Name: ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer at JoVE.com

Biz hücresel uygulamalar hakkında verimli tartışmalar devam için Laurent Limozin Pierre Dillard ve Astrid Wahl teşekkür ederim. Ayrıca SEM gözlemleri ile yaptığı yardım için PLANETE temiz oda tesisinden Frederic Bedu teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen hibe sayılı 307.104 FP / 2007-2013 / ERC yoluyla Avrupa Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.

1. Temizleme Kapaklı-slaytlar ve Gözlem Odaları <ol><li> Politetrafloroetilen (PTFE) gibi bir inert malzemeden yapılmış bir çok slaytlı tepsi üzerinde cam kapak-slaytlar düzenlemek. </li><li> bir yüzey aktif madde çözeltisi içinde slaytlar ile tepsi ve gözlem odasına (uygun olan kuartz küvetler temizlenmesi için önerilen herhangi bir ürünü) daldırın. </li><li> (20 ve 30 ° C arasında), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzey aktif madde çözeltisi içinde bir ultrasonik banyo, ultra ses dalgalarına maruz bırakın kullanılması. </li><li> ultra-saf su ile 5 kez (18.2 MΩ.cm, 0.059 uS / cm) ile durulayın. </li><li> (20 ve 30 ° C arasında), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzey aktif madde çözeltisi içinde ultra ses dalgalarına maruz. </li><li> ultra saf su ile 10 kez durulayın. </li><li> Tekrarlayın iki kez 1.5 ve 1.6 adımları tekrarlayın. </li><li> en fazla bir hafta süresince oda sıcaklığında (20 ° ila 30 ° C) su içinde depolanmalıdır. </li></ol> Protein Nano nokta 2. Fabrikasyon <ol><li> boncuk birikmesi <ol><li> deposit 15 derecelik bir eğim ile tutulan (170 um kalınlığı 24 x 24 mm), silis boncuklar (% 2 v / v, 70 uL), bir kapak sürgü üzerinde damla damla süspansiyon. </li><li> 90 °, her 15 saniye ile cam saygısız Süspansiyon yaklaşık 1 dakika boyunca yayılmıştır olsun. </li><li> Sıvı ortam koşulları altında buharlaşmasına izin verin. </li><li> 2 güne kadar çevre koşullarında temiz bir cam ya da PTFE bölmesi içinde depolayın. </li></ol></li><li> Alüminyum birikmesi <ol><li> Bir alüminyum (% 99) ila yaklaşık 105 mm arasında bir mesafede döner bir masaya (RF) magnetron püskürtme ekipmanı 8, bir radyo frekansı içindeki slaytları (bölüm 2.1&#39;de elde edilmiş) yerleştirin: silikon (% 1) hedefi. </li><li> Bir turbo moleküler pompası kullanılarak 2.6 x 10 -4 Pa birikim bölmesinin aşağı pompa. Bu adım, olası gaz kirliliklerin uzaklaştırılması için önemlidir. </li><li> 0.8 Pa (6.6 mTorr) bir basınçta, 10 sccm&#39;lik bir akı ile saf argon atmosferi (5 N,% 99.999) tanıtılması. <br/&gt; Not: Gelen argon akışı bir kütle akış kontrol cihazı tarafından kontrol edilir ve süreç basınç bir manometre kullanılarak izlenir. Argon gazı akışı süreklidir ve giriş ve çıkış açıklığı valf arasında bir denge tarafından kontrol edilir. </li><li> RF güç jeneratörü açın. Not: Burada, 13.56 MHz frekansında 400-600 W radyofrekans gücü tipik bir aralık kullanılmıştır. RF jeneratörü kapasitif plazma birleştirme modunda bir denkleştirme ağı ile birlikte kullanılır. Yansıyan güç izlenir ve ağ adaptasyonu kullanılarak en aza indirilmiştir. </li><li> Plazma stabilize edildikten sonra, 2 dakika hedefinin yüzeyi olası yabancı maddelerin ayrılması için kapalı bir kapak tutmak için püskürtmeyle çökeltilmesi. </li><li> deklanşör açın ve 60 dakika 200 nm kalınlığında bir cam slayt alüminyum yatırmak için püskürtme devam etmesini sağlar. </li><li> Argon akışını kesme biriktirme odasından turbomolekuler pompa izole etmek için vanayı kapatın ve temiz n bölmesinin havalandırılmasıitrogen oda basıncı elde edildi. alüminyum kaplı slaytlar kurtarma. bir aya kadar çevre şartları altında temiz ve hava geçirmez bir şekilde sızdırmaz kılınmış bir cam ya da PTFE kutusuna, saklayın. </li></ol></li><li> Organosilan buhar biriktirme <ol><li> (20 ve 30 ° C arasında 50 W, 50/60 Hz), bir ultrasonik banyo içinde 30 s n için oda sıcaklığında ve ultra sonikasyon ultra saf su içinde aşama 2.2.6 hazırlanan alüminyum kaplı slayt bırakın. </li><li> bir desikatör altındaki (3-aminopropil) -triethoxysilane (APTES&#39;le) mevduat 0.5 mL. DİKKAT: APTES&#39;le kolayca buharlaşır ve toksik olan bir organosilan, bir. APTES sadece akış başlığı altında ve eldiven ile ele alınmalıdır. </li><li> kurutucunun içindeki bir seramik ızgara ve yerde (2.3.1 hazırlandı), cam slaytlar koyun. </li><li> bir zar pompası Kurutucuyu bağlayın ve 30 dakika düşük bir vakum oluşturmak için en yüksek güçte çalıştırın. </li><li> Kurutucunun vanayı kapatın ve pompayı kapatın. </li><li> desiccator ısıtın1 saat boyunca yaklaşık 50 ° C arasındadır. </li><li> desiccator açın ve slaytlar toplamak. </li><li> Oda sıcaklığında 48 saate kadar (20 ila 30 ° C) depolama için başka bir temiz desikatöre aktarın. </li></ol></li><li> proteinin, birinci tabakanın birikmesi - biyotinle etiketlenmiş sığır serum albümini (BSA-biyotin) <ol><li> PTFE destek üzerinde bölüm 2.3&#39;de hazırlanan slaytlar bir şekilde yerleştirin. </li><li> Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde çözülmüş 25 mg / ml BSA-biyotin Deposit 1 ml. Oda sıcaklığında (20 ila 30 ° C) 30 dakika boyunca bırakın. </li><li> PBS ile 10 kez yıkayın. Işık kaynağından uzakta 4 ° C&#39;de 24 saate kadar boyunca örnek saklayın. </li></ol></li><li> alüminyum maske çıkarılması <ol><li> Oda sıcaklığında (20 ° ila 30 ° C) aşırı gece (pH≈12 elde etmek için yaklaşık 100 ml PBS, 1 M NaOH damla damla ilave etmek suretiyle hazırlandı) PBS içinde bir NaOH çözeltisi içinde slaytlar inkübe edin. DİKKAT. NaOH korozif ve eldiven kullanarak ele alınmalıdır. </li><li> DurulamaUltra saf su içinde 10 kat. </li></ol></li></ol> Desteklenen lipid iki katmanlı 3. Çökelme (SLB) <ol><li> Langmuir yalak Temizleme <ol><li> bir pompa kullanılarak Langmuir oluğun PTFE muhafaza içinde su çıkarın. </li><li> kloroform içinde ıslatılmış, havsız dokunmamış tek havlu ile temizleyin. DİKKAT. Kloroform zehirlidir ve (ya da bir akış başlığı altında) bir maske ile ve uygun eldiven, iyi havalandırılan bir manipüle edilebilir olmalıdır. </li><li> ılık ultra-saf su (40 ila 50 ° C) ile temiz 4 kez. </li><li> Soğuk ultra saf su ile temizleyin en az 6 kere. </li></ol></li><li> birinci lipid tabakasının birikmesi <ol><li> Langmuir oluğun PTFE muhafaza PTFE tepsiler yerleştirin ve daha sonra, aşırı saf su ile doldurun. </li><li> 0 mN / m olarak ölçülmüştür basıncını ayarlamak için Langmuir aygıtın kontrol yazılımı. </li><li> (1 mg / ml lipid çözeltisi 30 uL yatırmak 1 gaz geçirmez bir cam / metal şırınga kullanınSu yüzeyinde 2-dioleoil-sn glisero-3-fosfokolin, kloroform (DOPC)). kloroform buharlaşır ve lipit molekülleri kendiliğinden bir tek tabaka oluşturur. </li><li> ulaşıldığında (DOPC 27 mN / m) istenen basınca kadar PTFE bir bariyer kapatarak lipit tek tabaka sıkıştırmak için kontrol yazılımı. </li><li> Motorlu bir kelepçe kullanılarak PTFE mahfaza içine bölüm 2.5.2&#39;de hazırlanan cam slayt daldırma için kontrol yazılımı. </li><li> dikey hava-su ara yüzüne, kelepçe, slayt tutun. / M 27 mN sabit bir basınç muhafaza edilirken, arayüz aracılığıyla yavaş yavaş (15 mm / dak) yükseltmek için kontrol yazılımı. </li><li> Oda sıcaklığında 24 saate kadar (20 ° ila 30 ° C) ya da derhal kullanmak için ya da depolama için, kuru bir ortamda bir yer. </li></ol></li><li> Geriye, ikinci lipit tabakanın birikmesi <ol><li> / M 27 mN istenen değerde Langmuir teknedeki yüzey basıncını muhafaza edin. kullanarak sıkıştırınLangmuir aparat ve / veya kontrol yazılımı arzu edilen basınç elde etmek için bir lipid az miktarda ekleyin. </li><li> yatay olarak su yüzeyinde, bölüm 3.2.6 hazırlanan lipit tek tabaka, taşıyıcı cam slaytlar yerleştirin. Her slayt PTFE tepsinin üstünde yüzen emin olun. </li><li> Aşağı cam slaytlar itin suda batırılır şekilde PTFE ya da metal cımbız kullanarak karşılık gelen PTFE tepsisine bir seferde bir kayar. iterken slaytlar devirme kaçının. </li><li> Ultra saf su slaytlar havaya maruz değildir emin ile dolu bir kristalizöre slaytlar içeren PTFE tepsileri aktarmak için PTFE ya da metal cımbız kullanarak. </li><li> bir gözlem haznesine, bir iki tabakalı kaplama cam slayt sualtı çalışma sırasında, transfer PTFE ya da metal cımbız kullanarak. NOT: gözlem odası kristalleştirici içindeki suyun altına yerleştirilir. gözlem odası özel yapılmış ve bir lastik contası, bir PTFE halka oluşurAlt yüzeyi daha önce lipit çift katman ile kaplanmış bir cam slayt yapılmış olan bir su sızdırmaz bir oda için sualtı monte edilebilir d çelik kılıfı. </li><li> Su altında çalışmaya devam ve suyun yaklaşık 1 ml bölmesi içinde tutulur sağlarken bölmeyi kapatın. </li><li> Su dışında monte odası al. su geçirmez ve kaçak serbest olduğundan emin olun. </li><li> ekleme ve PBS 10 kez 500 uL kaldırarak PBS ile bir gözlem odasına ultra saf suyun bir 1 mL değiştirin. kamara sıvısının asla yoksun olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> SLB engelleme adımı <ol><li> Bölüm 3.3.6 hazırlanan slayt içeren bir gözlem odasına sığır serum albümini, 100 ug / mL (BSA) tanıtılması ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (20 ° ila 30 ° C) inkübe edilir. </li><li> çıkarılması ve PBS 10 kez 500 uL eklenmesiyle çift katman durulayın. iki tabakalı 4 ° C &#39;de 24 saat muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol> Ligantlar içeren 4. işlevselleştirilmesi <ol><li> 20 ve 30 ° arasında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bölüm 3.4.2&#39;de hazırlanan slayt (ihtiva haznesine 2 ug / mL&#39;de floresan veya floresan olmayan nötravidin (NAV, avidinin Deglikosile versiyonu pH 7 dolu değildir) ekleyin C). </li><li> ekleme ve PBS 10 kez 500 uL kaldırarak durulayın. </li><li> Bölüm 3.4.2&#39;de hazırlanan slayt içeren hazneye 2 ug / mL biyotinlenmiş anti-CD3 ekleyin. SLB ve noktaların çift işlevselleştirilmesi için (burada, iki tabakalı nitrilotriasetik asit (NTA), lipidlerin +% 1 DOPC yapılmıştır) 5 ug / mL, Fc-ICAM-1, His-etiketi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (20 ° ila 30 ° C) bekletin. </li><li> 10 kez ilave edilmesi ve 500 ul PBS kaldırarak durulayın </li><li> 10 kez ilave edilmesi ve hücre ortamının 500 uL kaldırarak hücre ortamıyla PBS (PBS +% 0.1 BSA) değiştirin. </li><li> CHAMBE hücre ortamının 200 mcL bırakınslayt r. </li><li> hücreler ilave edilmeden önce 37 ° C &#39;de 10 dakika süre ile odasına yerleştirin. </li></ol> 5. Hücre Birikimi (ayrıntılar için referans 7) <ol><li> Dikkatlice hazneye hücre süspansiyonunun 400 uL yatırmak. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakılır. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca paraformaldehit% 2 (PFA) ile hücreyi saptamak. sürekli çıkarma ve PBS 500 uL PBS ile PFA değiştirin. </li></ol> 6. Gözlem <ol><li> Proteo-lipit Nano desen ve SLB akışkanlığı <ol><li> BS TFT 506 + 582 + 659;, EM TBP 526 + 601, örneğin, burada EX TBP 483 + 564 + 642 (uygun aydınlatma dalga boyu (639 nm) ve filtre küpleri kullanarak görüntü epi-floresan modunda protein deseni, bir floresans mikroskobu kullanarak 688). Not: sinyalin yoğunluğu içinde ve nokta dışında protein miktarını tahmin etmek için ölçülebilir. uygun bir aydınlatma dalga boyu (330 nm) ve f kullanınResme ilter küp karanlık deliklere sahip aydınlık görünen iki tabakalı (BP 365/12, FT 395, LP 397). </li><li> Çift-katlı izleyici lipidlerin difüzyon katsayısına ölçmek için sürekli verilmedi ağartma (CPB) tekniği 13, 15 kullanın. Bu gözlem, tercihen sadece SLB birikimi sonra yapılır. Not: Difüzyon sabit ölçmek için, iki parametre KPB işlemi sırasında ölçülür: boya (gergin) ve ağartılmış alanı (tauD) etrafında oluşan halo floresan profilinin bozunma uzunluğunun belirli bir ağartma süresi. İlk KPB işlemi sırasında yanar alanın merkezinde floresan yoğunluğunun zaman evrim çizilmesi ile elde edilir. İkinci (kararlı durum ulaşıldıktan sonra 12 satır ve 5. görüntülerin ortalaması) aydınlatılan bölgenin kenarında yoğunluk profili çizilmesi ile elde edilir. eğriler, sarsıntısız ve tauD elde etmek üzere monte edilmiştir. difüzyon sabiti ta verilirUd 2 / gergin (D = <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster.">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Kaizuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immunological+Synapse:+A+Molecular+Machine+Controlling+T+Cell+Activation.">The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation.</a> Science. 285, 221-228 (1999).</li><li>Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-mediated+friction+determines+morphodynamics+of+spreading+T+cells.">Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells.</a> Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+viral+antigen+processing+generates+peptide-specific+MHC+class+I+cell-surface+clusters.">Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).</li><li>Pi, F., Dillard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Tunable+Organic+Nanodot+Arrays:+A+Versatile+Platform+for+Manipulating+and+Imaging+Cells.">Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells.</a> Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).</li><li>Deeg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation+is+determined+by+the+number+of+presented+antigens.">T cell activation is determined by the number of presented antigens.</a> Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).</li><li>Delcassian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+ligand+spacing+influences+receptor+triggering+in+T+cells+and+NK+cells.">Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells.</a> Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).</li><li>Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+and+efficient+T+cell+activation+with+stimulatory+aCD3+nanoarrays.">Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays.</a> Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).</li><li>Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-clustering+of+ligands+on+surrogate+antigen+presenting+cells+modulates+T+cell+membrane+adhesion+and+organization.">Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization.</a> Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).</li><li>Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometric+protein-patch+arrays+on+glass+and+polydimethylsiloxane+for+cell+adhesion+studies.">Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies.</a> Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).</li><li>Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+intermembrane+distance:+case+study+of+avidin+and+E-cadherin+mediated+adhesion.">Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion.</a> Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).</li><li>Sengupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+tissue+surfaces+by+supported+membrane+coupled+ultra-thin+layer+of+hyaluronic+acid.">Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid.</a> Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).</li><li>Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independently+controlling+protein+dot+size+and+spacing+in+particle+lithography.">Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography.</a> Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).</li><li>Massou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+ordered+topographical+and+chemical+nano-features+from+anodic+alumina+templates.">Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates.</a> Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).</li><li>Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+adhesion+cluster+formation+during+initial+cell+adhesion.">Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion.</a> Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spreading+and+focal+adhesion+dynamics+are+regulated+by+spacing+of+integrin+ligands.">Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands.</a> Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Schvartzman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithographic+Control+of+the+Spatial+Organization+of+Cellular+Adhesion+Receptors+at+the+Single-Molecule+Level.">Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level.</a> Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).</li><li>Mossman, K., Groves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+supported+membranes+as+tools+for+quantitative+studies+of+the+immunological+synapse.">Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse.</a> Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).</li><li>Furlan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+CD45+both+positively+and+negatively+regulates+T+cell+receptor+phosphorylation+in+reconstituted+membrane+protein+clusters.">Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters.</a> J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).</li><li>Hsu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation.">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398 (2012).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yukarıda tarif edilen protokol içindeki kritik adım desteklenen bir lipit çift katman protein nano nokta veya noktalar çevresindeki alan arka-dolgu oluşumu ile ilişkilidir. Protein nano nokta ile ilgili olarak, ilk kritik bir adım boncuk maske hazırlanmasıdır. kapak slayt temizleme kritiktir. Slaytlar, ya da oksijen plazma ile kuartz küvetler temizlenmesi için önerilen bir deterjan çözeltisi ile temizlenmesi gerekir. etanol ya da izo-propanol tedavisinde daldırma gibi diğer temizleme teknikleri yeterince hidrofilik cam render yoktur ve bu nedenle, büyük bir kapsama boncuk tek tabaka oluşumunu desteklemez. Aynı zamanda, sürgü yüzeyi Langmuir-Blodgett tekniği 7, 15, 16 ile SLB oluşumu sonraki aşamada ile uyumlu olması gerekmektedir. sonraki kritik adım, birikme ve çıkarılmasıdırlaminum. çökeltme püskürtme tekniği vasıtasıyla ise burada yapıldığı gibi, hedef (% 1), silisyum katkılı olması gerekir. Hedef saf alüminyumdan yapılmış ise muhtemelen alüminyum oksit ve biriken alüminyum tabakası ve cam slayt alt-tabaka arasındaki iç içe oluşumuna, yukarıda tarif edildiği gibi, aksi halde, biriken tabaka, alkali hidroksit çözeltisi ile kaldırmak zordur. Biriktirme süresi 9 Ancak burada tek biriktirme zamanı ve bu nedenle tek nokta boyutu ile çalıştım protein noktaların boyutunu belirler. örnek BSA-biyotin çökeltilmesinden sonra bir hafta alüminyum birikimi aylarca sonra da çevre koşulları altında ve saklanabilir. İkinci önemli adım SLB birikimi ile ilgilidir. cam kapak slayt temizlenmesi yine bir derece önemlidir noktasıdır. Herhangi bir Langmuir-Blodgett çökeltme iş için olduğu gibi, kullanılan tüm malzeme cam veya Po yapılmalıdırlytetrafluoroethylene (PTFE) ve titizlikle temiz olmalıdır. İlk lipid tek tabaka birikimi sonra, kapak slaytlar birkaç gün boyunca saklanabilir ama ikinci tek tabakalı birikimi sonra, hemen kullanılması gereken. Biz T lenfosit yapışma çalışmalarda kullanım için anti-CD3 nano nokta oluşturmak için protokol göstermiştir iken 9, 13, prosedür son derece esnektir ve herhangi bir biyotinile protein için uyarlanabilir. çift ​​katlı lipid bileşimi kolayca değiştirilebilir ve istenirse ayrıca fonksiyonel hale getirilebilir. Dikkate alınması gereken bir önemli nokta özellikle noktalar çevreleyen lipit çift katman üzerinde, proteinlerin muhtemel spesifik olmayan emme olduğunu. tekniğin başlıca sınırlaması birinci maske koloidal-boncuk kendini montaj kullanımı ortaya çıkar. tabandan tavana tekniği olmak, tüm bu yaklaşımların sorunların bazılarını paylaşanörneğin, model şekli üzerinde esneklik ve tam kontrol eksikliği. model kafes zorunlu boncuk maske simetrisini gösterir ve bu nedenle de her zaman altıgen şeklindedir. Model motifinin şekil bir dairedir ve boncuk büyüklüğü bir kombinasyonu ve alüminyum birikimi 9, 13 süresi ile tespit edilir. Nokta boyutu kontrol etmek için alternatif teknikler de, 18, 14 17 ileri sürülmüştür. Proteinler, protein fragmanları ya da peptidleri ile Yüzeyleri nano desenler kapsamlı hücre-yüzey etkileşimlerini, özellikle yapışma 19 ve taşıma 20 araştırmak için geçmişte kullanılmıştır. Öncü çalışma doku-oluşturucu hücreler, belirli bir eşik 21 daha büyük saha ve daha fazla araştırma SHO desen yaymak için başarısız olduğunu göstermiştir<html> Bu olgunun uzunluğu ölçekli 22 hücre iskeleti aktine integrin reseptörleri bağlayan aracı bulunmaktadır Talins, büyüklüğü ile ayarlandığını evli. Ancak, tüm bu çalışmalarda, proteinlerinin kendisinin cam üzerinde immobilize edildi altın nano parçacıklar için bağlanmıştır. Tipik olarak, antijen-sunan hücreler taklit T hücreleri, proteo-lipit membranlar bağlamında, yoğun, T hücre fonksiyonunun 6 temel özelliklerini anlamak için kullanılmıştır. Hünerli nano desenleme teknikleri T hücresi / APC arabirimi 23 yapısı ve bağlantı fikir sağladı metal bariyerler ayırma proteinin fonksiyonel SLB lekelere sahip corrals oluşturmak için kullanılmıştır. Nano-desen Bu tür Bununla Burada önerilen protein nano noktalar çok farklıdır. Son zamanlarda, nano-kümeleri proteinin fonksiyonel lipitlerin kimyasal bağlantı kullanılarak oluşturulanreseptör kümelenme sonucu ışık tutacak p = &quot;xref&quot;&gt; 3. avantajı mevcut durumda farklı olarak, kümeler prensipte kendileri mobil olabilir olmasıydı. Bununla birlikte, bu, kendiliğinden oluşan kümeler mutlaka daha az burada tarif edilen önceden oluşturulmuş bir protein nano noktalar daha boyutu ve yoğunluğu açısından kontrol edilir. Biz nano nokta dekore SLBS Burada sunulan protein hücre-hücre yapışması farklı yönlerini araştırmak için kullanılabileceğini öngörmektedir. Ortaya çıkan bir belirgin soru doku oluşturucu hücreler 19 için yukarıda tarif edildiği gibi, çok yapışması ile ortaya çıkan bir iç uzunluk ölçeğini lenfositleri olup olmadığıdır. Ön sonuçlar, yapışma TCR kompleks ile en azından zaman olduğunu gösterir gibi görünmektedir, yerine mesafeden daha ligandların yoğunluğu, 12 yayma ve aktivasyon 10, 11 için tanımlama parametresidir <sup&gt; 13. Çevre SLB etkileri bu gözlem ve ne kadar, mobil ve sabit parçalar birlikte çalışan mobil ligantın dahil edilmesi, kısmen kendi kendini monte SLB bağlanmış kümeler 24 kullanılarak ele bir olası soru olup olmadığı. Mobil ve immobilize ligandlara hücre yapışma / aktivasyon T hücreleri 7, 25 değil, aynı zamanda alışıldığı hücre dışı matris 26 bağlı hücreler için, sadece farklı olduğu gösterilmiştir burada başka bir ilgi çekici uygulama mekano-algılama kapsamında olacaktır. Bu proteo-lipit desen iki temel avantaj gelişmiş optik mikroskopi ve kullanım ve-mesafe uygulamalar ile uyumlu hale getirir preparasyon kolaylığı ile substratların uyumluluğu bulunmaktadır. alüminyum birikimi ardından, tüm hazırlama adımları, standart ıslak laboratuar tezgahı üzerinde gerçekleştirilebilir. Gelecekte, bu öngörülen edilebilir alüminyum kaplamalı ve özel bir tesiste üretilen cam destekli boncuk maskeler aktarılır olarak kullanım için biyoloji laboratuvarlarında depolanır ve gerektiğinde. Bu bakış açısıyla, bu yüzeyler kontrollü nano desenli proteo-lipit membranlar ile hücrelerin etkileşimini incelemek için tercih ettiği bir platforma olma potansiyeline sahip olduğuna inanıyoruz.

<html> Hücre yapışması, hücre dışı matris üzerinde veya başka bir hücre üzerinde kendi meslektaşı bağlanabilen olan hücre zarı üzerinde mevcut olan özel hücre yapışma molekülleri (CAMlar) proteinleri aracılığıyla gerçekleşir. Yapışan hücreler üzerinde, her yerde integrin ve cadherin dahil olmak üzere en yapışma molekülleri, kümelerin 1 şeklinde bulunurlar. Antijen sunan hücreler ile T lenfositler (T hücreleri) etkileşmesi (APC) iki hücre arasındaki ara yüzeyde oluşan reseptör kümelerinin önemi özellikle çarpıcı bir örnek teşkil etmektedir - genellikle bir immünolojik sinaps adı. CSMAC (daha büyük bir orta moleküllü bir küme oluşturmak için platformlar 2, 3, 4 sinyal olarak görev yapar ve en sonunda merkezi T hücresi formu mikron çaplı kümelerinin yüzeye APC T hücre reseptörleri (TCR&#39;ler) ile ilk temas oluşturan üzerine )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Son zamanlarda, bu APC tarafında gösterilmiştir, TCR&#39;nin ligandların da 8 kümelenir. APC ilgili protein ile fonksiyonel bir yapay yüzeyi tarafından taklit edilir T hücre-APC etkileşiminin, hibrid sistem dağıtım, bağlamında, sinaptik arayüzü 2, 3, 4, 5, 6, 7 anlaşılmasını büyük olan . Bu bağlamda, hedef hücrenin bir veya daha fazla yönlerini yakalamak APC mimetik yüzeyleri tasarlamak için son derece önemlidir. ligandlar desteklenen lipid çift tabakaları aşılanmış Örneğin, bunlar, çift-katlı düzleminde difüze APC yüzeyi üzerinde durumu taklit ve aynı zamanda oluşmasına izin verebilircSMAC 6, 7. Benzer bir şekilde, APC üzerinde kümeleri polimerler 9, 10, 11, 12, 13, 14 bir denizde ligandların yaratırlar tarafından taklit edilmiştir. Ancak, bu iki özellik şu ana kadar kombine edilmemiştir. Burada difüzyon lipidler ile bir lipit çift katmanı ile çevrelenir, anti-CD3 (TCR kompleksinin hedefleyen bir antikor) nano-noktaları oluşturmak için yeni bir teknik açıklanmaktadır. Iki tabakalı Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer tekniği 7, 15, 16 kullanılarak yatırılır ve eğer arzu edilirse, belirli bir protein ile işlevselleştirilebilir - örneğin, T hücresi integrin ligandı (ICAM1 olarak adlandırılır). Buna ek olarak, anti-CD3 protein noktalar could başka bir antikor ya da CAM ile değiştirilebilir. T hücre yapışma çalışmaları için platform olarak ileride kullanılmak üzere proteinler seçilmiş olmakla birlikte, burada açıklanan bir strateji herhangi bir protein ve hatta DNA için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observation chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer&amp;nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Water MQ&amp;nbsp;</td><td>ELGA, Veolia France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silica beads</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gastight syringe&amp;nbsp;</td><td>Dominique Dustcher , France</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Film balance</td><td>NIMA</td><td>Medium</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>TIRF-III system</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Target&amp;nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&amp;egrave;me&amp;nbsp;</td><td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

Şu anda hücre biyolojik çalışmalar için pasifize yüzeyinin denizinde yapışkan proteini adaların sıralı dizi oluşturulurken önemli bir ilgi vardır. Geçmiş yıllarda, bu canlı hücreler kendilerine sunulan moleküllerin biyokimyasal doğaya hem de bu moleküller sunulmaktadır yolu değil, tepki giderek daha açık hale gelmiştir. Birçok biyoloji laboratuvarlarında artık standart nedenle protein mikro desenleri olan oluşturma; Nano-desenler de daha erişilebilir. Bununla birlikte, hücre-hücre etkileşimleri bağlamında, desene bir ihtiyaç sadece proteinleri değil, aynı zamanda, lipid ikili tabakaları vardır. Böyle ikili proteo-lipit desenleme şimdiye kadar kolayca erişilebilir olmamıştır. Biz cam üzerinde desteklenen bir protein nano nokta oluşturmak ve desteklenen bir lipit çift katman (SLB) ile arası nokta alanı doldurmak için genellikle bir yöntem önermektir, basit bir teknik sunar. izleyici foto-ağartma itibaren floresan lipidleri SLB dahil, biz iki tabakalı in-pl hatırı sayılır gösterdiğini kanıtlarane akışkanlığı. floresan gruplarla protein noktalar fonksiyonlandırmak görüntünün onları ve düzenli bir altıgen kafes içinde sıralanır olduğunu göstermek için bize izin verir. Tipik nokta boyutu yaklaşık 800 nm&#39;dir ve burada gösterilen aralık 2 mikrondur. Bu alt-tabakalar, hücre yapışması, göç ve mekano-algılama çalışmaları için yararlı platformlar hizmet etmesi beklenmektedir.

Fluoresans görüntüleri noktaların aralık ve boyutunu ölçmek için analiz edilmiştir. Tipik aralık olduğu bulunmuştur 1,900 ± 80 nm ve tipik nokta boyutu 600 ± 100 nm (Şekil 1 g) idi. aralık maskesi için kullanılan boncuk boyutuna göre ayarlanır. nokta boyutlu boncuk büyüklüğü gibi kaplama koşulları tarafından belirlenir. SLB SLB görüntüleme kanalı görülen delikler ve NAV görüntüleme kanal görülen noktalar arasındaki tam tamamlayıcılık ile onlara benzersiz protein noktalar çevresinde olup (Şekil 2) tatbik edilir. Sürekli verilmedi ağartma verilerinin analizi, desenli çift tabakası içinde lipidler akışkan olarak kalır ve 5 μm² / s (Şekil 3) tipik bir difüzyon katsayısına sahip olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig1.jpg" /> Şekil 1: üretim aşamalarının şematik temsili. (a </strong&gt;) Birincil boncuk maskesi. Ankastre maske bir tarama elektron mikroskobu (SEM) görüntüsü, 2 mm çapında boncuklar ile yapılan ve ince bir alüminyum tabakası ile kaplanmış göstermektedir. Bu resimde kullanılan parametreler şunlardır: 400 W RF x 10 -7 Torr&#39;dan Argon, 5 kV hızlandırma voltajı görüntülü 10 SCCM, işlem basıncı 6.2 mTorr, akı 9 başlangıç basıncında devrik mil nominal bir alüminyum kalınlığı 200. görüntü boncuklar, cam slayt üzerinde bir tek tabaka merkezli altıgen kafes içinde düzenlenmiş alüminyum birikimi önce optik mikroskopi (dahil değildir görüntüsü) ile yapılan gözlem teyit. (B) İlk değişim boncuk maskenin kaldırılmasından sonra püskürtülerek bırakılması tarafından oluşturulan alüminyum ikincil maskesi. İkinci maske olsa organosilan ve BSA-biyotin (c) Biriktirme. Alüminyum (d) çıkarılması BSA-biyotin nano noktalar ortaya çıkarılmıştır. SLB (e) Biriktirme. BSA-biyotin NAV bağlanması (f). (G) Bağlama<html> NAV anti-CD3. Ankastre nano noktalar dizilerin epi-floresan görüntü gösterir. İşte nav floresan etiketli edilir. Tipik nokta boyutu 600 ± 100 nm ve tipik aralık 1.900 ± 80 nm&#39;dir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55060/55060fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig2.jpg" /> Şekil 2: Nano-nokta ve SLB desenin Tamamlayıcılık. (A, b) floresan NAV nano nokta ve floresan izleyici lipidleri ile SLB Epi-floresan ve görüntüler. (C) SLB (yeşil) denizde NAV noktalar (kırmızı) Kompozit görüntü NAV ve SLB mükemmel tamamlayıcılık göstermektedir. iç kümede Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) görüntü uzun menzilli sırasını gösterir. Ölçek çizgisi: 4 um.rge.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55060/55060fig3.jpg" /> Şekil 3: SLB lipid difüzyon miktarının belirlenmesi. Ağartma önce SLB (a) Epi-floresan görüntü. Protein noktalar lipidlerin parlak denizde koyu delikleri gösteriyor. alan diyafram aydınlatılmış alanı sınırlar. 50 s boyunca sürekli olarak ağartılması sonra SLB (b) Epi-floresan. alan diyaframla ayrılmış bölge içinde, halo görebilir lipidler mobil olduğuna işaret etmektedir. Ölçek çizgisi: 10 um. (C) alan diyafram (üst) ve beaching işlemi (alt) sırasında zaman içinde yoğunluğu çürüme kenarı boyunca ortalama yoğunluk profili. Bu veriler, tipik olarak 5 μm² / s yayılma sabit, elde etmek için analiz edilir.

Watch this Scientific Journal Video about Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer at JoVE.com

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K Görüntüleme.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir. 

Video: Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biyokimya

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

Karbon Nanotüpler tarafından Stabilize İçeriden Kendinden monte Lipid Parçacıklar uyduruk hazırlanması

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

Kimya

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Biyomühendislik

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

Su/Hava Arabiriminde Hidrofobik Organik Moleküllerle Doped Hibrid Lipid Membranların Kendi Kendine Montajı

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Lipid Membranlar Üzerinde Işık Kontrollü Tersinir Protein Deseni

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Yazar Spotlight: Yapay Hücresel Sistemlerde Tersinir Modelleme için Fotoğraf Değiştirilebilir Protein Alımı

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler