Name: tools to study the role of architectural protein hmgb1 in the processing of helix distorting, site-specific dna interstrand crosslinks
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks at JoVE.com

Yazarlar yararlı tartışmalar için Vasquez laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma [Kmv için CA097175, CA093279] Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü [RP101501] ve. açık erişim ücret karşılığında Fon: National Institutes Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü [KMV için CA093279].

Plazmid substratlar üzerinde TFO yönelik ICLs hazırlanması 1. <ol><li> 10,11, DNA tripleks bağlanma tamponu [% 50 gliserol, 10 mM Tris (pH 7.6), 10 mM MgC 8 ul psoralen-konjuge TFO AG30 (5 ug plazmid DNA, iyi bir başlangıç noktasıdır) plazmid pSupFG1 eşit molar miktarlarda inkübe 2] ve amber rengi bir tüp içinde 40 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar dH 2 O. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. 12 saat boyunca 37 ° C su banyosunda reaksiyon inkübe edin. </li><li> Tam güç çıkışı sağlamak için UVA lamba ısıtın. parafin filmde tripleks reaksiyonu yerleştirin ve UVA (365 nM) lambası altında buz üzerinde parafin filmi yerleştirin. lamba ve tepki arasındaki bir Mylar filtre yerleştirin. </li><li> UVA 1.8 J / cm2 toplam doz için ışın tedavisi. Daha fazla kullanım için 4 ° C&#39;de örnekleri saklayın. Dikkat: UVA ışınlama ile uygun koruyucu gözlük ve giysiler giyin. </li><li> RE yukarıda hazırlanan plazmid 200 ng Linearizeüreticisi kullanılarak 20 ul toplam hacmi sınırlandırması enzim Eko R1 10x tampon verilir. Isıtma 65 ° C&#39;de 20 dakika süreyle enzim denatüre. 10,000 x g&#39;de 10 dakika süre ile numuneler spin ve 4 ° C&#39;de depolayın. </li><li> 50x alkalin tampon [1.5 M NaOH, 50 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)] hazırlanır. 50 ml dH 2 O ile agaroz 0.5 mg ekle agaroz çözülür ve 50 ° C su banyosunda yerleştirmek için kaynatın. </li><li> çözündürüldü agaroz ısılar 50 ° C sonra, 50x alkali 1 ml tampon eklemek, karıştırmak ve daha sonra jel tepsiye jel dökün. Jel kullanmadan önce oda sıcaklığında katılaşmaya için zaman tanıyın. </li><li> Doğrusal hale getirilen DNA örneğin 20 ul 0.5 M EDTA 4 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 6x alkali jel yükleme tamponu ekleyin (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, (w /% 18 hacim), yüksek molekül ağırlıklı polisakkarid,% 0.06 bromokresol dH 2 O) örnekleri ve 1 kb DNA merdiveni. NOT: 6x alkali jel yükleme tamponu kullanılması önemlidir, tartışma bakın. </li><li> Yük soğuk oda jel üzerine örnekleri ve cm başına 3.2 volt gecede 1x alkali tampon (12-16 saat) çalıştırın. Örnekler jel girdikten sonra, yüzer önlemek için jel üstünde bir cam plaka yerleştirin. </li><li> nötralizasyon tamponu [1 M Tris-Cl (pH 7.6), 1.5 M NaCI, 3 M sodyum asetat (pH 5.2)], oda sıcaklığında 45 dakika boyunca jel ıslatılmasıyla, örnekleri nötrleştirmek. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süre ile 50 ml su içinde% 1, etidyum bromür (EtBr) 4 ul DNA jel leke. 15 dakika boyunca su ile destain. Bir görüntüleme sistemi ile DNA görselleştirmek. Dikkat: EtBr güçlü bir mutajen ve deri yoluyla absorbe edilebilir. EtBr ile doğrudan temastan kaçının. </li></ol> İnsan hücrelerinde TFO yönelik ICL-içeren plazmidlerin 2. transfeksiyonu ve immüno-çökeltme <ol><li> Plaka 400,000 memeli hücreleri (örneğin, U2OS ODulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde 60 mm tabak başına steosarcoma hücre) 24 saat transfeksiyondan önce antibiyotikler olmadan,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübe hücreleri. </li><li> Bir su banyosu içinde 37 ° C transfeksiyon sıcak büyüme ortamı ve fosfat tamponlu tuz (PBS) önce. Oda sıcaklığına kadar transfeksiyon reaktifi ısıtın. </li><li> 10 dk için 500 1 x büyüme ortamı ul (karışım 1) ve 2 ayrı 14 ml 1 x büyüme ortamı (karışım 2) 500 ul plazmidler ICL içeren TFO yönelik yuvarlak tabanlı tüp ug transfeksiyon reaktifi 30 ul inkübe oda sıcaklığı. </li><li> 2, mix yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın karışımı 1 ekleyin. Oda sıcaklığında 25-30 dakika inkübe edilir. </li><li> sıcak PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Hücrelerin plaka boyunca eşit dağıtarak damla damla moda transfeksiyon karışımı ekleyin. plakasına büyüme ortamının 1 ml ilave edilir ve 2 ml nihai hacim getirmek. biz mixll. 4 saat% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör kültür plakaları yerleştirin. </li><li> % 10 FBS ile takviye edilmiş 3 mi büyüme ortamı ile değiştirin ve 16 saat daha inkübe edilir. Antibiyotik kullanmayın. </li><li> yaklaşık olarak% 1 bir son konsantrasyona plaka başına% 37 taze formaldehit 80 ul hücreleri tedavi ve ışıksız ortamda, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. Dikkat: Formaldehit toksik ve güvenlik talimatlarına göre ele alınmalıdır. Formaldehit maruziyeti deri, göz ve solunum yollarında zarar verebilir. </li><li> Plaka başına (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) soğutulmuş glisin 300 ul ilave edildikten ve 5 dakika için inkübe edilmesi ile formaldehid çapraz bağlanmasını Quench. Ortamı çıkarın ve soğuk PBS ile iki kez yıkanır ve daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpü içine soğutulmuş (4 ° C) PBS, 1 ml kazınarak hücreleri toplamak. her zaman buz üzerinde örnekleri tutun. </li><li> Ve 5 dakika 4 ° C &#39;de santrifüj ile hücre pelletleri hazırlamakBir masa buzdolabında santrifüj kullanılarak 13.400 xg t. Pipet dışarı Süpernatantı ve buz üzerinde hücre pelet yerleştirin. </li><li> Homojen olarak 1 ml soğutulmuş (4 ° C) tampon A (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) pelet tekrar süspansiyon ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Tersine tüp bazen karıştırın. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (yukarıdaki adım 2.9 bakınız). </li><li> Homojen soğutulmuş 1 ml pelet (4 ° C) tampon B (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) tekrar süspansiyon ve çevrilmesi ile ara sıra karıştırma ile 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile Pelet hücreleri (yukarıdaki adım 2.9). </li><li> Tampon B soğutulmuş 200 ul içinde tekrar hücrelerin tekrar micrococcal nükleaz (MNase) 2 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. tüp hafifçe vurarak bazen tepkisini karıştırın. Buz üzerinde tüp yerleştirilmesi ve 40 mM EDTA eklenerek MNase reaksiyonu durdurun. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (yukarıdaki adım 2.9 bakınız). </li><li> 100 ul 1x kromatin immunopr yeniden süspanse hücreleriproteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş ecipitation tamponu (ChIP) tamponu (piyasada mevcut kitler verilir). </li><li> ince duvarlı mikrofüj tüpü içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler yerleştirin. buz üzerinde 20 sn inkübasyon tarafından takip 20 saniye boyunca su banyosu sonikatör bunları yüzen tarafından örnekleri sonikasyon. Tekrarlayın sonikasyon ~ 800-1,200 bp parçaları üretmek için 9 kez yineleyin. <ol><li> sonike numunelerin 20 ul için vorteks yoluyla iyice 3 ul 5 M NaCl ve 1 ul RNaz A karışımını ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Daha sonra, 2 ul Proteinaz K ekleyip 65 ° C&#39;de 2 saat inkübe edilir. PCR saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri arındırın. % 1 agaroz jel örnekleri çalıştırın ve EtBr ile görselleştirmek. NOT: Elde edilen DNA maksimum yoğunluğu veya 1000 bp altında olmalıdır. </li></ol></li><li> Üç ayrı tüplerde, önceden soğutulmuş bir silikonlu bir tüp içinde lizat 30 ul ve ilave proteaz inhibitörleri ile soğutulmuş 1x ChIP tamponu 70 ul ekle. 1 u eklemeilgili borular anti-immünoglobulin G (IgG) (pozitif kontrol olarak), anti-histon H3, ya da anti-HMGB1 antikor örn. sürekli dönmesi ile soğuk bir odada gece boyunca inkübe edin. </li><li> homojen soğuk odada süspanse protein G boncuk. tüp başına protein G boncuk 4 ul ekleyin ve rotasyon ile soğuk bir odada bir 2-4 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> manyetik raf kullanarak, boncuk pelet ve süpernatant kaldırmak. pelet proteaz inhibitör kokteyli ile karıştırılmış 200 ul 1x ChIP tamponu ilave edin ve rotasyon ile soğuk bir odada 5 dakika yıkayın. iki kez yıkayın tekrarlayın. </li><li> yüksek tuzlu 1x ChIP tamponu (70 mM NaCl ihtiva eden) sahip bir ek yıkama yapın. </li><li> (Ticari olarak temin edilebilir kitler temin) 160 ul yıkama tamponu ile pelet yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca rotasyon ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> boncuk pelet ve taze bir tüp içinde süpernatant toplamak. 5 M NaCl 6 ul proteinaz K 2 ul ekleyin ve 65 ° C&#39;de gece boyunca inkübe° C. </li><li> Bir PCR ürünü saflaştırma kiti kullanılarak DNA arındırmak ve 50 ul dH 2 O kullanılarak DNA Zehir </li><li> PCR ilgi bölgesi (ler) primer setleri kullanılarak 16 reaksiyonları gerçekleştirmek ve EtBr ile boyanmış bir% 1 agaroz jeli üzerinde ürün çözümler. </li></ol> 3. süperburulma Testi ve 2 boyutlu Agaroz Jel Elektroforez <ol><li> DNA tamir sentez tamponu hazırlayın (45 mM Hepes-KOH, pH 7.8; 70 mM KCI, 7.4 mM MgCl2, 0.9 mM DTT, 0.4 mM EDTA, 2 mM ATP, 20 uM dNTP,% 3.4 gliserin ve 18 ug sığır serum albümini) . -80 ° C&#39;de saklayın. buz ve önceki üzerinde çözülme 40 mM phosphocreatine ve 2.5 ug kreatin fosfokinaz eklemek kullanmak için. </li><li> Oda sıcaklığında 10 x sarılma tamponu [500 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCI, 25 mM MgCI2, 1 mM EDTA] ve mağaza hazırlayın. </li><li> Tamamen 1x 1 ul Vaccinia Topoizomeraz I (5-15 U / ml) kullanılarak süper-plazmid pSupFG1 DNA 300 ng Linearize10 ul reaksiyon tampon maddesi sarılma. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe karışımı. </li><li> Buz üzerinde HeLa hücre içermeyen özü 24 çözülme. tamamen rahat plasmidler için, 25 ul HeLa hücresi serbest özütü ve DNA onarımı sentez tamponu ilave edin. İyice karıştırın. karışımı, Vaccinia topoizomeraz I ilave 1 ul ekleyin ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> sodyum dodesil sülfat (SDS) (% 1 son konsantrasyon) ve proteinaz-K (0.25 mg / ml son konsantrasyon) eklenerek reaksiyonlar sonlandırma. 2 saat boyunca 65 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1x Tris Borat EDTA (TBE) tamponu ile bir% 1 agaroz jeli Dökme. DNA yükleme boyası ekleyin ve en az 4 şerit dışında jel üzerine doğrudan tepkileri yükleyin. topoisomers çözmek için oda sıcaklığında 1 x TBE 2 V / cm (boyut 1) 8-10 st için jel üzerinde çalıştırıldı. Not: Tris bazı, 54 g ekleyerek dH 2 O 1 L 5x TBE stok çözelti hazırlayın. borik asit 27.5 g ve 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 mi. </li><li> 1x 2 L hazırlayın3 ug / ml miktarında klorokuin katılımının-fosfat TBE. 20 dakika için bu çözelti, 200 ml jel bekletin. alüminyum folyo ile jel tepsisi örtün. </li><li> İkinci boyutta jel Electrophorese için, saat yönünde moda, jele 90 ° çevirin ve pozitif ve negatif sarımları çözmek için 1x TBE içeren klorokin 2 V / cm 4-6 saat çalıştırın. </li><li> bir rocker 1 saat süreyle EtBr ile jel Leke. 15 dakika dH 2 O ile jel destain ve daha sonra bir görüntüleyici kullanarak topoisomers termal dağılımını görselleştirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Moser, H. E., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+cleavage+of+double+helical+DNA+by+triple+helix+formation.">Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation.</a> Science. 238, 645-650 (1987).</li><li>Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+oligonucleotide+binding+represses+transcription+of+the+human+c-myc+gene+in+vitro.">Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro.</a> Science. 241, 456-459 (1988).</li><li>Beal, P. A., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+structural+motif+for+recognition+of+DNA+by+oligonucleotide-directed+triple-helix+formation.">Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation.</a> Science. 251, 1360-1363 (1991).</li><li>Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+targeting+at+short+polypurine+sites+by+cationic+triplex-forming+oligonucleotides.">Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides.</a> J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).</li><li>Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+XPA+and+RPA+DNA+repair+proteins+participate+in+specific+recognition+of+triplex-induced+helical+distortions.">Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).</li><li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex+technology+in+studies+of+DNA+damage,+DNA+repair,+and+mutagenesis.">Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis.</a> Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).</li><li>Chin, J. Y., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA+lesions+associated+with+triplex-forming+oligonucleotides.">Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides.</a> Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).</li><li>Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+for+gene+repair+via+triple+helix+formation.">The potential for gene repair via triple helix formation.</a> J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).</li><li>Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+processing+of+site-specific+DNA+interstrand+crosslinks.">Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks.</a> Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).</li><li>Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+mammalian+cells+mediated+by+intracellular+triple+helix+formation.">Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation.</a> Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).</li><li>Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+mammalian+cells+induced+by+triple+helix+formation+and+transcription-coupled+repair.">Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair.</a> Science. 271, 802-805 (1996).</li><li>Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+function+of+XPC+protein+in+psoralen+and+cisplatin-mediated+DNA+repair+and+mutagenesis.">Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis.</a> Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).</li><li>Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen-induced+DNA+interstrand+cross-links+block+transcription+and+induce+p53+in+an+ataxia-telangiectasia+and+rad3-related-dependent+manner.">Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner.</a> Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).</li><li>Vare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interstrand+crosslinks+induce+a+potent+replication+block+followed+by+formation+and+repair+of+double+strand+breaks+in+intact+mammalian+cells.">DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells.</a> DNA repair. 11, 976-985 (2012).</li><li>Huang, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+crosslinking+damage+and+cancer+-+a+tale+of+friend+and+foe.">DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe.</a> Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).</li><li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+interacts+with+XPA+to+facilitate+the+processing+of+DNA+interstrand+crosslinks+in+human+cells.">HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).</li><li>Bidney, D. L., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+from+cultured+hepatoma+cells+of+two+nonhistone+chromatin+proteins+with+preferential+affinity+for+single-stranded+DNA:+apparent+analogy+with+calf+thymus+HMG+proteins.">Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).</li><li>Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+cruciform+DNA+by+nuclear+protein+HMG1.">Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1.</a> Science. 243, 1056-1059 (1989).</li><li>Jung, Y., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+full-length+HMGB1+binding+to+cisplatin-modified+DNA.">Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA.</a> Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).</li><li>Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+human+high+mobility+group+protein+1+and+replication+protein+A+on+psoralen-cross-linked+DNA.">Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA.</a> Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).</li><li>Das, D., Scovell, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+interaction+of+HMG-1+with+the+TATA-binding+protein/TATA+complex.">The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex.</a> J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).</li><li>Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+recruitment+of+HMGB1+during+V(D)J+recombination+through+interactions+with+RAG1+and+DNA.">Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA.</a> Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).</li><li>Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+B1+enhances+DNA+repair+and+chromatin+modification+after+DNA+damage.">High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).</li><li>Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+HMGB1+directly+facilitates+interactions+between+nucleotide+excision+repair+proteins+on+triplex-directed+psoralen+interstrand+crosslinks.">Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks.</a> DNA repair. 8, 865-872 (2009).</li><li>Park, J. Y., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+DNA+topology+on+plasmid+DNA+repair+in+vivo.">Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo.</a> FEBS letters. , 174-178 (2000).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+triplex-forming+oligonucleotide+target+sequences+in+mammalian+genomes.">High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes.</a> Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).</li><li>Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA.">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li><li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells.">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li><li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells.">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li><li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells.">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li><li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+number+of+2'-O-(2-aminoethyl)+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides.">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li><li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy.">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li><li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer.">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

TFO-yönlendirilmiş ICLs etkili bir şekilde oluşumuna iki önemli faktörlere bağlıdır: hedefine TFO bağlanması afinitesine bağlı olarak hedef DNA alt-tabaka ile TFO inkübasyon uygun tampon bileşenleri (örneğin, MgCI2) Birinci ve zaman (bağımlı dubleks ve konsantrasyonlar) kullanılan; ve ikinci, UVA uygun dozu (365 nm) ışınlama verimli psoralen çapraz bağlantılar oluşturmak için. Optimum tripleks oluşumu HPLC ya da jel saflaştırılmış TFOlar kullanılarak elde edilebili...

Üçlü-helikal bir yapı oluşturmak için 1-5 Hoogsteen-hidrojen bağlanması yoluyla bir dizi-spesifik şekilde oligonükleotid (TFOlar) bağlama dupleks DNA tripleks-oluşturan. Tripleks teknolojisi, transkripsiyon, DNA hasarı tamir ve gen hedefleme (referanslar 6-8 gözden) olarak biyomoleküler mekanizmalar, çeşitli sorgulamak için kullanılır olmuştur. TFOlar muhabiri plazmidler 9,10 site-spesifik zarar ikna etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Laboratuar ve diğerleri daha önce plazmid pSupFG1 5,10-12 ilgili supF genindeki bölgeye spesifik DNA kol içi çapraz bağlantılar (ICLs) ikna etmek için bir psoralen moleküle gergin bir TFO, AG30, kullandık. ICLs bu lezyonlar kovalent iki DNA ipliklerini çapraz gibi son derece sitotoksik olan ve unrepaired bırakılırsa, gen transkripsiyonunu bloke ve DNA replikasyonu makineleri 13,14 engelleyebilir. Çünkü bunların sitotoksik potansiyel ICL-uyarıcı maddeler tedavisinde kemoterapötik ilaçlar olarak kullanılmış olanKanser ve diğer hastalıkların 15. Bununla birlikte, insan hücrelerinde ICLs işleme ve tamir iyi anlaşılmamıştır. Bu nedenle, insan hücrelerinde ICLs işleme oluşumundaki mekanizmaların daha iyi anlaşılması ICL tabanlı kemoterapik rejimlerin etkinliğinin geliştirilmesi için yardımcı olabilir. TFO kaynaklı ICLs ve onarım ara DNA sarmalının önemli yapısal bozuklukların neden olma potansiyeli var. Bu tür bozulmalar kanonik B formu çift katlı DNA 16-20 daha yüksek afinite ile bozulmuş DNA&#39;ya bağlanan, mimari proteinleri muhtemel hedeflerdir. Burada, kromatin immunoprecipitation (ChIP) psoralen-çapraz plazmidler üzerinde deneyler yoluyla insan hücrelerinde ICLs ile son derece bol bir mimari protein dernek, HMGB1 okudu ve insan psoralen-çapraz plazmid DNA topolojisini modüle HMGB1 bir rol tespit kanser hücre lizatları. HMGB1 son derece bol ve yayg ifade non-onunkanonik B formu DNA 17-20 daha yüksek afinite ile hasar görmüş DNA ve alternatif olarak yapılandırılmış DNA alt tabakaları bağlanan sesi mimari proteini. HMGB1 örneğin transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı 16,21-23 gibi çeşitli DNA metabolik süreçlerde, yer almaktadır. Daha önce HMGB1 yüksek afiniteyle 20 ile in vitro TFO yönelik ICLs bağlanan olduğunu göstermiştir. Dahası, HMGB1 olmaması bir nükleotid eksizyon onarım (EŞ) ko-faktör 23,24 olarak TFO yönelik ICLs mutajenik işleme ve tespit HMGB1 artış olduğunu göstermiştir. Son zamanlarda, HMGB1 insan hücrelerinde TFO yönelik ICLs ilişkili olan ve bu lezyonların olan alım NER protein, DA 16 bağlıdır olduğunu bulduk. DNA negatif süper NER 25 DNA lezyonları randımanlı bir şekilde uzaklaştırılmasını teşvik ettiği gösterilmiştir, ve HMGB1 TFO yönelik ICL içeren ÜLR&#39;lerde tercihen negatif süper indükler bulmuşlardırBir NER ko-faktör olarak HMGB1 potansiyel rolü (ler) daha iyi anlaşılmasını sağlayan (non-hasarlı plazmidler yüzeylere göre) orta yüzeyler 16. ICLs işleme tamamen insan hücrelerinde anlaşılmamıştır; Bu nedenle, burada tarif edilen moleküler araçlar göre teknikler ve gelişmiş deneyler da kanser kemoterapi rejimleri etkinliğini arttırmak için kullanılabilir farmakolojik hedefler olarak hizmet verebilir ICL onarımında yer alan ilave edilen proteinlerin tanımlanması için yol açabilir. Burada, etkili bir yaklaşım tartışılmıştır agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon ile plazmid DNA TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini değerlendirmek. Bundan başka, TFO-yönlendirilmiş ICLs içeren plasmidler kullanılarak teknikler tarif edilmiştir Chip tahlilleri kullanarak hücresel bir çerçevede ICL hasarlı plazmidler ile HMGB1 ilişkisini belirlemek için. Ayrıca, bir uyduruk bir yöntem th tarafından tanıtıldı topolojik değişiklikleri incelemek içinözellikle insan hücre lizatlarında ICL hasarlı plazmid yüzeylerde e mimari proteini HMGB1, iki boyutlu agaroz jel elektroforez ile sarılma tahlilleri gerçekleştirilerek tespit edilmiştir. tarif edilen teknikler, insan hücrelerinde plazmid hedefli DNA hasarının işleme DNA tamiri ve mimari proteinlerin katılımı anlaşılmasını ilerletmek için de kullanılabilir. Bu plazmid DNA, ve daha sonra plazmid çip ve sırasıyla, DNA topolojisi değiştirebilir lezyonlar ile ilişkilendirmek proteinler ve proteinleri belirlemek için deneyleri sarılma ilgili TFO-yönelimli site özel psoralen ICLs oluşumu için ayrıntılı protokoller tarif eder. Bu deneyler, diğer DNA hasar verici maddeler, TFOlar, plazmid alt tabakalar ve ilgi memeli hücre hatları ile gerçekleştirmek için modifiye edilebilir. Aslında, en azından bir olası benzersiz ve yüksek afiniteli TFO-bağlama bölgesi, insan genomunda 26 her açıklamalı geni içinde olduğunu göstermiştir. NasılBiz Mukherjee ve Vasquez 2016, 16 kullanılan gibi bir zamanda, netlik sağlamak için, insan U2OS hücrelerinde spesifik mutasyon haberci plazmid (pSupFG1) belirli bir psoralen-konjuge TFO (pAG30) kullanımı için bu teknikleri tarif.

<table><tbody><tr><td>5&#039;HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>Custom order</td><td>HPLC (or gel) purified</td></tr><tr><td>Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit</td><td>Cell signaling Inc.</td><td>9003</td><td>Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>HMGB1 antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel and PCR cleanup kit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine-diphosphate salt</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>For two-dimensional agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>GenePORTER transfection reagent</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray long wave ultraviolet lamp</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>UVA lamp</td></tr><tr><td>EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>Water bath sonicator</td></tr><tr><td>Mylar filter</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80112939</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD</td><td>XRS+ system</td><td>DNA imaging system</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Used for crosslinking&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Cell culture media</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Bromocresol green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>DNA loading dye</td></tr><tr><td>Siliconized tubes</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>Low retention microfuge tube</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td>Photometer</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>UVA dose measurement</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human U2OS osteosarcoma</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Cultured according to supplier&amp;rsquo;s recommendation</td></tr><tr><td>Human cervical adenocarcinoma HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Cultured according to supplier&amp;rsquo;s recommendation</td></tr><tr><td>Proximal forward primer</td><td>5&amp;prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proximal reverse primer</td><td>5&amp;prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distal forward primer</td><td>5&amp;prime;-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distal reverse primer</td><td>5&amp;prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tools to study the role of architectural protein hmgb1 in the processing of helix distorting, site-specific dna interstrand crosslinks

Yüksek mobilite grubu kutusu 1 (HMGB1) proteini, transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı gibi genomunda çok önemli fonksiyonları, düzenlenmesinde görev olmayan bir histon mimari proteindir. HMGB1 standart B-DNA&#39;ya daha yüksek afinite ile yapısal olarak bozuk DNA&#39;ya bağlanır. Örneğin, biz HMGB1 DNA sarmalının bozulmalarına neden kovalent DNA iki ipliklerini bağlamak çapraz bağlantılar (ICLs), zincirler arası ve bırakılırsa unrepaired hücre ölümüne neden olabilir bağlanan bulundu. Bağlı sitotoksik potansiyel birçok ICL-uyarıcı maddeler, şu anda klinik olarak kemoterapötik maddeler olarak kullanılmaktadır. ICL oluşturucu maddeler belli baz dizilerine (örneğin, &#39;-TA-3 5&#39;psoralen için tercih edilen çapraz site) için tercihleri gösterirken, büyük ölçüde gelişigüzel bir şekilde DNA hasarına neden. Ancak, kovalent olarak dizi-spesifik DNA&#39;ya bağlanan bir üçlü oluşturan oligonükleotid (TFO), ICL-indükleme maddesinin birleştirilmesi suretiyleşekilde, hedef DNA hasarı elde edilebilir. Burada, bir araç olarak kullanmak için bir mutasyon raportör plasmid üzerinde bir site-spesifik ICL oluşturmak için kovalent 8-Trimethylpsoralen (HMT) psoralen 5 &#39;Bir 4&#39;-hidroksimetil-4,5&#39; ucuna üzerine konjuge edilmiş bir TFO kullanımı insan hücrelerinde HMGB1 karmaşık DNA lezyonlarının mimari değişiklik, işleme ve onarım incelemek için. Biz deneysel teknikler muhabiri plazmidler üzerinde TFO yönettiği ICLs hazırlamak ve kromatin immünopresipitasyon deneyleri kullanılarak bir hücresel bağlamda TFO yönettiği ICLs ile HMGB1 ilişkisini sorgulamak için açıklar. Buna ek olarak, HMGB1 ile psoralen çapraz bağlı plazmid üzerinde kişiye süpersarmal dönüş miktarı ölçülerek hasarlı DNA spesifik mimari modifikasyonu değerlendirmek için, DNA sarılma analizler açıklanmaktadır. Bu teknikler, TFO-yönlendirilmiş ICLs veya ilgi duyulan herhangi bir hücre hattı için diğer hedef DNA hasarının işlem ve onarımında yer alan diğer proteinler rollerini incelemek için kullanılabilir.

TFO-yönlendirilmiş ICL&#39;in oluşumu insan hücrelerinde ICL işleme mimari proteinlerin rolleri sorgulamak için kullanılan plazmid bazlı deneyler için önemlidir. agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini belirlemek için, basit bir yöntemdir. TFO-yönlendirilmiş ICLs barındıran plasmidleri un çapraz bağlanmış kontrol plazmid (Şekil 1A, şerit 2) ile karşılaştırıldığında agaroz jel matrisi (...

Watch this Scientific Journal Video about Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks at JoVE.com

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

tools-to-study-role-architectural-protein-hmgb1-processing-helix

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K Görüntüleme.  The University of Texas at Austin. Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein. 

Video: Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Genetik

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Biyoloji

Her Yerde Bulunan, SUMOile Edilmiş ve ADP-Ribosile Edilmiş DNA-Protein Çapraz Bağlarının Ölçülmesi

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Yazar Spotlight: DNA Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Biyokimya

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPA Yolu Büyümesi ile Gözlenen CMG Aracılı DNA Çözülmesi

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tek Moleküllü Görselleştirme Yoluyla Ökaryotik DNA Replikasyonunun Dinamiklerini Çözme

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Capturing Common Fragile Site Breaks by Native &#947;H2A.X ChIP

Replication stress induced by exposure to extrinsic agents can lead to DNA breaks at common fragile sites, which are regions in the genome known to be prone to structural instability. The &#947;H2A.X chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay serves as a powerful tool in genotoxicity studies, as &#947;H2A.X phosphorylation is a well-established marker for DNA double-strand breaks. Traditional &#947;H2A.X ChIP assays, however, are often labor-intensive and involve multiple, time-consuming steps. In this study, we present a simplified yet effective method that combines subcellular fractionation with native ChIP to isolate &#947;H2A.X-associated complexes. This approach is particularly suitable for analyzing &#947;H2A.X-chromatin interactions with enhanced specificity and efficiency. Using subcellular fractionation, chromatin-unbound materials are effectively removed, resulting in a purified chromatin fraction. Subsequent micrococcal nuclease (MNase) digestion under mild conditions allows chromatin fragmentation while preserving physiological interactions between &#947;H2A.X and its associated protein complexes. This preservation is essential for studying native interaction partners involved in DNA damage response pathways. This optimized native ChIP protocol substantially reduces the time and labor associated with conventional &#947;H2A.X ChIP assays. The streamlined procedure not only simplifies the workflow but also yields highly reproducible results, making it particularly advantageous in settings where high-throughput processing of multiple samples is required. This method has broad applicability in studies focused on genome stability, DNA repair, and chromatin biology, where accurate and efficient detection of DNA damage sites is critical. By employing optimized protocols and streamlined steps, this method enables the detection of DNA damage at fragile sites with improved sensitivity and minimal sample handling, making it a valuable tool for studies on genome stability and DNA damage response.

We present a rapid and efficient method to detect common fragile site breaks through native &#947;H2A.X chromatin immunoprecipitation (ChIP). This approach significantly reduces both the time and labor associated with traditional &#947;H2A.X ChIP assays while maintaining high reproducibility and reliability of results.

Doğal γH2A ile yaygın kırılgan bölge kırılmalarının yakalanması. X ChIP

Replication stress induced by exposure to extrinsic agents can lead to DNA breaks at common fragile sites, which are regions in the genome known to be ...

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Doğal γH2A ile yaygın kırılgan bölge kırılmalarının yakalanması. X ChIP