Name: colorimetric detection of bacteria using litmus test
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test at JoVE.com

The funding for this research project was provided by the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) via a Discovery Grant to YL.

Reaktifler ve Tamponlar hazırlanması 1. <ol><li> 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), <ol><li> 2 L&#39;lik bir beher içinde, deiyonize damıtılmış 800 ml su ile 186.1 gr EDTA ekleyin (GKD 2 O). NaOH peletleri ile 8.0 çözeltinin pH&#39;ının ayarlanması. 1.0 L&#39;lik son bir hacme O GKD 2 ekleyin ve 4 ° C&#39;de otoklav ve mağaza bir otoklav cam şişe çözüm aktarın. </li></ol></li><li> 10 x Tris-borat EDTA (10x TBE) <ol><li> 4 L&#39;lik bir plastik kabı içinde, tüm bileşenler kadar bir karıştırma çubuğu kullanılarak 4 L Karışım bir son hacme 432 g Tris-bazı, 200 g borik asit, 0.5 M EDTA (pH 8.0) ve GKD 2 O 80 ml ​​ilave çözündürülür. 4 ° C&#39;de otoklav ve mağaza 1 L cam şişe çözüm aktarın. </li></ol></li><li> % 10 denatüre edici poliakrilamid Hazır <ol><li> F kadar çözeltisi ve GKD 2 A: (1 29), 4 L&#39;lik bir plastik kap olarak, 1681,7 g üre 400 ml 10x TBE, 40% akrilamid / bisakrilamid 1 L eklemeNominal hacmi üre çözünene kadar bir karıştırma çubuğu kullanılarak 4 L bir karışımıdır. 4 ° C &#39;de 1 L&#39;lik amber cam şişe ve saklamak için bir çözüm aktarın. </li></ol></li><li> Yükleme Tamponu 2x Jel (2x GLB) <ol><li> 200 ml&#39;lik bir cam kabın içinde, 44 g üre, 8 g sakroz, 10 mg bromofenol mavi, 10 mg iksilen siyanol FF,% 10 sodyum dodesil sülfat 400 ul ve 10 x TBE ve 4 ml. 40 ml&#39;lik bir son hacme O GKD 2 ekleyin ve bir manyetik karıştırma çubuğu ile karıştırılarak 50 ° C&#39;de, hafif ısıtma ile bileşenleri çözülür. 4 ° C&#39;de Aktarım 1 mi, 1.5 ml mikrofüj tüplerine kısım saklayın. Not: Ön kullanımı herhangi bir katı yeniden çözünmesi için 90 ° C&#39;de kısa bir ısıtma gerektirir. </li></ol></li><li> 1 M Tris-hidroklorür (Tris-HCl) (pH 7.5) <ol><li> Bir cam şişe içerisinde, Tris-bazın 12.1 g ve GKD 2 O 70 ml ilave edilir ve katı madde çözülene kadar karıştırın. 1 M hidroklorik asit (HCI) ile pH&#39;ı 7.5&#39;e ayarlayın. 100 mi, otoklav ve taştan bir son hacme GKD 2 O eklemere 4 ° C&#39;de </li></ol></li><li> 5 M sodyum klorür (NaCI) <ol><li> Bir cam şişe içerisinde, GKD 2 O 150 ml NaCI 58.4 g çözülür GKD 2 O. ile 200 ml ses seviyesini ayarlamak 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> DNA, Seyreltme Tampon maddesi <ol><li> bir cam şişe içinde, 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 8.0 5 M NaCl mi ve 0.5 M EDTA, 0.4 mi (pH 8.0) içinde 2.0 ml karıştırılır. GKD 2 O, 4 ° C&#39;de otoklav ve mağaza ile 200 ml ses seviyesini ayarlayın. </li></ol></li><li> 1 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) (pH 7,4) <ol><li> Bir cam şişe içerisinde, GKD 2 O 80 ml ​​HEPES, 2.38 g çözülür 5 N NaOH kullanılarak 7.4 pH ayarlamak ve 100 ml lik bir son hacme GKD 2 O ekleyin. </li></ol></li><li> 1 M magnezyum klorür (MgCI2) <ol><li> Bir cam şişe içerisinde, MgCl2 -6H 2 O 2.03 g ekleme ve GKD 2 O ile 100 ml&#39;ye ses getirmek </li></ol></li><li> Reaksiyon Tamponu (RB) <ol><li&gt; 50 ml konik bir tüp içinde, 1 M HEPES (pH 7.4), 5 M NaCI, 1.5 mL, 1 M MgCl2, 0.75 mi, ve Tween-20 5 ul 50 ul ekle. 50 ml&#39;lik bir son hacme O GKD 2 ekleyin. çözelti karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C de, bir şırınga veren filtre (0.22 um) ve deposunu kullanan bir konik tüp içine filtre. </li></ol></li><li> Bağlama Tamponu (BB) <ol><li> 50 ml konik bir tüp içinde, bir son hacim için O GKD 2; 1 M Tris-HCI (pH 7.5), 500 ul, NaCI 8.8 g, MgCl2, 1 M, 50 ul, Tween 20 5 ul 50 ml. çözelti karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C de, bir şırınga veren filtre (0.22 um) ve deposunu kullanan bir konik tüp içine filtre. </li></ol></li><li> Substrat solüsyonu (SS) <ol><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde, NaCI 5.8 g, 1 M 3 mL MgCl2, 1.5 g üre ve GKD 2 O 40 ml ilave 10 mM HCI kullanılarak 5,0 çözeltinin pH&#39;ının ayarlanması. Çözelti tamponlu olduğundan, HCI kullanılarak pH ayarlamakdikkatle küçük HCI alikotları eklenmesi ile. 50 ml&#39;lik bir son hacme O GKD 2 ekleyin. </li><li> çözelti karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C de, bir şırınga veren filtre (0.22 um) ve deposunu kullanan bir konik tüp içine filtre. </li></ol></li><li> Luria Bertani (LB) Broth <ol><li> Beher, GKD 2 O 1 L 20.0 g LB tozu çözmek 4 ° C&#39;de bir cam şişe, otoklav ve saklamak için aktarın. </li></ol></li><li> % 1.5 LB agar <ol><li> 250 ml&#39;lik bir şişe içinde, 1.5 g agar ve LB suyu 100 ml. 4 ° C&#39;de otoklav ve saklayın. </li></ol></li><li> agar Tabaklar <ol><li> Bir mikrodalga LB agar tekrar çözündürülmesi ve çözeltiye ~ 50 ° C soğutulur. Petri kaplarına solüsyonu dökün ~ 5 plakaları yapmak ve onları katılaşmaya sağlar. </li></ol></li></ol> 2. sentezi ve E. saflaştırma coli- duyarlı DNAzim EC1 <ol><li> Şablon aracılığı Enzimatik Ligasyonu ile EC1 sentezi <ol><li> comm arındırınticari olarak uygundur, sentezlenmiş oligonükleotidler BS1, DE1 ve T1,% 10, standart protokollere göre poliakrilamid jel elektroforezi (dPAGE) denatüre edici ile (Tablo 1 &#39;de verilen sekansları). </li><li> BS1, DE1 ve T1 100 uM stok hazırlayın. kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 1.5 ml mikrofüj tüpüne, enzim ile ilgili olarak (500 mM Tris-HCI (pH 7.6), 100 mM MgCl2 sağladığı GKD 2 O 38.5 ul, DE1 5 ul ve 10 x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu 5 ul 50 mM ditiotreitol (DTT), 1.0 mM spermidin). </li><li> adenosin trifosfat (ATP) (100 mM) 1 ul ekle. T4 polinükleotid kinaz 5 birim (10 U / ul) eklenir. reaksiyon karışımına dikkatli bir pipetleme karıştırın. </li><li> 30 dakika için 37 ° C &#39;de reaksiyon inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 90 ° C&#39;ye kadar ısıtılarak, reaksiyonun sönmesi. </li><li> GKD 2 O 118 ul, BS1 5 ul ve T1 5 ul ekleyin. 2 mi, 90 ° C tepkime ısısın, ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar soğutulur. </li><li> Enzim, tedarikçi tarafından sağlanan 10 x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu 20 ul ekle (400 mM Tris-HCI (pH 7.8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). T4 DNA ligazı, 10 birim (5 U / ul) ilave edilir ve dikkatli bir şekilde pipetle karıştırılır. </li><li> 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 3 M sodyum asetat (NaOAc) (pH 5.2) 20 ul soğuk% 100 etanol 500 ul ekle. Vorteks ile çözüm karıştırın ve 30 dakika için -20 ° C dondurucu içinde bir tüp yerleştirmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de mikrofüj santrifüj. Dikkatle pipetleme süpernatant kaldırmak. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20,000 x g hızında tekrar soğuk% 70 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın. Bir kez daha süpernatant kaldırmak ve 10 dakika süre ile, vakum altında pelet kurutulur. </li><li> GKD 2 O 15 ul DNA tekrar ve daha sonra 2x GLB 15 ul ekleyin. </li><li> 90 ° C&#39;ye kadar kuvvetli bir şekilde karıştırın ve ıslak sertleştirilmesi için2 dak. Aşağıda tarif edildiği gibi,% 10 dPAGE tam uzunlukta DNA saflaştırılır. </li></ol></li><li> % 10 dPAGE Kurma <ol><li> Temiz iki cam levha (bir tam plaka ve bir çontuklu), iki 0.75 mm kalınlığında aralama ve 12 kuyu tarak. İki her iki tarafta spacers ve üstüne çentikli plaka ile düz bir yüzeye bir cam plaka yatıyordu. Birlikte tedarikçi tarafından sağlanan dört klipler kullanarak iki tabak Clip. </li><li> 150 ml&#39;lik bir plastik kabı içinde,% 10 dPAGE 40 ml, tetrametiletilendiamin 40 ul (TEMED) ve% 10 amonyum persülfat (APS), 400 ul dökün. bileşenleri karıştırın ve yavaş yavaş plakalar arasına çözüm dökün. </li><li> Tarak yerleştirin ve sonra jel üzerinde 10 dakika polimerize izin verir. Jel polimerize edildikten sonra, yavaş yavaş tarak kaldırmak ve GKD 2 O. ile kuyu yıkayın </li><li> jel elektroforezi aparat üzerine plakaları monte edin. aşırı ısınmayı önlemek için üretilen ısıyı dağıtmak için bir metal plaka kullanın. </li><li> Üst ve alt bölmelere üzerine 1x TBE dökünve kuyular iyi tampon batık emin olun. Bir pipet veya şırınga kullanarak 1x TBE ile kuyu yıkayın. </li><li> yükleme örnekleri önce 15 dakika için 35 mA&#39;da için cihaz ve önceden çalıştırılmış ayarlayın. </li></ol></li><li> % 10 dPAGE den Bağlanmış EC1 elüsyon <ol><li> Adım 2.2.6 ardından, alt boya (Bromophenol mavi) kadar 35 mA jel çalıştırmak cam plakanın alt ulaşır. Bu, yaklaşık 1.5 saat sürer. Gücü kapatın ve cihazdan plakaları çıkarın. </li><li> kağıt havlu birkaç yaprak tabak Lay ve dikkatle cam plakalar gelen aralayıcılar kaldırın. Dikkatli bir şekilde üst cam plaka kaldırmak ve plastik wrap ile jel sarın. </li><li> ikinci cam plakayı kaldırın ve tekrar plastik wrap ile karşılamak için jel çevirin. plastik wrap kırışıklıkları önlemek için özen gösterin. </li><li> 4 farklı DNA bantları (Tam bağlanan EC1, DE1, BS1 ve T1) üretecek UV gölgeleme (260 nm) kullanarak bağlandı ürünü gözünüzde canlandırın. </li><li&gt; Tüketim 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp steril bir jilet ve transferi ile üst bant (EC1). ince bir hamur haline dönene kadar steril bir pipet (200 ul uç boyutu) ile jel Crush. DNA elüsyon tamponu 550 ul ekle gömülü fluorofor korumak için alüminyum folyo ile tüp kapağı ve 15 dakika boyunca çalkalayın. </li><li> 5 dakika boyunca 20.000 xg&#39;de jel çözüm Santrifüj ve dikkatli bir 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp süpernatant 400 ul aktarın. pipetleme sırasında jel parçaları çekilmesi kaçının. </li><li> transfer süpernatan ile mikrofüj tüpe 40 3 M NaOAc (pH 5.2) içinde ul soğuk% 100 etanol içinde 1.0 ml. Vorteks ile çözüm karıştırın ve 30 dakika için -20 ° C dondurucu içinde bir tüp yerleştirmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de mikrofüj santrifüj. Dikkatle pipetleme süpernatant kaldırmak. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20,000 x g hızında tekrar soğuk% 70 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın. Bir kez daha, kaldırmakSüpernatan 10 dakika için vakum altında pelet kurutulur. </li><li> 260 nm&#39;de UV absorbansı ölçerek EC1 konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 uM stok yapmak ve kullanılana kadar -20 ° C&#39;de örnek saklayın. </li></ol></li></ol> DNA üreazın 3. Konjugasyon <ol><li> Sukinimidil 4- (N-maleimidometil) sikloheksan-1-karboksilat (SMCC), hisse senedi hazırlanması <ol><li> DMSO 676 ul 1 mg SMCC çözülür. kullanılana kadar buz üzerinde girdap ve yer. </li></ol></li><li> Üreaz Stokta hazırlanması <ol><li> 1 x PBS (Mg + 2 veya Ca + 2), 1 ml 1 mg üreaz çözülür. Buz üzerinde kullanıma kadar yerleştirin. Not: Kristalize üreaz çözünmesi yavaştır ve yumuşak karıştırma denatürasyon önlemek için gereklidir. </li></ol></li><li> Üreaz-DNA sentezi (UrDNA) <ol><li> 2.5 mi mikrofüj tüpüne 100 uM LD1 10 ul ekle. GKD 2 O 140 ul 10x PBS 40 ul ve vorteks ekleyin. </li><li> SMCC s 80.5 ul ekleyintak, bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak DMSO, girdap ve kısaca santrifüj 159.5 ul. </li><li> 60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. mikrofuge&#39;ye kapağın altında yoğuşmayı önlemek. </li><li> 1x PBS 200 ul 3 M NaOAc (pH 5.2), 60 ul soğuk% 100 etanol içinde 1.5 ml. Vorteks ile çözüm karıştırın ve 30 dakika boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin çözeltisi. Süpernatantı ve vakum altında pelet kurulayın. aşırı kurumayı önlemek. </li><li> Kurutulmuş pelet, üreaz stokunun 400 ul, 5 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Önceden yıkanmış 100K MWCO santrifüj filtre kolonuna ham konjügat 200 ul aktarın. 5 dakika boyunca 14.000 x g&#39;de sütun santrifüjleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 14.000 x g&#39;de kolon ve santrifüj ham konjügat kalan 200 ul aktarın. sütunu kaldırmak ve yeni bir 2.0 ml mikrofuge&#39;de tüp ( &quot;toplama tüpüne&quot;) olarak baş aşağı yerleştirin. </li><li> Santrifüjuge 2 dakika süreyle 1000 xg&#39;de (ters sütun ile) toplama tüpü. toplama tüpünü çıkarın ve konjugatlarının ek kurtarma için membran yıkamak için santrifüj sütuna 1x PBS 30 ul ekleyin. </li><li> Bir kez daha sütunu ters ve geri toplama tüpünün içine koyun. 2 dakika süreyle 1000 xg&#39;de (ters sütun ile) toplama tüpü santrifüj. Çıkarın ve sütun atmayın. </li><li> kullanılana kadar 4 ° C &#39;de UrDNA saklayın. </li></ol></li></ol> Manyetik boncuklar üzerine EC1 ve UrDNA 4. Montaj <ol><li> gibi manyetik boncuk (MB) stok karıştırın ve 1.5 ml mikrofüj tüpe MB süspansiyon 100 ul aktarın. MB izole bir manyetik raf tutucu mikrofuge&#39;ye tüpü yerleştirin. </li><li> pipetle ile süpernatantı ve tüp tampon (BB) bağlayıcı 150 ul ekleyin. tutucudan tüpü çıkarın ve dikkatlice homojen bir çözüm MB tekrar süspansiyon tüp dokunun. t süspansiyon sıçramasını önlemektüp ya da kap op. Böyle bir durumda, kısaca geri süspansiyona kalıntı dönmeye bir tezgah üstü santrifüj kullanın. </li><li> Adımı yineleyin 4.2 iki kez daha. </li><li> Bu süspansiyona 10 uM EC1 10 ul ekle. Dikkatle tüp dokunarak karıştırın. </li><li> Hafif 30 dakika boyunca çalkalayarak çözelti inkübe edin. MB çökmesini önlemek için tüpü her 2-3 dakikada bir dokunun. </li><li> MB izole ve pipetleme süpernatant kaldırmak için geri manyetik raf mikrofuge&#39;ye tüpü yerleştirin. (Adım 4.2 de tarif edildiği gibi) BB 150 ul MB üç kez yıkayın. </li><li> Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, BB 150 ul bir toplam MB askıya. Bu çözeltiye, UrDNA 15 ul ilave edin ve 2 dakika boyunca 45 ° C&#39;ye kadar çözelti ısıtılır. Solüsyon oda sıcaklığına kadar soğutulur ve 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> MB izole ve pipetleme süpernatant kaldırmak için geri manyetik raf mikrofuge&#39;ye tüpü yerleştirin. </li><li> Reaksiyon tampon maddesi (RB), 100 ul ekle. t kaldırO manyetik raf tüp mikrofuge&#39;ye ve dikkatle MB tekrar süspansiyon. </li><li> adım 4.9 tekrarlayarak MB üç kez yıkayın. NOT: yıkanmış süpernatant hızla Melezleşmemiş UrDNA hala mevcut olup olmadığını bir yanlış pozitif sinyal neden olabilir, hangi belirlemek için test edilebilir. Test yıkama çözeltisine kırmızı 50 mM üre 10 ul ve% 0.04 fenol 10 ul ekleyerek yapılabilir. yıkama çözeltisi bir renk değişimine neden olmaz kadar MB yıkamak devam edin. 100 ul süspansiyon kullanilana kadar 4 ° C&#39;de saklanır. </li></ol> Bakteriyel hücreler 20 5. hazırlanması <ol><li> Kültürleme E. Stoklar gelen coli <ol><li> Plaka E. E. coli K12, bir alev altında veya biyolojik bir güvenlik kabini, bir gliserol stokundan LB agar kaplan üzerine (MG1655). </li><li> Steril bir pipet ucu kullanarak, yavaşça LB agar delinmesiyle önlemek için gliserol stok ve hafifçe çizgi bir agar plaka yüzeyi dokunun. </li><li> Kesikli invertPlaka ve 14 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 3 haftalık bir süre için 4 ° C sıcaklıkta Parafilm ile plaka ve mağaza kapatın. </li></ol></li><li> Kültürleme E. Hücre Sayımı için coli <ol><li> steril 14 ml kültür tüpünde, LB suyu 2 ml dağıtın. </li><li> Steril bir pipet ucu kullanarak, adım 5.1 hazırlanan çizgili agar plakasından tek bir koloni almak ve kültür tüpüne aktarın. </li><li> 37 ° C &#39;de kültür inkübe ve 14 saat boyunca 230 rpm&#39;de çalkalanır. </li><li> Seri olarak 10-misli aralıklarla bakteri kültürü seyreltin. </li><li> Her bir seyreltilmiş numune için eşit, ayrı LB agar plakaları üzerinde beş 100 ul alikotları plaka. plakalar ters çevirin ve 14 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir seyreltme ortalama hücre konsantrasyonu elde etmek üzere her numune hücreleri sayın. NOT: 10 7 hücreleri genellikle E. için bir referans turnusol testi kurmak için kullanılan E. Bu seviyeye kadar coli E. coli hızlı bir renk chan tetikleyebilirge. Sonuçlar bölümünde tartışıldığı gibi Ancak, düzgün idam turnusol testi gibi düşük 500 hücreleri tespit edebilir. </li></ol></li><li> E. hazırlama Test coli hücreleri <ol><li> arzu edilen bir hücre süspansiyonu için, transfer 1.5 ml mikrofüj tüpüne kültürlendi, 1 mL stok. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Hücre topağı, reaksiyon tampon maddesi 10 ul ilave edin ve tekrar süspansiyon hücreleri. 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu sonikasyon. 5 dakika için bir buz kutusu hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 5 dakika daha hücre süspansiyonu sonikasyon. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 13,000 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. Test için supernatant (10 ul) kullanır. </li></ol></li></ol> 6. Litmus Testi <ol><li> 1.5 ml mikrofüj tüpüne, mikrofüj tüpüne reaksiyon tampon maddesi (RB) 100 ul ilave edildi ve vorteks yoluyla tüp ön yıkama vetampon atarak. </li><li> Aktarım yıkanmış mikrofüj tüpe monte EC1 (protokol 4) 15 ul. </li><li> Bir manyetik rafa mikrofuge&#39;ye tüp yerleştirerek manyetik boncuk yıkayın. pipetleme süpernatantı. , Raftan mikrofuge&#39;ye tüpünü çıkarın RB 100 ul ekleyin ve dikkatlice manyetik boncuklar tekrar süspansiyon. </li><li> adım 6.3 yineleyerek MB iki kez yıkayın. </li><li> , Manyetik rafa geri mikrofuge&#39;ye tüpü yerleştirin süpernatant kaldırmak ve 10 ul E. ekleyin E. coli örnek adım 5.3 hazırlanan. </li><li> yavaşça mikrofuge&#39;de tüp dokunarak dikkatlice örnek ve manyetik boncuk karıştırın. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyon inkübe edin. </li><li> Reaksiyona, GKD 2 O 90 ul ekleyin ve bir manyetik raf üzerine mikrofuge&#39;ye tüp yerleştirin. </li><li> Sonra manyetik ayırma yaklaşık 3 dakika, dikkatle 0.5 ml mikrofuge&#39;de tüp süpernatant 85 ul aktarın. yavaş yavaş süpernatant geri çekinherhangi bir manyetik boncuk toplama kaçının. </li><li> Yukarıdaki mikrofüj tüpe% 0,04 fenol kırmızısı 15 ul ve alt-tabaka çözeltisi 100 ul ilave edin. </li><li> renk değişikliği kaydetmek için belirli zaman aralıklarında bir fotoğraf çekmek. Not: pH değişikliği bir mikroelektrot içeren bir pH metre kullanılarak izlenebilir. Başlangıç ​​pH yaklaşık 5,2-5,5 olmalıdır (çözüm sarı renkte). Aksi takdirde, çözelti, 1 mM asetat tampon pH 5.0) ilavesiyle ayarlanabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries.">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li><li>Newman, J. D., Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Home+blood+glucose+biosensors:+a+commercial+perspective.">Home blood glucose biosensors: a commercial perspective.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).</li><li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors:+sense+and+sensibility.">Biosensors: sense and sensibility.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).</li><li>Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Bacterial+Detection+by+DNAzymes+into+a+Litmus+Test.">Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).</li><li>Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+DNAzyme+probes+as+bacterial+indicators.">Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li><li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA.">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligand+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li><li>Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+catalytic+DNAs.">Making catalytic DNAs.</a> Science. 290, 2095-2096 (2000).</li><li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+nucleic+acid+sensors.">Functional nucleic acid sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li><li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors.">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li><li>Li, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+selective+catalytic+DNA+biosensor+for+lead+ions.">A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).</li><li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles.">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li><li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence.">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity.">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li><li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides.">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li><li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+'MgZ'+based+on+a+non-classic+allosteric+design.">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224 (2007).</li><li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets.">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li><li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection.">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li><li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes.">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961 (2012).</li><li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen.">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe.">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li><li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoelectric+point+of+crystalline+urease.">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li><li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=70+Years+of+crystalline+urease:+What+have+we+learned.">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li><li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.,+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk.">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li><li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157:H7+in+ground+beef.">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li><li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157:H7+in+dairy+wastewater+wetlands.">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li><li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157:H7+using+Russell's+viper+venom.">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li><li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms.">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li><li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food.">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi bir turnusol test etmek için bir bakteri duyarlı DNAzıme RNA bölünme etkinliğinin etki yaptı, üreaz ve manyetik ayırma kullanımı ile mümkün olmaktadır. Bakteriyel tespiti için modifiye test edeceği gösteri rağmen E ile yapılan E. coli bağımlı RNA-yaran DNAzim, 5,19,20 tasarım genellikle herhangi RNA-yaran DNAzıme için uzatılabilir. Yeni hedefler için rasgele dizi havuzlarından yeni RNA-yarma DNAzımler izole etmek farklı analitler ve çeşitli metodolojileri için RNA-yaran DNAzimler büyük kullanılabilirliği göz önüne alındığında, biz modifiye turnusol testi platformu ilgi çeşitli hedeflerin tespiti uzatılabilir bekliyoruz . E. için turnusol testi Raporlama reaksiyon süresi sırasıyla 1 ve 2 saat olmak üzere ayarlandığı zaman coli algılama 5,000 ve 500 hücreleri tespit edebilir. Popüler polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vesandviç immün testi enzim-bağlı (ELISA) yöntemleri yaklaşık 10 4 -10 5 E. algılama sınırlarını elde edebilirsiniz Benzer test zamanlarında coli hücreleri. 25,26 Böylece, bakteriyel bir turnusol testi karşılaştırılabilir algılama hassasiyetini sunar. Bakteriyel turnusol testi yürütmek kolay ve canlı renk değişiklikleri üretebilir rağmen, çeşitli faktörler önemli ölçüde test sonuçlarını etkileyebilir. İlk olarak, üreaz kalitesi çok önemlidir. Farklı kaynaklardan gelen üreaz kullanılan ve test sonuçları önemli ölçüde değişebilir bulduk. Biz Malzemeler bölümünde belirtilen kaynaktan üreaz kullanılması tavsiye edilir. DNAzim / üreaz / manyetik boncuk montaj özel dikkat gerektirir. melezleşmemiş UrDNA kaldırmak için manyetik boncuk Kapsamlı yıkama yanlış pozitif sonuçların önlenmesi için gereklidir. Bakım ayrıca l iç yüzeyinde kalan manyetik boncuk birikmesini önlemek için alınması gerekengörmek zor olabilir mikrofuge&#39;de tüp, kimliği. Bir kez orada, manyetik boncuk artık manyetik ayırma tabi tutulur ve böylece muhabir reaksiyonunda yalancı pozitif sinyaller yol açabilir bazı melezleşmemiş UrDNA taşıyabiliyor. Manyetik ayırma adımı sırasında daha uzun bir süre, 10 dakika boyunca manyetik rafa mikrofüj tüpü terk bilmek de önemlidir. boncuk toplamak veya yıkama verimliliği azaltır ve partiden partiye tutarsızlığı tanıtmak olabilir mikrofuge&#39;ye tüp, yapışabilir. Yıkama çözeltisi içinde% 0.01 Tween-20 dahil edilmesi partiden partiye tutarlılık artırabilir ve uygulanmalıdır. Manyetik kurecikler manyetik boncuklar üzerine DNAzim-üreaz konjugatlarının monte çapa olarak kullanılan streptavidin ile kaplanmıştır. streptavidin ve üreaz Hem depolama sırasında denatüre edilebilir protein molekülleridir. Normal olarak 4 haftaya kadar 4 ° C de bir araya DNAzim-üreaz manyetik boncuk depolamakve daha tutarlı sonuçlar elde etmek için düzenli olarak taze toplu yapmak. Bakım ayrıca DNAzim aktivasyonunu takiben manyetik ayırma adımı (adım 6.9) manyetik boncuk alarak kaza önlemek için alınması gereken. Bizim deneyim, hücresel enkaz ve çözüm diğer partiküller manyetik ayırma verimliliği azaltabilir ve bu nedenle, bazı manyetik boncuk istemeden pipetleme sırasında alınabilir. Bu yanlış pozitif sonuçlara neden olur. uzun bir ayrılık süresi (örneğin 5-10 dk), pipet üzerinde bir basınç yavaş salınım süpernatant nazik çekilmesi izin verir ve manyetik ayırma ek bir tura yüzer tabi: Biz problemi hafifletmek için aşağıdaki önlemleri tavsiye . Son olarak, çok sayıda numune test edilir bir deney sırasında üreazın tarafından bildirici stok çözeltisi kaza kirlenmesini önlemek için önemlidir. u yüksek reaktif göz önüne alındığındaSerbest Bırakma, bu doğanın kirlenmesi yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir.

Bacterial pathogens are one of the major causes of global morbidity and mortality. Outbreaks from hospital-acquired infections, food-borne pathogens, and bacterial contaminants in the environment pose serious and on-going threats to public health and safety. To prevent these outbreaks, effective tools are needed that permit pathogen detection in a timely fashion under a variety of settings. Simple but still effective tests that are portable and cost-effective are greatly coveted, especially in regions that are susceptible to outbreaks but cannot afford expensive testing facilities.1-3 Although there exists a multitude of methods to detect bacteria, many of them are not suitable as screening or on-site testing tools because they require long test times, expensive instruments and complicated testing procedures. 
Colorimetric tests are particularly attractive for point-of-care or field applications as color changes can be easily detected by the naked eye. The litmus test for pH is simple, quick, and effective. Although it is a very old technology, it is still widely used today because of its simplicity and effectiveness. Surprisingly, this simple test had never been modified to achieve the detection of other analytes before we recently developed an approach of modifying this test for E. coli testing.4
The expanded litmus test for E. coli employs three additional components: an E. coli activated RNA-cleaving DNAzyme (EC1), 5 urease, and magnetic beads. DNAzymes refer to synthetic single-stranded DNA molecules with catalytic activity.6 They can be isolated from random-sequence DNA pools using in vitro selection.7,8 They are highly stable and can be produced cost-effectively using high-efficiency automated DNA synthesis.9 For these reasons, DNAzymes, particularly RNA-cleaving DNAzymes, have been widely examined for biosensing applications.6,10,11 RNA-cleaving DNAzyme sensors have been developed to detect metal ions,12-16 small molecules,17,18 bacterial pathogens5,19-21 and cancer cells.22 Given the great availability of target-induced RNA-cleaving DNAzymes, any assay that utilizes a DNAzyme can be potentially expanded to detect a diverse range of analytes.
Urease is chosen for its ability to hydrolyze urea into ammonia,23,24 resulting in a pH increase. Urease is also highly efficient, stable and amenable for conjugation to other biomolecules. Therefore, we postulated that a conjugate of an RNA-cleavage DNAzyme with urease would allow the use of litmus test for the detection of other targets.5
The action of the RNA-cleaving DNAzyme is relayed to urease-mediated increase of pH through the use of magnetic beads that are immobilized with the DNAzyme-urease conjugate. Because the activity of the DNAzyme under investigation is strictly dependent on E. coli, the presence of this bacterium in the test solution will result in the release of urease from the magnetic beads to the solution, which is then taken and used to hydrolyze urea in a reporter solution that contains a pH-sensitive dye. The final outcome of this procedure is a color change that can be conveniently reported by the dye or pH paper.

<table><tbody><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH) pellets</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xylenecyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% sodium dodecyl sulfate</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (II) hexahydrate</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine Triphospahte (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate trihydrate (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyleneethylenediamine (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% Ammonium persulfate (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 4-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0.04% Phenol red</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 polynucleotide kinase reaction buffer</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase reaction buffer</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase (5 U/&amp;#956;l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Broth</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucleotide kinase (10 U/&amp;#956;l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>392187</td><td></td></tr><tr><td>Glass plates</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm thick spacers</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>12-well comb</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>UV Lamp</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metal plate</td><td>CBS scientific</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>CBS scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO centrifugal filters</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Seperation Rack</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter (0.22 &amp;#956;m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>14 ml culture tube</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonic cleaner</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tube</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

colorimetric detection of bacteria using litmus test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

Bakteriyel test edeceği prensibi Şekil 1 &#39;de açıklanmıştır Test üç temel malzeme kullanır. Belirli bir bakteri, üreaz ve manyetik boncuklar ile aktive olan bir RNA klivaj DNAzim. DNAzim ilgi konusu bir bakterinin yüksek düzeyde spesifik tespit elde etmek için moleküler tanıma elemanı olarak kullanılır. Üreaz ve manyetik boncuk DNAzıme RNA klivaj aktivitesinin sinyal transdüksiyonunu elde etmek için kullanılır. Bu üreaz-DNAzim konjugatlarının ihtiva manyetik boncuk oluşturulmasını içerir. Hedef bakterinin varlığı, DNAzim parçalayarak kendi RNA bağlantı. Bu işlem, manyetik boncuklardan üreaz ayrışmasına neden olur. serbest üreaz kolay manyetik boncuk ayrılır ve üre ve pH&#39;a duyarlı bir boya içeren bir raportör çözeltisi içinde bir renk değişikliği üretmek için de kullanılabilir. Üreaz c tetikleyen pH artışı eşliğinde amonyak içine üre hidrolizBoyanın enk değişimi. Şekil 2 nerede EC1, E. bakteriyel bir turnusol testi sunuyor E. coli tepki gösteren RNA klivaj DNAzım, DNAzıme olarak kullanılmıştır, ve fenol kırmızısı, pH raporlama boya olarak kullanılmıştır. EC1 daha önce in vitro seçimi tekniği kullanılarak rasgele dizi DNA havuzu grubumuz ile izole edilmiştir. 5 Daha önceki çalışmalar EC1 E için son derece spesifik olduğu gösterilmiştir E. coli ve 5,19. Diğer bakteri karşı çok az aktivite sergiler EC1 E. bir protein molekülü ile aktive edilir olduğu bulunmuştur Bu protein belirteç kimliği deşifre edilmemiş olmakla birlikte coli., yüksek tanıma özgünlüğü bu proteinin E. özgü olduğunu göstermektedir E. coli. bildirici çözeltisi 5.5 bir başlangıç ​​pH değerine sahip ayarlanır. Bu pH&#39;da fenol kırmızı sarı bir renk sergiler. üreaz olarak, amonyak içine muhabiri solüsyonunun bazlık üre hidrolizKatkı artar. Bu san bir pembe rengin kademeli değişikliği ile yansıtılır. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi renk değişikliği derinliği, aşağıdaki iki parametrelere bağlıdır: E. sayısı DNAzim aktivasyon aşaması, üre hidroliz adımı için izin verilen süre kullanılan coli hücreleri. Daha E. coli hücreleri ilerleyici sarı-to-pembe renk geçişi E. gözlem yansıyan güçlü renk değişikliklere neden coli hücreleri seri artan 5 ile 10 x 5-7 (10-kat, her zaman artış). Diğer taraftan, üre hidrolizi için daha uzun bir zaman E. az sayıda tespiti için izin E. coli hücreleri (1 saat tepkimede 5000 hücreleri ve 2 saat tepkimede 500 hücre). Bakteriyel test edeceği pH değişikliği, aynı zamanda, bir el pH metre kullanılarak izlenebilir ve Örnek sonuçlar Şekil 3&#39;te gösterilmektedir. Was bulduğu 10 7 E. varlığı coli hücreleri 10 dakika içinde 3 adet pH kademeli artış ile sonuçlanmıştır. Bunun aksine, E. yokluğu coli hücreleri aynı ayarı altında saptanabilir pH değişiklikleri neden olmadı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54546/54546fig1.jpg" /> Şekil 1: Bakteriyel turnusol test tasarım ilkesi, ilgi konusu bir bakteriden, belirli bir belirteç ile bir RNA klivaj DNAzim (A) aktivasyonu.. belirteç mevcudiyetinde, RNA-yaran DNAzim çözeltisine manyetik boncuklardan etiketli üreaz salınmasına yol açar manyetik boncuk yarılır ilgili RNA bağı hareket. (B) üç adımlı deney prosedürü. Adım 1: DNAzim aktivasyonu, panel A, aşama 2&#39;de tarif edildiği gibi: Manyetik Ayırma - serbest üreaz manyetik boncuk ayrılır. Aşama 3: Üre hidroliz R12; serbest üreaz, bir üre ihtiva eden raportör çözeltisi içine ilave edilir. Üreaz bir pH-duyarlı boya ile rapor edilebilir pH değişikliği ile sonuçlanan, amonyak içine üre hidrolize. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54546/54546fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54546/54546fig2.jpg" /> Şekil 2: E. ile Turnusol testi E. coli E. kullanarak coli tepki gösteren DNAzim EC1. E. değişen numaraları ile Temsilcisi renk değiştiren sonuçlar Her bir test tüpüne, yukarıda verilen coli hücreleri. Fenol kırmızı pH&#39;a duyarlı bir boya olarak kullanılmıştır. E. olmadan bir test E. coli, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Daha E. coli hücreleri daha fazla üreaz moleküllerinin salgılanmasına neden bekleniyor, b eşliky güçlü rengi değişir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54546/54546fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54546/54546fig3.jpg" /> Şekil 3: pH metre kullanılarak pH artışı İzleme 10 7 E. neden pH değişikliği. coli hücreleri taşınabilir pH metre kullanılarak izlenmiştir. E. olmadan bir test E. coli, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. 10 7 E. varlığı Test çözeltisi içinde coli hücreleri 10 dakika içinde ~ 3 pH birimi tarafından bazlığını artırabilir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54546/54546fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> isim </td><td> Sesekans (5&#39;-3 &#39;) </td><td> Not </td></tr><tr><td> BS1 </td><td> BTTTT TTTTT TTTAC TCTTC CTAGC FRQGG TTCGA TCAAG bir </td><td> B: 5&#39;-Biotin; R: adenin ribonükleotid; F: floresein-dT; S: DABCYL-dT </td></tr><tr><td> DE1 </td><td> GATGT GCGTT GTCGA GACCT GCGAC CGGAA CACTA CACTG TGTGG GGATG GATTT CTTTA CAGTT GTGTG TTGAA CGCTG TGTCA AAAAA AAAA </td><td></td></tr><tr><td> T1 </td><td> GACAA CGCAC ATCTC TTGAT CGAAC Cı </td><td></td></tr><tr><td> LD1 </td><td> XTTTT TTTTT TTTTT TTGAC ACAGC GTTCA bir </td><td> X: 5&#39;-NH2 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: sentetik oligonükleotit dizileri.

Watch this Scientific Journal Video about Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test at JoVE.com

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

colorimetric-detection-of-bacteria-using-litmus-test

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Görüntüleme.  McMaster University. We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads. 

Video: Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of agricultural waters. Here, water is filtered through sterile Modified Moore Swabs (MMS), which consist&#160;of a simple gauze filter enclosed in a plastic cartridge, to concentrate bacteria. Following filtration, non-selective or selective enrichments for the target bacteria are performed in the MMS. For colorimetric detection of the target bacteria, the enrichments are then assayed using paper-based analytical devices (&#181;PADs) embedded with bacteria-indicative substrates. Each substrate reacts with target-indicative bacterial enzymes, generating colored products that can be detected visually (qualitative detection) on the &#181;PAD. Alternatively, digital images of the reacted &#181;PADs can be generated with common scanning or photographic devices and analyzed using ImageJ software, allowing for more objective and standardized interpretation of results. Although the biochemical screening procedures are designed to identify the aforementioned bacterial pathogens, in some cases enzymes produced by background microbiota or the degradation of the colorimetric substrates may produce a false positive. Therefore, confirmation using a more discriminatory diagnostic is needed. Nonetheless, this bacterial concentration and detection platform is inexpensive, sensitive (0.1 CFU/ml detection limit), easy to perform, and rapid (concentration, enrichment, and detection are performed within approximately 24&#160;hr), justifying its use as an initial screening method for the microbiological quality of agricultural water.

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (&#181;PAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Kolorimetrik Algılama Paper-based<em&gt; Escherichia coli</em&gt;<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. Ve<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Tarım Su geniş hacimli

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Çevre

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Biyomühendislik

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Floresan boyalar kullanarak

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Bir renk reaksiyonuna dayalı bakteriyel hareketliliğin görselleştirilmesi

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

Biyoloji

Water Quality Analysis via Indicator Organisms

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba -The University of Arizona 
Demonstrating Author: Luisa Ikner
Water quality analysis monitors anthropogenic influences such as pollutants, nutrients, pathogens, and any other constituent that can impact the water&#8217;s integrity as a resource. Fecal contamination contributes microbial pathogens that threaten plant, animal, and human health with disease or illness. Increasing water demands and strict quality standards require that water being supplied for human or environmental resources be monitored for low pathogen levels. However, monitoring each pathogen associated with fecal pollution is not feasible, as laboratory techniques involve extensive labor, time, and costs. Therefore, detection for indicator organisms provides a simple, rapid, and cost effective technique to monitor pathogens associated with unsanitary conditions.

Microbial Indicators and Most Probable Number Analysis for Water Quality

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba -The University of Arizona
Demonstrating Author: Luisa Ikner
Water quality analysis monitors ...

Education

JoVE Science Education

Çevre Bilimleri

Çevre Mikrobiyolojisi

Photometric Protein Determination

Measuring the concentration is a fundamental step of many biochemical assays. Photometric protein determination takes advantage of the fact that the more a sample contains light-absorbing substances, the less the light will transmit through it. Since the relationship between concentration and absorption is linear, this phenomenon can be used to measure the concentration in samples where it is unknown.
This video describes the basics of photometric protein determination and introduces the Bradford Assay and the Lowry Method. The procedure in the video will cover a typical Bradford assay. Applications covered include direct measurement of very small volumes of nucleic acids to characterize concentration and purity, determination of coupling efficiency of a biomimetic material, and another variation of photometric protein determination using Remazol dye.
<div class="chapter_text" id="script_0">
	Determining the concentration of a protein in samples is a fundamental step in many biochemical assays. Photometric determination can be done with small sample sizes. The more a sample contains light-absorbing substances, the less the light will transmit through it. This provides a quantitative measurement of the absorbing substances. These concepts are so fundamental to science that the articles that introduced two of the techniques are in the three most cited papers of all time. This video will show the concepts behind some of the most common photometric protein determination techniques, how they are performed, and how the gathered data is analyzed.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
	Photometric protein determination is based on the relationship between concentration and light absorbency. This is known as the Beer-Lambert Law, which states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance.
	This principle underlies all photometric protein determination methods. 
	For direct absorption analysis, the absorbance values of unaltered protein samples are measured. Because of their aromatic side chains, tryptophan and tyrosine residues give the highest absorbance readings at a wavelength of 280 nm.
	However, these amino acids-which are two of the least frequently found in proteins-are present in different amounts in every protein, so each determination is unique. To overcome this limitation, more complex assays-that are not dependent on these amino acids-were developed.
	One example is the Bradford Assay, where colored dye is added to the sample. The dye, known as Coomassie Blue, responds proportionally-the more protein present, the more binding events with the dye.
	Then, protein concentration is determined by measuring the absorbance of the bound Coomassie Blue dye, which absorbs light at 594 nm. However, the Bradford assay is linear over a short range of concentrations, so dilutions are often required before analysis.
	The Lowry Method combines the Biuret reagent, an alkaline solution of copper ions that react with peptide bonds, and the Folin-Cioc&#226;lteu reagent, which oxidizes aromatic protein residues. The resulting color change of the sample is proportional to the protein concentration.
	The absorbance of the reduced Folin reagent can be determined at 750 nm. Like direct absorption, each protein has a unique response, and must be calibrated for the protein of interest. Now that we've reviewed the basic principles behind some of the most common assays, let's look at how direct absorption and the Bradford assay are performed.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
	To begin a direct absorption analysis, the spectrophotometer is calibrated with a blank to determine zero absorbance. Standard solutions are prepared for use in creating the calibration curve. Then, an aliquot of the first standard is added to a cuvette, and placed into the spectrophotometer.
	The absorbance value at 280 nm is then recorded. This process is repeated for each standard, using a clean cuvette for each run. Once complete, a calibration curve is created by plotting the absorbance versus concentration. The slope of this line is the molar attenuation coefficient, which relates absorbance to concentration.
	Next, the unknown sample is added to a cuvette, and the absorbance value is recorded. As the data analysis for the different photometric determination methods is similar, we will cover that after we look at the Bradford assay.
	Here, the Bradford protein assay is performed with a BSA standard on a 96-well plate. To begin, BSA stock solutions are prepared.
	The unknown solutions are diluted with deionized water to ensure that the concentrations are within the assay's range. Depending on the kit, the Coomassie dye may also require dilution. Then, the calibration curve is set up by adding the BSA standards to the 96-well plate.
	Deionized water is added to reach the needed concentration to generate a standard curve. The unknown sample should be added to the plate in triplicates to ensure an accurate measurement is taken. Coomassie dye is next added to each well, mixing with the pipette.
	Deionized water is added to an empty well as a blank, to measure the absorbance. After waiting 5 min for the dye to bind, the absorbance is measured in a plate-reader at 590 nm.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
	Now that we've performed a few assays, let's look at how to analyze the data. Each photometric protein determination method is based on the Beer-Lambert Law.
	The measured absorbance of the standards is used to create a calibration curve, which is then used to determine the concentration of unknown samples. This curve can be manually plotted, though newer spectrophotometric tools will create the calibration curve once all standards have been measured. These systems will also calculate protein concentration as unknown samples are analyzed.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
	Now that we've reviewed how to analyze photometric protein determination data, let's look at some of the ways these procedures are utilized.
	The principles of photometric protein determination can also be used to directly measure nucleic acid concentration. The nanodrop spectrophotometer accepts samples of very small volume onto an optically active pedestal. The absorbance is then measured, and the system automatically determines the nucleic acid concentration. Because proteins and other sources can interfere with measurements, sample purity is determined by analyzing the 260 to 280 nm and 260 to 230 nm absorbance ratios. Pure nucleic acids typically yield ratios of approximately 1.8 and approximately 2.0 for DNA and RNA, respectively.
	Photometric protein determination can also be used in the production of biomimetic materials, which are inspired from nature to elicit specific cellular responses. Recombinant adhesins are bound to polystyrene beads to simulate bacterial attachment to host cells. The Bradford assay is used to determine the coupling efficiency of the recombinant adhesion to the beads in the production of the biomimetic material.
	Alternative photometric protein assays can be used in the detection and characterization of protein antimicrobials. Remazol brilliant blue R dye is covalently bonded to heat-killed bacteria. The protein antimicrobial is incubated in the dyed solution. Then, the sample is centrifuged, and the absorbance of the supernatant at 595 nm is measured using a microplate spectrophotometer. Increased absorbance, by the soluble dye released into the supernatant from the labeled bacteria, is a quantitative measurement of enzymatic activity.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
	You've just watched JoVE's video on photometric protein determination. This video described the underlying principles of photometric determination, went over general procedures for some common assays, and covered some new advances in techniques. Thanks for watching!
</div>

Photometric Protein Determination: Bradford Assay

Measuring the concentration is a fundamental step of many biochemical assays. Photometric protein determination takes advantage of the fact that the more ...

Kimya

Biyokimya

Colorimetric Detection of a Bacterial Biomarker Using a Modified Litmus Test

After preparing E. coli cells according to the text protocol, pre-wash a 1.5-milliliter microfuge tube by adding and vortexing 100 microliters of RB. Then, discard the buffer.
Add 15 microliters of assembled EC1 to the washed tube, then, place the tube on the magnetic rack, and aspirate the supernatant. Remove the tube from the rack, add 100 microliters of RB, and carefully resuspend the magnetic beads.
After using RB to wash the beads two more times and removing the RB, add 10 microliters of the E. coli sample to the tube, and gently mix the contents by tapping on the tube. Then, incubate the reaction at room temperature for one hour.
After the incubation, add 90 microliters of doubly-distilled water, and place the tube on the magnetic rack. Following approximately three minutes of magnetic separation, carefully transfer 85 microliters of the supernatant to a 0.5-milliliter microfuge tube.
It is very important to pipette the solution carefully without taking up any of the magnetic beads. These beads are loaded with urease and will generate a false positive signal.
Add 15 microliters of 0.04% phenol red and 100 microliters of substrate solution. Then, take photographs at specific time intervals to record a color change.

Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kolorimetrik Algılama Paper-based

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler 'Bioluminescent' Muhabir Faj

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Memeli Hücreleri ile Derneği'nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler

Bir renk reaksiyonuna dayalı bakteriyel hareketliliğin görselleştirilmesi

Water Quality Analysis via Indicator Organisms

Photometric Protein Determination

Modifiye Turnusol Testi Kullanılarak Bakteriyel Bir Biyobelirteçin Kolorimetrik Tespiti