valuable tool to study the phenotype changes during tumor growth and dissemination.

İntracekal Tümör Hücresi Enjeksiyonu: Ortotopik Kolorektal Kanser Fare Modeli Oluşturmak için Kanser Hücreleri Verme Tekniği

Source: Kochall, S., et al.  Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer  J. Vis. Exp. (2017)
The video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

kalın bağırsak kanseri

Hayvan modeli çalışmaları

Establishing Experimental Metastases Mouse Model: Implanting GFP Expressing CRC Organoid Cells in PDX Model to Detect Micrometastases

Source: Okazawa, Y. et al.&#160; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57374"> High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video describes the protocol for generating metastases by the PDX derived CRC organoids labeled with GFP lentivirus into the spleen of an immunodeficient mouse. Cancer micrometastases colonizing other organs can be detected using a fluorescence microscope to assess the GFP expression.

Deneysel Metastaz Fare Modelinin Kurulması: Mikrometastazları Tespit Etmek için PDX Modelinde GFP İfade Eden CRC Organoid Hücrelerinin İmplante Edilmesi

Source: Okazawa, Y. et al.&#160;  High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a ...

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

Source: Okazawa, Y., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57374"> High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.&#160;