Name: studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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1. Preparación de la célula <ol><li> Las células que crecen <ol><li> Crecer D. discoideum células en medio AX a 23 ° C bajo luz en placas de cultivo de tejidos. Evitar mantener las células a altas densidades superiores a 75% de confluencia. NOTA: Para obtener una respuesta óptima al estrés térmico, las células necesitan estar en la fase de crecimiento exponencial y no deberían haber alcanzado la fase estacionaria. </li><li> El día antes de exponer, las células se dividieron en medio de fluorescencia baja (LFM) a 1 x 10 4 células / ml. NOTA: Este paso es necesario para reducir la fluorescencia de fondo causado por el medio de AX. El tiempo de incubación puede ser reducido a un mínimo de 2 horas. Sin embargo, las vesículas se recogió en medio AX todavía puede generar un poco de señal de fondo después de 2 horas. </li></ol></li><li> Las células se preparan para la microscopía <ol><li> Antes de imágenes, las células de la cosecha de la placa en el tejido LFM y la transferencia de un número adecuado de células en placas de fondo de cristal. NOTA: Por lo general,1 x 10 5 células / ml es suficiente; Sin embargo, si la configuración experimental requiere periodos largos de formación de imágenes (más de 8 horas), el número de células necesitan ser ajustados cuidadosamente, como D. discoideum células pasará al ciclo de desarrollo y empezar a transmitir y global si el número de células son altos mientras que los nutrientes son bajos. </li><li> Permitir que las células se asienten durante 20 minutos. Eliminar las células no resueltos por la sustitución con cuidado el medio utilizado con medio fresco. </li></ol></li></ol> 2. Imaging NOTA: El protocolo se puede utilizar en sistemas de gran campo, así como en las configuraciones de microscopía confocal. El uso de una caja de incubación de temperatura controlada que cubre los objetivos y la platina del microscopio es útil, sin embargo, no es esencial para el control de la temperatura. La temperatura de la caja de incubación se ajusta a la temperatura más alta utilizada en el experimento, por ejemplo, a 40 ° C si no se realiza el estrés por calor. De lo contrario, la temperatura se establece en 256; C. Los cambios de temperatura deben hacerse con anticipación para permitir que el sistema se adapte, como los cambios de temperatura durante la exploración pueden afectar el enfoque. NOTA: Durante la formación de imágenes, la temperatura se controla mediante una cámara de enfriamiento. La temperatura predeterminada para obtener imágenes de células no estresado es de 23 ° C. Para las condiciones de estrés por calor, la temperatura se aumenta en consecuencia al nivel deseado. El elemento piezoeléctrico en la cámara de enfriamiento puede responder muy rápidamente a la cambio de temperatura. Sin embargo, el enfoque de las imágenes va a cambiar ligeramente (que puede desviarse a un máximo de 20 micras dependiendo del cambio de temperatura). Por lo tanto se requiere reorientación manual de dentro de los primeros minutos de adquisición de imágenes, a menos que el microscopio usado está equipado con un hardware de enfoque automático. <ol><li> La adquisición de imágenes en condiciones no estresadas <ol><li> celdas de imagen en condiciones sin estrés a 23 ° C, adquieren un mínimo de 6 campos de visión (FOV). NOTA: condición no el estrés puede ser visualized mediante la grabación de un corto lapso de tiempo (5-30 min) o la adquisición de imágenes fijas representativas. Para cada línea celular condición o adquirir un mínimo de 6 campos de visión (FOV). NOTA: En el caso de las células individuales son de interés, la posición de las respectivas células en el medio de la FOV y grabar una serie de baldosas 3 x 3 con el campo de visión que contiene las células de interés en el medio D.. discoideum células son móviles y pueden migrar fuera del campo de visión. Sin embargo, la serie de baldosas de 3 x 3 aumenta el área potencialmente explorado por la célula de interés y sigue siendo detectable por períodos de lapso de tiempo de ~ 6 horas. </li><li> Adquirir z-pilas de máximo 7 micras de 1-0.25 m pasos para capturar todo el volumen de la célula. </li><li> Adquirir una imagen de referencia de campo claro para evaluar el número total de células. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes de estrés por calor <ol><li> Ajustar la temperatura de la cámara de enfriamiento a 30 ° C de acuerdo con las instrucciones del fabricante. &lt;/ Li&gt; <li> Después de la exhibición de la temperatura ha alcanzado el valor deseado, vuelva a enfocar manualmente en el canal de campo claro y se les presentarán todas las FOV registrados antes de iniciar el lapso de tiempo. </li><li> Iniciar un lapso de tiempo de 4 horas de estrés por calor con un intervalo de tiempo de 5-10 minutos entre los puntos de tiempo. Compruebe el correcto enfoque durante la adquisición de los dos primeros puntos de tiempo. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes durante la recuperación <ol><li> Después de estrés por calor, reducir la temperatura de nuevo a 23 ° C, esperar a que el indicador de temperatura para ajustar y reorientar manualmente. </li><li> Grabar películas a intervalos en la fase de recuperación de 8-10 horas en intervalos de tiempo de 10-20 min. Compruebe el correcto enfoque durante la adquisición del primer punto de tiempo. </li></ol></li></ol> Análisis 3. Imagen NOTA: Para cuantificar el número de células que albergan focos citosólica, evaluar el número total de células y el número de células con focos citosólica en cada momentomarco. Debido a la dificultad de la segmentación de las células a partir de imágenes de campo claro, la cuantificación que hay que hacer manualmente. En lo que sigue, se describe el análisis de datos para el paquete libre de procesamiento de imagen ((http://fiji.sc/Fiji). Se requiere el plugin &quot;Cell Counter&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Evaluar número total de células <ol><li> Cargar la pila brillante imagen de campo (XYT) haciendo clic en &quot;Archivo&quot; y &quot;Abrir&quot;. </li><li> Abra el &quot;Cell Counter&quot; plug-in ( &quot;plugins&quot; - &quot;Cell Counter&quot;). Cargar la pila de la imagen haciendo clic en &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Elegir el tipo adecuado de contadores, marcando la casilla correspondiente. NOTA: El uso de tipo 1 como contador para el número total de células y tipo 2 como contador de células con focos citosólica. Contar todas las células. </li><li> Guardar los marcadores haciendo clic en &quot;Guardar&quot; marcadores. </li></ol></li><li> Evaluar el número de células con focos citosólica <ol> &lt;li&gt; Carga la HyperStack imagen de fluorescencia (XZYT) ( &quot;Archivo&quot; - &quot;Open&quot;) y hacer una proyección de intensidad máxima con el &quot;Z-proyector&quot; (Imagen / Pilas). </li><li> Abrir el plugin &quot;Cell Counter&quot;. Cargar la pila de la imagen resultante (XYT) haciendo clic en &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Cargar los marcadores haciendo clic en &quot;Marcadores de carga&quot;. PRECAUCIÓN: Los nombres de archivo de la imagen de referencia y la pila de fluorescencia deben ser idénticos. Si es necesario, cambiar el nombre en consecuencia antes de inicializar la pila de imágenes. </li><li> Elegir el tipo de marcador apropiado (véase 3.1.3) y contar las células con focos citosólica. Los marcadores existentes se pueden utilizar como guía para la posición de las células individuales. </li><li> Recuperar el número de cuentas por rebanada haciendo clic en &quot;Resultados&quot; y guardar los recuentos en otro lugar para otros cálculos. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El protocolo descrito aquí se puede utilizar para estudiar el comportamiento de una proteína particular de interés en respuesta al estrés inducida por calor. Aumento de la temperatura a 30 ° C ha sido reportado para desencadenar la respuesta de estrés de calor y bajo estas condiciones, la viabilidad de D. discoideum se reduce notablemente. modificaciones El protocolo puede ser modificado para comparar el comportamiento de diferentes proteínas en las mismas condiciones de estrés. Para esto, las células que expresan diferentes proteínas con la misma etiqueta fluorescente se transfieren en placas de múltiples pocillos, tal como cuatro platos de cámara (sección 1.3.1). El protocolo también se puede aplicar sobre las células proteínas con diferentes marcadores, tales como GFP o RFP co-expresan. Esto puede ser por ejemplo utilizado para monitorear el comportamiento de los diferentes componentes del sistema de control de calidad de la proteína (PQC). Las células que expresan el marcador agregación BPA de etiquetado y diferentes componentes PCQ RFP-etiquetados se pueden observar utilizando múltiples pocillosen forma de plato para la imagen. Esto asegura las mismas condiciones de estrés (velocidad de aumento de la temperatura / disminución, la duración de la temperatura de aumento / disminución) y permite estudios comparativos. Además, el protocolo se puede utilizar para estudiar la influencia del sistema de PQC en la respuesta al estrés de calor. La actividad de los componentes puede ser modulado por cambios en los niveles de expresión utilizando herramientas genéticas tales como knock-out o sobreexpresión o mediante el uso de inhibidores específicos disponibles en el mercado 6. El proteasoma puede ser inhibida por la adición de MG132 (100 M) o lactacistina (10 M) al medio de crecimiento. La chaperona Hsp90 puede ser inhibida usando geldanamicina (6 M) o radicicol (10 M). La chaperona Hsp70 puede inhibirse con VER-155 088, aunque no pudimos confirmar la eficacia de la inhibición en nuestras condiciones experimentales hasta ahora. Los inhibidores se deben añadir un día antes de formación de imágenes y las células se incuban durante 14 hr. Criti<html> Cal pasos dentro del Protocolo El paso crítico para la evaluación de la perturbación inducida por calor es el estado de las células antes del experimento de formación de imágenes. Los estudios en levadura mostraron que las células adquieren resistencia a una variedad de problemas ambientales durante la fase estacionaria 13. También se observó la capacidad de respuesta mínima al estrés térmico aplicado si D. discoideum células habían alcanzado la fase estacionaria antes de la imagen. Por lo tanto, el mantenimiento de un número constante de celda &lt;5 x 10 5 células / ml es crítica. Por otra parte, el número de células altas pueden inducir la transición del ciclo vegetativo de D. discoideum con el ciclo de desarrollo, lo que desencadena vías de hambre, lo que podría dar lugar a una respuesta diferente al estrés por calor. Si se alcanzan altos números de células en la fase de recuperación después de estrés por calor, streaming y células de agregación pueden interferir con el análisis de datos como las células se mueven fuera de foco (véase la Figura 4). contenido &quot;&gt; limitación de la técnica La pérdida de enfoque es el cuello de botella del protocolo. Durante los cambios de temperatura, el plano focal puede cambiar drásticamente, lo que requiere reorientación manual en un período de tiempo inmediatamente después de cambiar la temperatura. El salto en el enfoque a veces puede ser demasiado extrema para ser vencido por el enfoque automático de software, especialmente si el tiempo entre los puntos de tiempo es alta. Sin embargo, si el microscopio usado está equipado con un enfoque automático hardware, este cuello de botella puede ser evitado. Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes En comparación con las configuraciones existentes, tales como el uso de habitaciones con aire acondicionado, cajas de incubación a temperatura controlada relativas a los objetivos y las etapas platina del microscopio o con control de temperatura y collares objetivos, el uso de una cámara de enfriamiento proporciona un control más preciso del ambiente temperatura. El elemento Peltier en la cámara de refrigeración puede mantener una tem constante y uniformetura a lo largo de la configuración experimental. En configuraciones clásicas, las diferencias de temperatura locales podrían dar lugar a resultados diferentes de observación. Además, se puede responder de forma rápida y rápidamente a los cambios inducidos en la temperatura, mientras que las configuraciones clásicas se adaptan muy lentamente a los cambios inducidos por la temperatura, especialmente la reducción de la temperatura. El elemento Peltier en la cámara de enfriamiento también puede cubrir una gama más amplia de temperatura (15-40 ° C) que las configuraciones clásicas, con el que las temperaturas que alcanzan tales como 15 ° C o 40 ° C es muy difícil. Dictyostelium discoideum es particularmente sensible a la foto-toxicidad. Estudios previos han usado ascorbato como eliminador para reducir la fototoxicidad. Sin embargo, los períodos de formación de imágenes largas requieren suplementos adicionales. Por otra parte, el uso de ascorbato se limita a estudios en los que el mecanismo de interés no se ve afectada por el suplemento antioxidante. Proponemos que la imagen de temperatura controlada se puede utilizar como una alternativa aproxoach para minimizar foto-toxicidad y se podría combinar con la adición de ascorbato para disminuir aún más la toxicidad. efectos fototóxicas pueden minimizarse proporcionando una temperatura constante y uniforme de 23 ° C usando una cámara de enfriamiento. Las células imágenes utilizando el control de temperatura muestran menos signos de foto-toxicidad, tal redondeo celular, por un período de tiempo más largo. Esto también permite obtener imágenes con intensidades más altas, intervalos de tiempo más cortos o más campos de visión (FOV). Aplicacion General El estrés por calor a temperaturas más altas se ha demostrado para desencadenar una respuesta de estrés diferente de calor 14. Por lo tanto, aumentando la temperatura hasta 34 ° C o 37 ° C podría inducir una respuesta diferente. Además del estrés temperatura aplicada, la duración de una situación de estrés en particular puede ser modificado para estudiar la respuesta inmediata o adaptación a largo plazo al estrés por calor. En general, el protocolo descrito puede serexpandido a una amplia gama de aplicaciones. Dado que el control preciso de la temperatura reduce considerablemente efectos de foto-tóxico, el protocolo se puede utilizar en entornos que requieren altos tiempos de exposición y / o intensidades de luz de excitación más altos, por ejemplo, para la visualización de las proteínas con un bajo nivel de expresión, o en combinación con intervalos de tiempo cortos entre las imágenes, por ejemplo, cuando se toman imágenes de lapso de tiempo. También puede ser ventajoso para obtener imágenes de objetos que abarcan toda la célula, por ejemplo, los microtúbulos, ya que estos ajustes requieren un alto número de z secciones ópticas.

Dictyostelium discoideum amebas son solitarios la vida del suelo que se alimentan de bacterias y otros microorganismos, que son absorbidos por fagocitosis. Tiene un ciclo de vida única y singular que ha sido un área importante de la investigación desde su descubrimiento 1. El interés en el desarrollo temprano multicelular 2 y la base molecular de la quimiotaxis 3 pronto se complementa con estudios centrados en la motilidad celular, la polaridad celular, la inmunidad innata. Además, D. discoideum se introdujo como un sistema modelo para la investigación biomédica 4,5. Recientemente, hemos establecido D. discoideum como un nuevo sistema para estudiar el sistema de control de 6,7 calidad de la proteína (PQC). Su proteoma está enriquecida en proteínas priónicas-como agregación propensos, lo que plantea un reto al control de calidad de las proteínas 8. Para investigar si D. discoideum ha desarrollado mecanismos moleculares especiales para controlar su muy agproteoma congregación propensas, se estudió el comportamiento de las proteínas marcadoras agregación propensos tanto en condiciones de crecimiento normales y durante el estrés. Condiciones de estrés, tales como el estrés por calor, se pueden utilizar para aumentar la tasa de proteínas misfolding 9. Por lo tanto, se buscó un sistema en el que podríamos inducir cambios de temperatura y al mismo tiempo seguir el comportamiento de las proteínas marcadoras. Para este propósito, se combinaron imágenes de células vivas con calefacción controlada por sistema Peltier utilizando una (cámara de enfriamiento) inserto etapa térmica. Este método nos permitió mantener una temperatura constante y uniforme, así como para inducir un cambio rápido, pero precisa de la temperatura. Imágenes de células vivas se utiliza para estudiar una variedad de procesos biológicos en D. discoideum. Sin embargo, este enfoque se enfrenta a dos limitaciones importantes. En primer lugar, las células muestran un alto motilidad y tienden a migrar fuera del campo de visión, el seguimiento tanto de las células individuales a menudo requiere de formación de imágenes de un área grande. La movilidad celular puedereducirse en agar de recubrimiento 10, sin embargo, estas condiciones no son adecuadas para formación de imágenes a largo plazo debido a una disminución de la viabilidad. En segundo lugar, D. discoideum células muestran una particularmente alta sensibilidad a la foto-toxicidad, lo que resulta en el redondeo celular y detención mitótica 11. Protocolos anteriores abordan este problema mediante la adición de ascorbato como un eliminador de radicales y reducción de los tiempos de exposición 12. Este último puede ser crítica si la proteína de interés se expresa en niveles bajos y muestra una señal de fluorescencia débil. Los autores también sugieren para proporcionar una temperatura constante de 21 ° C, ya sea por formación de imágenes en una habitación con aire acondicionado o mediante el uso de cajas de incubación a temperatura controlada, que cubren la etapa objetiva y microscopio 12. A continuación, describimos un método con control de temperatura mejorado mediante el uso de una cámara de enfriamiento ajustado a 23 ° C. Durante una imagen nuestra puesta a punto mejora significativamente la resistencia a la fototoxicidad. Esopermite el uso de los tiempos de exposición superiores e intensidades de luz de excitación más altos. Esto es de particular importancia cuando se toman imágenes de lapso de tiempo, ya que los intervalos de tiempo tienen que ser sopesado frente a la cantidad de puestos fotografiados y el tiempo de exposición utilizado. La posibilidad de aumentar el número de posiciones fotografiadas también permite la cobertura de un área de imagen más ancho y facilita el seguimiento de las células individuales en un periodo de tiempo más largo.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

El protocolo de formación de imágenes descrito se puede utilizar para analizar el comportamiento de las proteínas priónicas como agregación propensos en la ameba D. discoideum durante el estrés por calor. La Figura 1 muestra la distribución de poliglutamina Q103 proteína GFP-etiquetado en las células en condiciones de crecimiento normales (Figura 1A), después de 2 horas de estrés por calor a 30 ° C (Figura 1B) y después de 6 horas de recuperación estrés y crecimiento en condiciones de crecimiento normales (Figura 1C). Al aumento de la temperatura desde 23 ° C a 30 ° C, el marcador Q103-GFP se une de una distribución difusa a punctata estructuras. Tras la liberación del estrés y el crecimiento a temperatura normal, estas estructuras se disuelven. La redistribución de Q103-GFP y la formación de estrés inducido por calor focos citosólica se pueden cuantificar usando análisis de imágenes. La figura 2A muestra el análisis de FOV individuales utilizando Fiji y el plugin &quot;Cell mostrador &quot;. La figura 2B muestra la cuantificación de la respuesta al estrés de calor. Esto demuestra que el aumento de focos Q103-GFP citosólico en serie con la continuación de estrés por calor. Durante el estrés por calor, el sistema (CMC) de control de calidad de la proteína es abrumado, por tanto, agregación- proteínas propensas como el Q103 proteína prión-como no se pueden mantener en un estado soluble y cada vez agregada en focos citosólica. las células también muestran un redondeo característica, como se muestra en la Figura 1B. la reducción de focos citosólica después de la eliminación del estrés sugiere que el agregado proteínas se disuelven. La calidad de la imagen es sensible a la densidad celular inicial. Figura 3 muestra un ejemplo de las células después de la recuperación de estrés, la comparación de la densidad adecuada inicial de células (Figura 3A) y la densidad celular inicial alta (Figura 3B). Si la densidad celular inicial era demasiado alto, las células estrellated para formar corrientes como se muestra en la Figura 3b. Este que impone dificultades en la posterior cuantificación medida que las células se han trasladado fuera del plano focal. El método descrito se puede utilizar para controlar los cambios inducidos por la temperatura como se describe anteriormente. También se puede utilizar para reducir la foto-toxicidad cuando la formación de imágenes a temperatura crecimiento fisiológico. Figura 4 muestra una comparación de células fotografiado a 23 ° C en una cámara (Figura 4A) enfriar y células fotografiado sin control de temperatura en una habitación con aire acondicionado, establece a 25 ° C (Figura 4B). Tras la exposición constante a la luz de excitación, las células completan cuando no está reflejado en las condiciones de temperatura controlada. Este cambio en la forma de la célula es lo que indica el estrés. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Figura 1: <strong&gt; proteínas priónicas-como agregación propensos a cambiar su distribución celular durante el estrés por calor. GFP-etiquetados poliglutamina ricos huntingtina exón 1 (Q103) se expresa constitutivamente en AX2-214 D. discoideum células (señal de GFP se muestra en la tabla de búsqueda de escala de grises invertida). (A) En condiciones normales de crecimiento a 23 ° C, Q103-GFP se distribuye de manera difusa en el citoplasma. (B) Después de 2 horas de estrés por calor a 30 ° C, Q103-GFP se une en focos citosólica (flechas rojas). Las células muestran un cambio de forma característica y completan. (C) Después de la liberación del estrés y el crecimiento a 23 ° C, los focos citosólica se disuelven. Después de 6 horas, se puede observar no focos citosólica. Barra de escala = 10 micras. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2: Cuantificación de la formación de focos citosólico inducida por calor (A) Análisis de las células utilizando el paquete de procesamiento de imágenes libre de Fiji y el &quot;Cell Counter&quot; plug-in.. La cantidad total de células (tipo 1, marcadores contador azul) se determina la imagen de campo claro en. Los marcadores son cargados en el GFP-canal y el número de células con focos citosólica (tipo 2, los marcadores de contador rojo) se determina. (B) Cuantificación de los focos después de 3 h de estrés por calor a 30 ° C y 3 horas de recuperación de estrés a 23 ° C (n = 4 campos de visión, el error bar = SD). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 3: Efecto de la densidad celular en las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo Las células (A) fotografiados en densidades celulares iniciales &lt;10 5 células / ml.. Después de 3 horas de estrés por calor a 30 ° C y 6 h de recuperación de la tensión a 23 ° C, las células todavía permanecen en el ciclo vegetativo y se dividen. Sólo pocas células salen del plano focal. (B) Las células de captación de imagen a densidades celulares iniciales&gt; 10 6 células / ml. Después de 9 horas de formación de imágenes (ajustes como en a), las células han entrado en el ciclo de desarrollo y comenzó el streaming y la agregación. Las células en los agregados no pueden distinguirse claramente. Una gran parte de las células sale del plano focal y no puede ser analizada. Barra de escala = 10 micras. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Figura 4:. Efecto de control de la temperatura sobre los efectos fototóxicas células (A) de captación de imagen para 10 min con control de temperatura a 23 ° C: 6 campos de visión, z-stack (espaciado de 0,5 M, espesor de la muestra 8 M), lapso de tiempo (en total tiempo 10 min, lapso de 1 min), el canal de GFP (0,07 mseg tiempo de exposición, 10% la intensidad del láser), el canal de RFP (0,1 mseg tiempo de exposición, la intensidad del láser 10%). Las células no muestran signos de los cambios morfológicos característicos asociados con el estrés fototóxico. (B) Las células de captación de imagen para 10 min sin control de temperatura (mismas condiciones que en A). Las células presentan signos de fototoxicidad inducida por redondeo, lo que indica el estrés. Barra de escala = 10 micras. Las células fueron imágenes en un sistema basado en un microscopio con un objetivo 100x / 1,4 apertura numérica (NA). Las imágenes fueron recolectados con una cámara CCD como 1.024 x 1.024 píxeles, utilizando los archivos de 1 x 1 hurgar en la basura.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso de imágenes de células vivas con temperatura controlada

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.2K vistas.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Monitoreo de la cinética de agregación de proteínas in vivo mediante el conteo automatizado de inclusión en Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Bioquímica

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Neurociencias

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Biología

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene<em&gt; En vivo</em&gt; Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

Una cámara flexible para imágenes de células vivas de lapso de tiempo con microscopía de dispersión Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Bioingeniería

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína

Resumen

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A largo plazo de imágenes en vivo