This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Madison ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kılavuzların (University of Wisconsin - - Madison Güvence numarası A3368-01) Tüm hayvan deneyleri Wisconsin Üniversitesi göre yapılmıştır. 1. Interrupted Çiftteşme aracılığıyla Yumurta Toplama için Females seçme NOT: IVF-tabanlı protokoller manuel basınç ile 9 arasındaki kadınlarda olgun yumurta ekstrüzyon güveniyor. Önceki protokoller yumurta bırakma davranışı geçiren kadınlarda olmadan tankları veya çift çiftleşmelerin doğrudan kadın kullanmış, ancak (zebra balığı hatta bağlı olarak yaklaşık% 20 ya da daha az), bu kadınların sadece küçük bir bölümü manuel basınç üzerine haddelenmiş ve yetkili yumurta verim. geliştirilmiş bir prosedürde, dişiler önceden sıralanmış doğrudan görsel gözlem ile yumurtlama için, çiftleşme anında kesinti takip etmektedir. Bu prosedür olarak neredeyse tüm kadın haddelenmiş ve yetkili yumurta bu kesintiye çiftleşme adımı verimi ile önceden seçilmiş, çok etkilidirelle bastırılarak. <ol><li> deneyden önce öğleden sonra, standart zebrabalıkları çiftleşme kutularında istenen Zebra balığı gerginlik çiftleşme çiftleri kurdu. Bir çiftleşme kutusu bölünme yoluyla ya da yumurtlama insert altında erkek ve insert içinde kadın yerleştirerek ya henüz fiziksel olarak onlardan ayrı kadın aynı odasında erkek tutun. </li><li> Bu çiftleşme başlar böylece deney sabahı, aynı yumurtlama insert içinde erkek ve kadın hem de yerleştirme, fiziksel bölümü çıkarın. </li><li> Görme doğal çiftleşme sırasında yumurta ekstrüzyon tespit etmek için çiftleşme çiftlerini içeren tanklar inceleyin. Yumurta ekstrüzyon, ayrı erkek ve dişi ilk belirtileri de üreme kesmek için. Erkeklerde ayrılmasının ardından, önceden seçilmiş kadın ayrı ayrı ya da aynı tanka toplanmış tutun. (Tipik 50-150 yumurta / dişi) istenen embriyo sayısına bağlı olarak birden fazla kadın kullanın. </li></ol> 2. Sperm Çözüm hazırlanması NOT: IVF rBir sperm çözüm olgun yumurta maruz Elies. Bu çözüm (HS2 tedavisi üzerine homozigot diploid embriyo haline) haploid zigot oluşturmak için, ya da (HS2 tedavi haline tetraploid embriyolar üzerinde olan) UV-işlenmiş diploid zigot oluşturmak için, işlenmemiş olabilir. Önceki sperm hazırlama protokolleri canlı erkeklerin anal bölge arasında Milt toplamak için kılcal tüpler kullanımı önerilen, ancak erkek sadece küçük bir bölümü Milt 9 vermiştir olarak etkisiz bir süreçtir. Aşağıda sunulan protokol daha güvenilir sonuçlar verir makaslanmış disseke testislerden sperm hazırlama, yerine dayanır. <ol><li> (Çözümler, 1, 2, 4 ve 5) tüm bileşenlerin içeren öncesinde Hank ön-karışım çözeltisi olarak zaman Hank çözeltisi hazırlayın sodyum bikarbonat çözeltisi (dışında Çözelti 6). Deneyin (Tablo 1) sabah Çözüm 6 taze hazırlayın ve karışıma ekleyin. Hanks solüsyonu (nihai solüsyon yapmak için, sabahı hazırlamakIVF işlemi), Hank Premix 990 ul ve taze yapılmış Çözüm 6 10 ul birleştirir. </li><li> Klimalı suda bir 0.016% çözüm olarak tricaine overexposure tarafından erkekleri euthanize. <ol><li> su içinde% 0.2 Stok çözelti olarak tricaine hazırlama (1 M Tris pH 9.0 ile pH 7.0 değerine tampon A) ve 4 ° C&#39;de tutun. Bir beher içinde, 100 ml su başına tricaine stok çözeltisi 8 ml ilave edilir, ve tricaine çözeltisine erkek aktarmak için bir ağ yerleştirin. </li><li> (100 ul / kavrama 10 kavrama dölleme, 1 mi Hank çözeltisi içinde toplanan 10 erkek örn testis) erkek başına 100 ul karşılık gelen Hank çözeltisi hacminde döllenmesi için gerekli kavrama için bir erkek Testislere eşdeğer kullanın. </li><li> 15 dakika boyunca solungaç hareketlerinin durdurulması ile ötenazi onaylayın. Ötenazi sonra, bir kaşıkla kaptan erkekleri kaldırın. koşullandırılmış su ile kısaca erkekleri durulayın ve bir kaç yerle ilgili kısaca yerleştirerek onları hafifçe kurulayınkağıt havlu. </li></ol></li><li> testisler, diseksiyon makas veya jilet kullanarak ilk başını kesmek ötenazi erkek kaldırmak ve yansıyan ışık kaynağı ile scissors.Under bir mikroskop diseksiyon ile karın boyunca uzunlamasına kesim yapmak, diseksiyon forseps ile iç organları çıkartmak için. forseps ile testisler kitlelerin her çekin ve Hank&#39;in çözeltisi içeren mikrosantrifüj tüp içine koyun. Not: Testis cloaca çevresinde birbirlerine iki uzatılmış gövde duvarları yanında bulunan saydam görünüş yapıları ve her şekilde tespit edilebilir. Testis diseksiyonu sonrası bir petri plakası yüzeyinde ve Hank çözeltisi koymadan önce 2-3 dakika kalabilirler. </li><li> dar bir spatula ile testislerin kesme ve / veya hafifçe hava kabarcığı oluşumunu engelleyerek, yukarı pipetleme ve 1000 ul ucu mikropipet ile çözelti içinde aşağı 5-6 kez testisler tarafından solüsyon içine sperm bırakın. testisler enkaz yerleşmek edelim. </li><li> o kadar 2-3 saat boyunca onun kudret tutabilir buz, sperm çözümü saklayın. Sperm çözeltisi UV tedaviye başlamadan halinde geride testislerin parçalar bırakarak temiz bir mikrosantrfuj tübüne solüsyonu aktarın. </li></ol> 3. UV Tedavi Not: UV muamelesi embriyoda etkin olmayan hale getirilmesi için sperm DNA çapraz bağlanması için kullanılır. jinogenetik haploid veya homozigot jinogenetik diploid embriyo üreten Bu adım yalnızca kullanılır. UV tedavisi için sperm çözüm testis (adım 2.4) parçalarından ayrılması gerektiğini, gibi büyük parçalar UV tedavisi sperm kalkan olabilir. <ol><li> Bir buz yatakta oturmuş bir depresyon cam levha temiz, kuru bir kuyuda (bir petri plakası içinde örneğin buz) sperm çözüm aktarın. de cam plaka başına sperma çözeltisi 1 ml kadar kullanın. </li><li> UV lamba altında buz yatakta depresyon cam plaka koyarak UV sperm çözüm Açığa. 115 V (60 Hz ile 90 saniye boyunca sperm çözüm tedavi, 0.68A) 19 cm (7.5 inç) mesafe UV-lamba. Bir pipet ucu ile hafifçe UV tedavisi sırasında her 30 saniyede (temiz pipet her 30 saniye kullanın) çözümü karıştırın. </li><li> Temiz bir pipet ucu ile mikropipet kullanılarak, yeni bir mikrosantrifüj tüpüne tedavi sperm çözeltisi aktarın. (Ekstraksiyon 2-3 saat daha uzun) IVF için gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın. </li></ol> Olgun Yumurta 4. Manuel eldesi NOT: kolayca anestezi ve manuel basınç altında yumurta verecektir doğal çiftleşmelerin kesintiye elde Dişiler. Bu işlem sırasında, tricaine tedavi dikkatli bir şekilde kadın kurtarma engelleyebilir aşırı maruz önlemek için kontrol edilmelidir. <ol><li> tricaine çözüm ışığa maruz kalma ile kadın uyutmak: şartlandırılmış su çözümü tricaine net transfer kadın balık durana kadar, yaklaşık 2-5 dakika boyunca (klimalı balık suyun 8 Tricaine% 0.2 stok solüsyonu 100 ml ekleyerek yapılan) solungaç hareketi. </li> &lt;li&gt; En kısa zamanda bir kadın solungaç hareketi durur, onu toplamak ve kısaca koşullandırılmış suyla durulayın için bir kaşık kullanın. Yine, balık taşımak bir kağıt havlu birkaç yerle ilgili kısaca ve tekrar tekrar yerleştirerek hafifçe kurulayın, sonra temiz, kuru bir 10 cm çapında petri tabak aktarmak kaşık kullanarak. Potansiyel solungaç kapakçık zarar vermemek için, arka yöne anterior kaşıkla balık yaklaşın. </li><li> erken su ile aktif hale gelen herhangi bir serbest yumurta önlemek için, yavaşça ileri anal yüzgeç bölgeyi kurutmak için laboratuvar mendil veya yumuşak doku kullanın. parmaklarını Nemlendirme hafifçe su ile (onlara balık pulları yapışmasını önlemek için) destek olarak dişinin sırtına bir elin bir parmağı koyun ve yumurta haddelenmiş hale gelene kadar, diğer elinin bir parmağı ile dişinin karın boyunca hafif basınç uygulayın. </li><li> kadın bedeni yumurta uzaklaşmaya dar bir spatula kullanın. kurtarma için koşullu su ile bir tanka geri kadın yerleştirin. <br/&gt; NOT: kadın vücudunun bir tarafında yatıyor iken yumurta ekstrüde sonra, o devrildiğinde olabilir ve onu diğer tarafta tekrarlanan süreç ek yumurta elde etmek. , Kadın tam iyileşme sigorta karın sadece nazik manuel basınç uygulayın ve en az 2 dakika içinde suya geri dönmek için solungaç hareketi durağına prosedürünü yürütmek için. </li><li> (Su maruziyeti ile) etkinleştirin ve ekstrüzyon sonra eş zamanlı olarak 90 saniye içinde (sperm çözüm ilavesi ile) yumurta döllemek (bkz bölüm 5). </li></ol> Tüp Bebek 5. NOT: Doğal melezlerde Zebra balığı gübreleme, dış çiftleşme sırasında yumurta, su ve sperm ile eşzamanlı serbest bırakılması ve aktivasyon bağlıdır. suyun mevcudiyetinde sperm çözeltisi yumurta maruz bırakılarak vitro fertilizasyon taklit bu işlem. Su hacmi etkili bir sperm arttırmak için (1 mi), ilk küçüktür. Sperm tarafından bağlayıcı 15-20 sn 10 &lt;içinde gerçekleşir/ Sup&gt; ve su miktarı daha sonra arttırılabilir. Koryon sperm 11,12 bağlanması için yetki penceresi sınırlayarak debriyajın yakın senkronizasyon daha katkıda bulunur kaldırma. Elde edilen embriyolar için erken klevaj aşamalarında büyük ölçüde eş zamanlı olarak hücre bölünme döngüsü sergiler. <ol><li> (Bir erkek itibaren testislerin eşdeğerine karşılık gelen - Bölüm 2 bakınız) sperm çözeltinin 100 ul ekleyin bir petri tabakta ekstrüde yumurta debriyaja. Yavaşça yumurta zarar görmemesi için petri tabak yüzeyinden ucu kaldırmayın emin olmak birlikte sperm ve yumurta karıştırmak için yumurta arasında sperm çözümü eklemek için kullanılan pipet girdap. </li><li> Hemen embriyonik orta (E3) solüsyonu 1 ml ekleyerek yumurta aktive hafifçe pipet ile dönen tarafından ve yine hafifçe yumurtaları karıştırın ve sperm (klimalı su da bir Parça 5 ile 7 E3 için yedek olarak kabul edilir). Döllenme için zamanlama göreli başlatmak için bir zamanlayıcı başlatın. </li&gt; <li> 1 ml hacminde 1 MPF&#39;e anda, E3 ile plaka sel. Devam etmeden önce, tam koryon genişleme de dahil olmak üzere yumurta aktivasyonu, izin 10-12 MPF&#39;e kadar rahatsız bırakın. </li></ol> 6. Isı Şoku Tedavisi NOT: Erken embriyo uygulanan bir ısı şoku sonraki hücre döngüsü 2 sırasında iğ oluşumunu sürücü Sentriyoller tamamlanmamış bir tamamlayıcısı sonuçlanan centriole çoğaltılması engeller. Karık oluşumu 13 eksikliği dönüş sonuçlarında iğ olmaması. <ol><li> chorions genişlemesi (10-12 mpf) sonra, bir çay süzgeci içine petri tabak embriyolar dökün. çay süzgeci içinde kalan embriyolar toplamak için E3 ile yıkama şişesi kullanılarak petri tabak durulayın. </li><li> 28.5 ° C &#39;de E3 önceden ısıtılmış bir banyoda bir beher içinde embriyolar çay süzgeci yerleştirin. su banyosu sıcaklığına Beheri ve E3 öncesi denge ve yeterli E3 olduğundan emin olmak ve böylece çay tüm embriyolarsüzgeç ortamına maruz kalmaktadır. </li><li> 22 MPF&#39;e at, kısaca, 28.5 ° C su banyosunda çay süzgeci kaldırmak aşırı nemi ortadan kaldırmak için kağıt havlu üzerine kurulayın ve 41.4 ° C&#39;de ısı banyosunda benzer önceden ısıtılmış E3 beher içine yerleştirin. </li><li> 24 MPF&#39;e anda, kısa blot sonra 28.5 ° C su banyosunda geri E3 çay süzgeci aktarın. 29 MPF az 10 cm Petri levhaya çay süzgeci embriyolar aktarmak E3 ile yıkama şişesi kullanın. </li></ol> One-döngüsü Sitokinez Stall ile Embriyolar 7. Seçim <ol><li> süresi 35-45 MPF&#39;e sırasında iletilen bir ışık kaynağı ile bir mikroskop altında, 2-hücreli aşamaya simetrik bölünme geçiren ve olan bu embriyolar, bu nedenle döllenir seçin. Hücre bölünmesini geçiren olmayan embriyolar çıkarın. </li><li> İlk hücre döngüsü sırasında normal hücre bölünmesi için seçilen döllenmiş embriyolar, gözlemleyerek devam edin ve sn boyuncakinci hücre döngüsü (50-65 mpf). </li><li> 4 hücreleri ( &quot;No durak&quot;, 2: 4 hücreli embriyonun 2 düzeneği standart) aşağıdaki kategoriler (Şekil 2C) &#39;ye göre Sıralama embriyolar; 3 hücreleri (bir sapkın 2 küçük hücrelerde &quot;kısmi durak&quot;, 1 büyük hücreli düzenlemesi); 2 hücreleri (: 2 hücreli embriyo özdeş 1 düzenleme embriyo 1 bir tek hücre döngüsü gecikmesi sergileyen, &quot;durdu&quot;). taze petri tabak içine durdu embriyolar sıralayın. NOT: Bu aşamada, 2 embriyolar: 2 düzenleme de blastomere hücre bölünmesi durak yapılan ikinci bir hücre döngüsü sırasında hangi karşılık gelir; bir sapkın 2 küçük hücrelerde embriyolar: 1 büyük hücreli düzenlemesi ısı şoku bir blastomere ikinci hücre döngüsü sırasında bir hücre döngüsü durak neden ancak diğer burada karşılık gelir; ve embriyolar 1 &quot;durdu&quot;: 1 düzenlemenin ikinci hücre döngüsü sırasında her iki blastomer istenilen hücre bölünmesini yapılan bu nereye tekabülahır. Durduruldu embriyolar sonraki hücre döngüsü döneminde (65-80 mpf) sırasında hücre bölünmesini devam etmesi gerekir. Blastomer düzenleme mili 2,14 stabilize nedeniyle önceki hücre döngüsü eksik ipuçlarına, değişken olabilir, ancak çoğu embriyolar normal gelişim geçirebilen bir nispeten normal blastula oluşturacaktır. </li><li> Embriyolar 10 cm plaka başına 80 embriyo limitli, Petri plakasında geliştirmeye olanak sağlar. 24 HPF, onlar indirgenmiş ekseni uzantısı aksine, diploid veya homozigot diploid embriyolar 6 (eksen uzantısı (Şekil 3A, 3C) normal ölçüde) normal morfoloji özelliği ve haploidlerin artan vücut kalınlığı, karakteristik olup olmadığını belirlemek için embriyolar gözlemlemek (Şekil 3B)), ve / veya altın veya albino ve bu deneyler 36 MPF, (Şekil 3 ve aşağıya bakınız) 2,6,9 genetik pigment işaretlerini kullanarak diploidization değerlendirmek. </li&gt; <li> haploid morfoloji var, ya da parçalanmış olan veya diğer fena halde anormal kusurları sergilemek görünen herhangi bir embriyolar çıkarın. NOT: İstenirse, günlük olarak parçalanmış ya da fena halde anormal embriyolar kaldırmak için devam eden ve orta yenilemek için taze E3 eklerken embriyolar, 5 gün sonra döllenme kadar geliştirmeye olanak sağlar. Not: Hayatta kalan embriyolar da kuluçka sistemine aktarılması ve standart koşullar altında beslenerek 5. günde swimbladder şişirildikten sonra yetiştirilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+and+induction+of+alternate+clevage+patterns+through+inhibition+of+centrosome+duplication+in+the+early+zebrafish+embryo.">Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).</li><li>Zhang, X., Onozato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrostatic+pressure+treatment+during+the+first+mitosis+does+not+suppress+the+first+cleavage+but+the+second+one.">Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one.</a> Aquaculture. 240, 101-113 (2004).</li><li>Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hydrostatic+pressure+on+microtubule+organization+and+cell+cycle+in+gynogenetically+activated+eggs+of+olive+flounder+(Paralichthys+olivaceus).">Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus).</a> Theriogenology. 68, 873-881 (2007).</li><li>Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-intrinsic+mechanisms+modulate+centrosome+integrity+during+fever.">Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever.</a> Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).</li><li>Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).</li><li>Blanco-Vives, B., S&#225;nchez-V&#225;zquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronisation+to+light+and+feeding+time+of+circadian+rhythms+of+spawning+and+locomotor+activity+in+zebrafish.">Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).</li><li>Dekens, M. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).</li><li>Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).</li><li>Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sperm+entry+site+during+fertilization+of+the+zebrafish+egg:+localization+of+actin.">The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin.</a> Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).</li><li>Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+a+sperm+meets+an+egg:+block+to+polyspermy.">When a sperm meets an egg: block to polyspermy.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defending+the+zygote:+search+for+the+ancestral+animal+block+to+polyspermy.">Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).</li><li>Rappaport, R., Rappaport, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cleavage+furrows+by+the+mitotic+spindle.">Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle.</a> J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).</li><li>W&#252;hr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos.">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).</li><li>Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+maternal-effect+gene+cellular+atoll+encodes+the+centriolar+component+Sas-6+and+defects+in+its+paternal+function+promote+whole+genome+duplication.">The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication.</a> Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).</li><li>Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+Y,+W,+and+Z+sex+chromosomes+in+Xenopus+tropicalis.">Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).</li><li>Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish.">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112, 311-319 (1986).</li><li>Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-effect+gene+futile+cycle.is+essential+for+pronuclear+congression+and+mitotic+spindle+assembly+in+the+zebrafish+zygote.">The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote.</a> Development. 130, 3907-3916 (2003).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).</li></ol>

The authors do not have competing financial interests.

kritik adımlar In vitro fertilizasyon etkili koşullar altında çalışmak için çok önemlidir. olgun yumurta (adım 1) iyi bir tedarik sigortalamak için dişiler çiftleşmek için ayarlanmış en az 5 gün süreyle çiftleşme haç kurulmuş olmamalıdır ve gebe görünmelidir. ıslahının kesinti sırasında, bir gözlemci doğal yumurta ekstrüzyon ilk görünüm için yeterli 15-30 tankları izleyebilirsiniz. İlk yumurtalar çoğu yumurta IVF işlemi için kadın iç kalmasını sa...

Bu protokol, jinogenetik haploidlerin (Şekil 1) ya da tetraploids üretimi homozigot jinogenetik diploid üretimi gibi zebra balığı embriyolar bölgesi ploidinin işleme izin verir. Bu tam bir hücre döngüsü (Şekil 2A, 2B) karşılık gelen sitokinez bir gecikme uyarılması ile elde edilir. sitokinez önemli bir döngü gecikmesi ısı şoku ile muamele ile elde edilmektedir. Orijinal olarak Streisinger ve arkadaşları tarafından tarif Isı Shock (HS) standart protokol ilk hücre döngüsü 1 sırasında bir döngüsü hücre bölünmesi durak sonuçlanan dönem 13-15 MPF&#39;e sırasında sıcaklık darbe yer. Bu protokolün etkinliği son zamanlarda ısı şok tedavi kayan zamansal pencere ile erken hücre döngüleri tarayarak geliştirilmiştir. Bu tarama, hala ilk hücre döngüsünün (22-24 mpf) içinde, bir ısı şok daha sonraki bir zaman noktası tespit olduğunu EMBR daha yüksek bir oranda sonuçlarıBu durumda, ikinci bir hücre döngüsü 2 etkileyen bir döngüsü hücre bölünmesi durak ile yo. İlk hücre döngüsü sırasında deneysel manipülasyonlar ikinci hücre döngüsü sırasında hücre bölünmesi ile müdahale ve DNA içeriği tekrarını neden gözlem diğer balık türlerinin 3,4 rapor edilmiştir. terimi &quot;2&quot; ısı darbesinin, standart HS yöntemi daha sonraki bir zaman noktasında meydana gelmesi ve HS2 neden olduğu hücre döngüsü gecikmesi ikinci bir hücre döngüsü sırasında meydana yansıtır - Biz Isı Şoku 2 (HS2 olarak tadil edilmiş protokole bakınız ). Bu çalışmalar, ısı şokundan sonra sitokinez tutuklama temeli aşağıdaki hücre döngüsünde iğ oluşumunu ve karık indüksiyon etkileyen ısı darbesi sırasında centriole çoğaltılması engellenmesi olduğunu göstermiştir. HS2% 100 yaklaşıyor hücre döngüsü tutuklama verimleri sonuçları ve standart HS 2&#39;den 4 kez daha yüksek Ploidi çoğaltılması up oranları. Embriyolar tedavi zekâha blastomer hücresi devir esnasında ısı şoku birçok zararlı etkileri gösterirler, bu ısı şoku düşündüren hücre bölünmesi 2 için gerekli çoklu süreçleri etkiler. Isı şok hücre bisiklet (süre 0-30 mpf) başlamadan önce uygulandığında Öte yandan, centriole çoğaltılması ile özel girişim ile tutarlı etkilere sahip görünüyor ve diğer temel hücre süreçlerini 2 etkileyecek gibi görünmüyor . Bu çalışmalar blastomer bölünme başlamadan önce zaman özellikle centriole inhibisyonu yoluyla ploidi işlemek için bir araç olarak ısı şok kullanarak mükellef bir gelişimsel dönem gibi görünüyor gösterdi. Centriole çoğaltılması ısı şok belirgin bir seçicilik altında yatan nedeni bilinmemektedir, ancak örneğin lökositler 5 gibi bazı hücre tiplerinde, ısı stresi altında gözlenen sentrozom alt yapılar, seçici bir bozulma ile ilişkili olabilir. embriyonik de zamansal senkronizasyonuvelopment in vitro fertilizasyon (IVF) ile elde edilir. üzerine tetraploid hale tek döngüsü sitokinez durak HS2 kaynaklı diploid embriyolar gübreleme sonuçları sırasında işlenmemiş sperm kullanımı. DNA&#39;sını inaktive çapraz bağlantılar, bir döngü sitokinez durma jinogenetik diploitler 2 olur HSII kaynaklı üzerine jinogenetik haploid embriyolar 6, sonuçlar taşıyan UV ile muamele edilmiş sperm, kullanımı. Çünkü ortaya çıkan tüm genom çoğaltılması, ikincisi jinogenetik diploitler genom boyunca her loküsündeki homozigot bulunmaktadır. özlülük için, biz &quot;haploidlerden&quot; ve &quot;homozigot diploid&quot; olarak homozigot jinogenetik diploid embriyolar olarak haploit embriyolar jinogenetik bakın. yaşayabilir ve fertil ise, homozigot diploitler steril ve ölümcül içermeyen hatları başlatmak için kullanılabilir. HS2 tarafından uyarılan doğrudan homozigotlu¤u de kolayca mut heterozigot taşıyıcısı olan kadınlarda homozigot diploidlerin beri, genetik analiz veya genetik ekranlar dahil edilmelidiryüksek ve sabit (% 50) oranlarında 2 de homozigotluğu ve ations sergi oranları. Aşağıdaki protokol HS2 gerçekleştirmek ve tam homozigotluğu ile Ploidi tekrarını ikna etmek için gereken adımları açıklar. tetraploid üretimi için, spermin çözeltisi muamele edilmemiş olmalıdır. homozigot diploid üretimi için, spermin, UV muamele ile inaktive edilmelidir. Tartışmada tarif edildiği gibi ek olarak, gözle görülebilir pigment belirteçler homozigot diploid belirlenmesini kolaylaştırmak için kullanılabilir. En iyi sonuçlar için IVF işlemi bu süre içinde meydana gelmelidir yüzden öncelikle ışık döngüsüne 7 ve hem yetişkinler hem de yumurta inisiyasyon ilk 3 saat boyunca balığı arkadaşı, sirkadiyen ritimler 8 duyarlıdır.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish mating boxes</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>FDA approved (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td><td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td><td>available in ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>Plastic spoon</td><td></td><td></td><td>available in most standard stores</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting forceps</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>available from Fine Science Tools</td></tr><tr><td>Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Reflective light source (LED arms)</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Petri plates 10 cm diameter</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 ml</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Pipette tips 1,000 &amp;micro;l</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Narrow spatula</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>Depression glass plate</td><td>Corning Inc</td><td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>UVP</td><td>Model XX-15 (cat No. UVP18006201)</td><td>available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)</td></tr><tr><td>UV glasses</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Timer stop watch</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Wash bottle</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Tea strainer</td><td></td><td></td><td>available in kitchen stores</td></tr><tr><td>beakers, 250 ml (2)</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>water bath (2)</td><td></td><td></td><td>any maker, with accurary to 0.1 C (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Shel Lab H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O Bath Series)</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 1</td><td>see above</td><td>see above</td><td>8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 2</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.358 g Anhydrous Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.6 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 4</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.72 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; in 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Premix</td><td>see above</td><td>see above</td><td>add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 2;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 4;&amp;nbsp; 86.0 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 6</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.33 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; in 10 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Solution (final solution)</td><td>see above</td><td>see above</td><td>Combine 990 &amp;mu;l of Hank&amp;rsquo;s Premix and 10 &amp;mu;l of freshly made Solution 6 (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; solution)</td></tr></tbody></table>

ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment

ploidinin Manipülasyon gibi diploidlerin için tetraploids için diploidlerin veya haploidlerden gibi yararlı dönüşümler için izin verir. Tek bir heterozigot anneden homozigot doğrudan üretimini sağlar, çünkü zebra balığı Danio rerio olarak, özellikle homozigot jinogenetik diploid nesil genetik analizinde yararlıdır. Bu makalede, ilk hücre döngüsü, Isı Şok 2 (HS2) sırasında ısı nabız dayalı ploidi çoğaltma için modifiye edilmiş bir protokol tanımlamaktadır. centriole çoğaltılması inhibisyonu yoluyla, bu yöntem, ikinci bir hücre döngüsü sırasında hassas hücre bölünmesi durak ile sonuçlanır. etkilenmemiş DNA çoğaltılması ile birlikte hassas bir döngüsü bölümü durak, tüm genom çoğaltılması sonuçlanır. Bu yöntem ile ilgili protokoller tek hücre döngüsü bölünmesi gecikme ve Ploidi tekrarını neden yumurta ve sperm toplama, sperm UV tedavisi, in vitro fertilizasyon ve ısı darbesi bulunmaktadır. Bu protokolün değiştirilmiş bir versiyonu uygulanabilirDiğer hayvan türleri ploid değişikliğine neden.

Bir hücre döngüsü sitokinez durak rağmen, DNA replikasyon embriyo (Şekil 1) DNA içeriğinin tekrarlardan sonuçlanan, embriyolar, normal olarak ortaya çıkar. Streisinger Isı Şok protokolü (standart HS) dönemi 13-15 dakika sonra döllenme (mpf) sırasında ısı nabız içerir ve türetilmiş bir yöntem burada açıklanan ise 35 mpf 1,2 ilk embriyonik hücre bölünmesi sırasında öncelikle sitokinez tutuklama indükler, Isı Şok 2 (HS2), döne...

Watch this Scientific Journal Video about Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment at JoVE.com

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

ploid manipülasyon için değiştirilmiş bir protokol, erken embriyoda sitokinez bir tek çevrim durak uyarılması için bir ısı şoku kullanır. Bu protokol zebrabalıkları gösterilmiştir, ancak diğer türlere uygulanabilir.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

ploidy-manipulation-of-zebrafish-embryos-with-heat-shock-2-treatment

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Görüntüleme.  University of Wisconsin.  ploid manipülasyon için değiştirilmiş bir protokol, erken embriyoda sitokinez bir tek çevrim durak uyarılması için bir ısı şoku kullanır. Bu protokol zebrabalıkları gösterilmiştir, ancak diğer türlere uygulanabilir. 

Video: Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genetik

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Erken Basınç Gynogenetic Diployid Zebra balığı

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Biyoloji

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Gelişim Biyolojisi

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Zebra Balıklarının Yumurtalık Foliküllerinde Foliküler Hücrelerin ve Oositlerin Ayrılması

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

Bozulmamış Zebra Balığı Embriyolarında Normal ve Anormal Sitozin Metilasyonunun Hızlı ve Verimli Mekansal Zamansal İzlenmesi

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Nörobilim

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

zSpRY-ABE8e ile İnsan Genetik Hastalığının Zebra Balığı Modellemesi için Verimli PAM-Less Temel Düzenleme

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...