Name: purification of native complexes for structural study using a tandem affinity tag method
Uploaded: 2016-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method at JoVE.com

The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.

Not: Aşağıdaki protokol hücre kültürünün 4 L, hücrelerin yaklaşık 40 g ıslak ağırlık bir kompleks saflaştırılması için geliştirilmiştir. Hazırlandıktan sonra, bütün tamponlar, 4 ° C&#39;de saklanır ve bunların hazırlanması ve bir ay içinde kullanılmalıdır. İndirgeme maddesi ve proteaz inhibitörleri, sadece kullanımdan hemen önce tampon eklenir. Tandem afinite temizliği için tam hücre özütünün hazırlanması 1. <ol><li> S. Büyüme cerevisiae hücreleri <ol><li> Streak istenen TAP S. etiketli cerevisiae cinsi depolama (-80 ° C) bir maya pepton dekstroz üzerine (YPD) plaka. maya hücreleri ve beyaz kabarık görünene kadar, 5 gün boyunca (30 ° C) - 3 inkübe edin. </li><li> 50 mL.lik bir konik propilen santrifüj tüpü içinde 10 mi YPD ortamı içine plaka taze hücre yaklaşık olarak 2 mm bir 2 çizgi inoküle. dakikada 180 devir (rpm) bir gecede (° C 30m) tüp sallayın. </li><li> over 2 ml aşılamak2 L&#39;lik Erlenmeyer veya konik bir şişe içinde YPD ortamı litre başına gece kültürü. 180 rpm&#39;de (30 ° C) çalkalanır. - 24 saat, eski kütük fazı kadar 2 1.8 OD 600, tipik olarak 20 ile 600 nm (OD 600) bir optik yoğunlukta hücre büyümesini izlemek. </li></ol></li><li> Hasat S. cerevisiae hücreleri <ol><li> santrifüj ile hasat hücreler 15 dakika boyunca (4 ° C) 5,400 xg&#39;de. </li><li> Hızla süpernatant süzün ve 4 ° C&#39;de veya buz üzerinde hücreleri tutun. </li><li> Liziz Tamponu soğutulmuş 2 ml hücre peleti, her litre Askıya (10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 300 mM NaCI, 10 mM KCI, 0.2 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM imidazol, pH 8.0;% 10 gliserol;% 0.1 h / h NP-40). dönen ve / veya tekrar pipet 10 ml serolojik pipet kullanarak hücreleri Askıya. Not: NP-40 önemini kompleks kalite ve post-arıtma analizi aşağıda ele alınmıştır ile ilgilidir. </li><li> Boş 50 ml konik polipropilen santrifüj tüpü k içine hücre süspansiyonu aktarınBuz üzerinde EPT&#39;nin. soğutulmuş lizis tamponu ek olarak 2 ml, her bir santrifüj yıkama şişesi ve 50 ml bir tüp içinde hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> tüp tartı ve boş tüpün ağırlığını çıkararak yanı sıra ilave Lizis Tampon ile hücre pelet ıslak ağırlığını belirlemek. Not: OD 1.8 600 olan hücre kültüründen bir litrelik yaklaşık 10 gramdır. </li><li> 50 mL.lik bir konik propilen santrifüj tüpü içinde bir sıvı azot banyosu oluşturur. 5 ml&#39;lik bir şırınga içine süspansiye edilmiş hücreler çizin. şırıngaya 16 G iğne bağlayın. Hücre oluşturmak için şırınga / iğne ile geçirilerek hücre süspansiyonu dondurma &quot;damlacıkları&quot;. dondurma oranı, yaklaşık 1 dakika / ml olmalıdır. </li><li> Donmuş hücre damlacıkları saklayın (-80 ° C) veya lizis geçin. </li></ol></li><li> Hücrelerin eritilmesi ve lizat Açıklama <ol><li> Lyse bir kahve değirmeni kullanarak maya hücreleri. c çalkalanırken 25 sn, patlamaları taşlama ile lyse hücreleri sekiz dokuz kereoffee değirmeni. Kullanımdan önce, sıvı azot ile birlikte kahve değirmeni önceden soğuk. öğütme Her iki tur, öğütücü sıvı azot sığ bir katman ekleyin ve buharlaşması için izin verir. </li><li> topaklanma hücreleri tutmak için gerekli bir sıvı azot soğutulmuş spatula ile karıştırın. Hücre topaklanma neden olabilir hücrelerin çözülme önlemek için dikkatli olun. Hücreler, aşağıdaki ince beyaz bir toz olarak görünmelidir. Maya kültürü (~ 40 g) 4 L bir maksimum hücre peleti aynı anda zemin olabilir. Not: liziz yöntemi ile ilgili gözlemler aşağıda tartışılmaktadır. </li><li> Bir hemasitometre veya alternatif hücre sayım yöntemi kullanılarak hücre parçalama derecesini değerlendirin. Yeterli bir analiz sağlamak için, aşağıdaki örnekleri almak: (1) lizis önce; (2) lizis dört tur sonra; ve (3) lisizini takiben. Bu örnekleri kontrol etmek için, 1.5 ml bir tüp içinde bir sıvı azot soğutulmuş spatula ve yer ile hücrelerin küçük bir miktar alır. </li><li> hücre hücreler çözündürüldü sonra pipet 5 ulve 495 ul su ile karıştırın. 40 - eğer hücrelerin% 60 erimesi görülmektedir, protokolde bir sonraki adıma geçin. Not: lizis uzun süre etkisi ile ilgili gözlemler aşağıda ele alınmıştır. </li><li> Bir kez yeterli lizis görülmektedir, mağaza parçalanmış hücreleri (-80 ° C) veya bir sonraki adıma geçin. </li><li> 1 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), 1 mM ditiotreitol (DTT) ve proteaz inhibitörleri ticari olarak temin edilebilen bir kokteyl içeren 15 mi liziz tamponu ile her biri iki 50 ml konik propilen santrifüj tüpü hazırlayın. Not: önemli proteoliz görülürse, bir proteaz eksik suşu kullanımını düşünün. </li><li> hazırlanan 50 ml tüpler içinde dondurulmuş Parçalanan hücre tozu kepçe için bir sıvı azot soğutulmuş ıspatula ile yapılır. indirgeyici ve proteaz inhibitörü (lar) hem de içeren, Lizis Tamponu kademeli olarak katı hücre tozu / ekleyin. </li><li> Çözülme olarak / şekillendirme kabarcıklarını engellemek için de hücrelerin erimesi, ama çok nazikçe oda sıcaklığında 50 ml tüpler döndürün. birHücre toz / katı erir, ek hücreye katı / tozu ekleyin s. </li><li> Her biri yaklaşık 20 hücre g veya ilave tüm hücreleri sahip olana kadar iki kez 50 ml tüpler her doldurun. 50 ml tüpler gözlenen donmuş hücre kümeleri vardır kadar çözülme / çözülmesini devam edin. Bu yaklaşık 50 dakika sürer. </li><li> 25,000 xg (4 ° C) &#39;de 20 dakika süre ile süspansiyon haline hücre lizat santrifüj. İyi lize hücreler, siyah bir çökelti az miktarda sergileyebilir. </li><li> ultra santrifüj tüpleri (kullanılan 26.3 mi tüpler) polikarbonat ve her tam bir tüpe 10 ul 200 mM PMSF ilave süpernatant 50 ml aktarın. </li><li> 100,000 x g&#39;de (4 ° C) 1 saat süre ile santrifüj. Dört katmanları üst alttan, görünür olmalıdır: (1) sert açık pelet, ribozomal kompleksleri içeren; (2) Yumuşak lipid bakımından zengin pelet; (3) hücre çözünür proteinler ve komplekslerinin en ihtiva eden bir büyük, açık san bir hafif boyanmış tabakası; ve (4) bir &#39;pullu&#39; üst tabaka lipidlerin oluşturduğu. </li><li> Tüm s gerçekleştirinSoğuk oda (4 ° C) ubsequent adım. 1 ml pipet kullanarak mümkün olduğunca üst &#39;pullu&#39; lipit tabakasının kadar çıkarın ve atın. sarı, berrak tabakanın en kurtarmak için 10 ml serolojik pipet kullanın. </li><li> Alt iki tabaka rahatsız etmemek için 1 ml bir pipet kullanarak bu katmanın son birkaç ml kurtarma. 40 g ıslak hücre topağından, orta tabakanın, yaklaşık 48 mi, tipik olarak geri kazanılır ve lipid tabakasının 8 mi atılır / çıkarıldı. Not: Sütun arıtma akışı büyük ölçüde aşağıda ele, aynı zamanda karmaşık kalitesini düşürebilir lipidlerin, varlığı ile engellenmektedir. </li></ol></li></ol> 2. Sütun Arıtma adım 1: IgG Kromatografi <ol><li> Reçine Dengeleme ve Bağlama <ol><li> Hücre topağı 40 g için 300 ul IgG Sepharose bulamaç hazırlanır. bulamaç pipetleme kolaylaştırmak için 1 ml pipet ucu sonu kesin. Yıkama / 5 mi IgGD150 Buffe IgG, reçineyi üç defa, her seferinde dengeR (10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 150 mM NaCI; 150 mM KCI, 1 mM MgCI2, 5 mM imidazol, pH 8;% 0.1 h / h NP-40, 1 mM DTT, 50 her bir proteaz inhibitörü tablet ml hacim). <ol><li> Spin yıkar arasında 160 xg (4 ° C) pelet ve süpernatant kaldırmak için. </li></ol></li><li> 2 saat (4 ° C), uygun bir rotator kullanılarak orta safha süpernatan ve hücrelerin 40 gramı başına iki mini proteaz inhibitör tabletleri ile IgG reçine döndürün. Bu, IgG toplu bir çözümdür. </li><li> Düz kesilmiş üretilmesi için kolonun son kesim tarafından kullanılmak üzere iki adet 10 ml poli-preparatif sütun hazırlayın. yerçekimi akışı ile sütunun paketleme ve yıkama hızlandırmak için, ~ 10 mi kolon başına IgG parti çözeltisine 25 mL, 200 paketlenmiş IgG reçine ul veya daha düşük bir maksimum yük. </li><li> sütuna IgG toplu çözüm dökün ve yerçekimi ile tortu izin verin. sedimantasyon 30 dakika daha uzun sürerse santrifüj t orta faz kurtarırken, büyük olasılıkla lipit kontaminasyonu olduUBE. </li><li> IgGD150 Tamponu dört ardışık 10 ml&#39;lik hacim ile kaplanmış kolon yıkayın. </li></ol></li><li> Sütun TEV bölünmesine <ol><li> Sütunun alt conta ve IgGD150 1 ml tampon TEV proteaz, 100 ul (0.6 mg / ml stok, TEV mutant varyantı S219V içi üretilen). Sütunun üst kapatılır ve 20 dakika boyunca (18 ° C) 750 rpm&#39;de çalkalanarak, termal bir mikser kullanılarak karıştırılır. Yeniden süspanse Reçine 1 saat inkübasyon olmak üzere toplam tekrar 20 dakika boyunca bir kez daha fazla karıştırıp. Not: en az fırınlama süresi kalması açısından çok önemlidir. </li><li> 4 ° C&#39;ye sütun dönün ve yerçekimi ile protein / kompleksi Zehir. IgGD150 Tamponu ilave 200 ul ölü hacim Zehir. </li></ol></li></ol> 3. Kolonu Saflaştırması Adım 2: Kalmoduline Afinite Kromatografisi <ol><li> Reçine Dengeleme ve Bağlama <ol><li> Hücrenin 40 g başına kalmodülin-afınite reçine 200 ul hazırlanmasıpelet. 150 mM NaCI, 10 mM KCI, 5 mi Kalmoduline Tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, bağlama ile, reçineyi üç defa, her seferinde yıkayın 1 mM MgCl2, 5 mM imidazol, pH 8; 2 mM CaCl2 0.1 hac / hac% NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol), 160 xg (4 ° C) santrifüje her bir yıkama için pelet. </li><li> her biri 1 mi IgG eluatına, Bağlama Tamponu kalmodulin 3 cilt. Sürekli kalsiyum seviyesini korumak için, CaCl2 ve β-merkaptoetanol IgG elüsyon bu bileşenlerin olmaması için hesap ekleyin. Nihai konsantrasyon 2 mM CaCl2 ve 10 mM β-merkaptoetanol olmalıdır. </li><li> Kalmodulin reçineye örnek ekleyin ve bir tüp rotator ile 1 saat (4 ° C) bağlanır. </li></ol></li><li> Paketleme ve Calmodulin Reçine yıkanan <ol><li> Düz açılış oluşturmak için sütunun sonuna keserek 100 ul Calmodulin bulamaç başına 2 ml poli-hazırlık sütun hazırlayın. co başına en fazla 100 ul Calmodulin bulamaç yükleyinörnek reçine miktarını en aza indirmek için lumn elüsyon sırasında temas. </li><li> yerçekimi tarafından sütunu Paketi ve 5 ml Calmodulin Bağlama Tamponu ile sütunda üç kez reçine yıkayın. </li><li> 150 mM NaCI, 10 mM KCI, 1 mM MgCI2, 5 mM imidazol, pH 8.0, 4 mM EGTA, pH 8,0;% 0.08 h 200 ul Kalmoduline, Seyreltme Tampon maddesi (10 mM Tris-HCI, pH 8.0 ilavesi ile proteinini ayrıştırmak / hac NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol). Calmodulin Elüsyon Buffer 200 ul altı kez eklenmesini tekrarlayın. </li><li> elüsyon 1 ila 3 için, sütun hacmi uygulamak ve hemen eluat toplar. elüsyon 4, sütunun alt conta ve 2.5 dakika boyunca yıkama tamponu ile inkübasyon ve daha sonra açmak ve yerçekimi ile elüte sağlar. elüsyon için 5, 5 dakika boyunca inkübe edilir ve akabinde açmak ve elüte. elüsyon 6 için, 10 dakika süre ile inkübe edilir ve daha sonra açmak ve elüte. Not: karmaşık bütünlüğü elüsyon arasında değişebilir / kesirler (temsilcisi sonuçları bölümüne bakınız) &lt;./ Li&gt; <li> elüsyon 2 ayrı gecede uygun bir mikro diyaliz yöntemi kullanarak 6 dialyze. Diyaliz tamponu karşı fraksiyonların Dialyze (10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 150 mM NaCI, 10 mM KCI, 1 mM MgCI2, 5 mM imidazol, pH 8, 10 mM β-merkaptoetanol). Not: NP-40 diyaliz zarı ile, hiç değilse, kayda değer geçmez. </li></ol></li></ol> 4. Post-Arıtma Analizleri Kompleks kalitesini değerlendirmek için <ol><li> Yerli Jel ve Gümüş Boyama <ol><li> üreticinin talimatlarına göre kompleksin analizi için% 16 prekast yerli jel - 4 hazırlayın. jel üzerine diyaliz Kalmoduline elüsyon / parçalardan her biri, uygun bir molekül ağırlığına sahip protein standardı ve yük 15 ul kullanın. </li><li> Yaklaşık 3 saat (4 ° C), 150 V de jel Electrophorese. </li><li> Gümüş, altı elüsyon her kalitesini değerlendirmek için jel leke. Alternatif olarak, eşit hassas ticari kullanımıfloresan leke (ler). Bu aşamada, kompleksin konsantrasyonu Mavi Coomassie lekelemesi için saptama seviyesinin altında en olasıdır. </li></ol></li><li> Ek Jel Analiz Yöntemleri <ol><li> Western blot protein tespit etmek için SDS veya yerel PAGE ile kompleks çözmek ve daha sonra üreticinin talimatlarına uygun olarak TAP etiketi antikor kullanarak Calmodulin Binding Peptide (CBP) epitop için jel prob. </li><li> Belirli bir floresan boya (lar) kullanılarak, TAP saflaştınldı karmaşık varlığı ve protein ve / veya nükleik asit bütünlüğünü onaylamak. Hiçbir spektral örtüşme bu lekeler arasında tespit edildiği dikkat ediniz. </li></ol></li><li> Negatif Leke Elektron Mikroskobu Görselleştirme <ol><li> Karmaşık uygulama 30 dakika içinde, parlayan taburcu 30 saniye boyunca -15 mA sürekli karbon ızgaraları kullanın. </li><li> ızgaraya (tipik olarak 1 nM&#39;lik bir konsantrasyonda) TAP saflaştınldı kompleks 3 ul uygulanır. Bir dakika boyunca inkübe. Leke fFazla tampon kaldırmak için ızgaranın yan rom. </li><li> iyonu giderilmiş su, 20 ul damlalar ile iki kez yıkanır. yıkar arasında yan leke. </li><li> 50 ul negatif leke damlasına kadar ızgara uygulayın ve bir dakika inkübe edilir. uranil asetat (% 2) ya da uranil format (% 0.75) ile boyama önerilir. Dikkat: Uranil tuzları ve çözümleri zayıf radyoaktif ve ağır metal içermez. Bu bakım ve kurumsal önerilen atık yönergeleri izleyerek atılmalıdır bu çözümler ile temas tüm malzeme ile ele alınmalıdır. </li><li> blot olmadan taze bir 50 ul negatif leke damlasına kadar ızgara uygulayın. Bir dakika sonra yan blot inkübe ve nihayet kuru hava ve görselleştirmek. </li></ol></li><li> Cryo Elektron Mikroskobu (cryo-EM) Görselleştirme <ol><li> optimizasyon gerekli olabilir ama üreticinin protokolüne göre, TAP saflaştınldı kompleksi ile kriyo-EM gerçekleştirin. Not: deterjan Durum yüksek konsantrasyonlarda ma aty ilerlemeyi engelleyen ve aşağıda ele alınmıştır. </li></ol></li></ol> 5. Karmaşık depolama <ol><li> Depolama Kompleks hazırlanıyor <ol><li> Gerekirse kompleks için uygun bir molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre kullanılarak, karmaşık konsantre edilir. İstenilen konsantrasyon ulaşana kadar 1 dk artışlarla 14,000 xg&#39;de Spin. Not: Filtre, ne de diyaliz zarından geçmez olarak NP-40 konsantrasyonu, konsantre sırasında konsantrasyon artacak. </li><li> Sıvı nitrojen ya da kuru buz içinde 30 ul alikotları kompleksi etanol banyosu soğutulur dondurma ve daha sonra -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Deterjan İsteğe Sonrası Arıtma Kaldırma </li></ol> Not: NP-40 gibi engelleyebilir veya bazı uygulamalar için ilerleme inhibe kritik misel konsantrasyonu yukarıda bir konsantrasyonda bir deterjanın varlığında. proto onun kaldırılması sonuçlarıDiğer Katkı maddeleri veya ortak-çözücü ile sütun hem de yerine aşağıda ele alınmaktadır. Resim NP-40 isteniyorsa, bir seçenek, örneğin Bio-boncuk, kaldırılması için, ticari bir uygulama kullanmaktır. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Diyaliz tampon maddesi içinde önceden dengelenir ticari olarak temin edilebilen bir deterjan emici boncuklar. (Genellikle 10 nM konsantrasyonda) kompleksinin 30 ul başına beş boncuk karıştırın. </li><li> Buz üzerinde 15 dakika musluk saflaştınldı kompleksi ile Aşama 5.2.1 arasında dengelenmiş boncuk inkübe edin. deterjan çıkarılmasını takiben bir kaç saat içinde karmaşık kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes.">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+A+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+recombinant+proteins+fused+to+calmodulin+or+to+calmodulin-binding+peptides.">Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides.</a> Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).</li><li>Braisted, A. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+a+binding+domain+from+protein+A.">Minimizing a binding domain from protein A.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Nallamsetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+processing+of+fusion+proteins+by+tobacco+vein+mottling+virus+protease+in+vivo+and+in+vitro.">Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro.</a> Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Howson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction,+verification+and+experimental+use+of+two+epitope-tagged+collections+of+budding+yeast+strains.">Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains.</a> Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).</li><li>Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells.</a> Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).</li><li>Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+partners+of+acyl+carrier+protein+detected+in+Escherichia+coli+by+tandem+affinity+purification.">New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification.</a> FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).</li><li>Tharun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+analysis+of+the+decapping+activator+Lsm1p-7p-Pat1p+complex+from+yeast.">Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast.</a> Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).</li><li>Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+method:+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification.">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy.">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Gottschalk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+U1+snRNP+reveals+five+novel+proteins.">A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins.</a> RNA. 4 (4), 374-393 (1998).</li><li>Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+proteins+of+the+yeast+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+by+mass+spectrometry.">Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).</li><li>Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+purification+of+a+stable+form+of+recombinant+tobacco+etch+virus+protease.">Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease.</a> Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

TAP yöntemi sıkı ve seçici fizyolojik çözelti Koşullar korumak için bir arzu bir afinite reçineye bağlanmak için bir dengelemeye iki etiket kullanılmaktadır. Bu denge sonrası arıtma karakterizasyonu için faktör (ler) etkileşime ile etiketli protein istikrarlı etkileşimi (ler) korumak için hizmet vermektedir. Buna ek olarak, bireysel TAP biri herhangi bir maya kompleksi için etiketli protein ile herhangi bir maya suşu elde edebilirsiniz, böylece Orfs, ticari bir kaynaktan temin edilebilen etiketledi. Bir kompleks bütünlüğü ve saflaştırılması için bir kompleks içinde farklı takılı protein alt birimlerinin kullanımını test etmek için bir kaynağın kullanılabilirliğini korunması yerli kompleksi saflaştırılması için TAP yöntemi kullanılarak iki avantajı vardır. Ancak, özgün TAP yöntemi protokolünün kompleksi saflaştırılmış bileşim açısından ve yapısal olarak homojen olduğundan emin olmak için tasarlanmış değildi. Bu hedefe ulaşmak için, yukarıda açıklandığı gibi TAP Bu yüzden, yöntem, modifiye edilmiştir. ÇeşitliTAP yöntemi adımlar bileşimini ve yapısal homojen kompleksi arındırmak için en uygun yaklaşım ve şartlarını oluşturmak için değerlendirildi. Erken kritik bir adım hücre parçalanması olduğunu. Yani, homojen, elde edilen kompleks, yüksek kalitede olduğunu sigortalanması ise bu adım, yüksek verim ve dolayısıyla maksimum parçalanması kişinin arzusu arasında bir denge gerektirir. yokedici maya hücreleri farklı yaklaşımlar bir boncuk çırpıcı, yüksek sırf sıvı işlemci ve bilyalı değirmen kullanarak da dahil olmak üzere, araştırıldı. daha az pahalı kahve değirmeni kullanılması, alternatif yöntemlere göre daha az etkili oldu (40-60 liziz% &#39;si), fakat bu yaklaşımların pek çok ya da karıştırmayı partikül bütünlüğü ya toplanmasının bir ölçüde neden olduğu ortaya çıktı ise izole edilmiş karmaşık ve saflaştırılmış tek dağılımlı ortaya çıktı. Yüksek kaliteli kompleksi elde edilmiştir sağlayacak şekilde sonunda, hücrelerin önemli bir kısmı parçalanır değildi. 40 iken -% 60 lizis maya U1 snRNP için ideal bir için bu protokolü uygulanırken, optimizasyon önerilmektedir<html> yeni biyolojik kompleksi. Kompleks bütünlüğü seyreltme sonucunda hücresel proteazlar, alt birim ayrışma ile değişmediğini sağlamak için arıtma acele olabilir yöntem adımları belirlemek için kritik ve TEV proteaz bölünme sırasında 18 ° C &#39;de inkübasyon genişletilmiş. Zaman verimli saflığı elde etmek için basit bir adım lipitleri yerçekimi saflaştırılması sırasında akışını engellememek beri lipidler, erken lizat açıklama arta taşımak yoktu sağlamak oldu. Diğer adımlar verimli arınma ve maksimum su akış hızı elde etmek için bir miktar reçine ve sütun boyutu / boyutların optimal dengesini tanımlayan dahil. Özellikle kritik bir adım TEV proteaz tarafından sütun bölünme üzerinde süresini azaltmak oldu. Kullanılan TEV proteaz bilgilerini ve yüksek konsantrasyonda 17&#39;de oldu proteaz / nükleaz sağlamak için evde saflaştırılmıştır. TEV proteaz önemli miktarda altında bir saat tam bölünme elde etmek için kullanıldı. İlk TAP saflaştırma proteoliz olarak ontent &quot;&gt; gözlendi. saflaştırma esnasında Proteoliz, verimli çalışma inhibitörlerinin bir pil ekleme ve arıtma yüksek tuz yıkama dahil olmak üzere sınırlı olabilir. arınma ilk yarısında verilen proteaz inhibitörlerinin geniş bir yelpazede büyük ölçüde TAP stabilitesi protein ve kompleks etiketli geliştirmiştir. Buna ek olarak, proteoliz hücre lizizi ve arıtma için IgG adımlar sırasında 300 ila 500 mm arasında tek değerli konsantrasyonunu arttırarak azaltılmıştır. Hatta dokunun yöntemi yukarıda modifikasyonlarla, art arda yıkandı, bileşimsel homojenliğinin dereceleri değişebilir CBP afinite reçinesi kapalı fraksiyonlar. Bu nedenle, ikinci bir CBP kromatografi aşamasından elde edilen parçaların seçici havuzu, garanti edilir. özel bir odak noktası alınan TAP metodun bir cephesini kompleksi saflaştırma ve CMC üzerindeki bir konsantrasyonda iyonik olmayan deterjan NP-40 önemi idi. NP-4 varlığı% 0.08 veya daha yüksek bir konsantrasyonda 0 kompleks bütünlüğü ve son verimi üzerindeki faydalı etkisi vardı. NP-40 belirgin faydalı etkisi (ler) bir reçine ve karmaşık arasındaki spesifik olmayan etkileşimleri azalttığını kısmen bağlı olabilir. NP-40 saflaştırılması sırasında yararlı bir etkiye sahip gibi görünmektedir da, karmaşık toplama neden olmadan ikinci temizleme kaldırılabilir. Son olarak, yapısal çalışma için TAP yöntemi optimize kritik kompleksinin bütünlüğü ve homojenliği değerlendirmek için kullanılan çeşitli tamamlayıcı deneyler vardı. Bunlar ışık saçılması, SDS ve yerli PAGE Western blot ve / veya floresan boya ile boyanmış, hem de negatif bir leke elektron mikroskobu ile TAP antikoru kullanılarak sondalandı. Burada detaylı TAP yöntemiyle yapılan değişiklikler, elektron mikroskobu için yeterli miktarlarda bir homojen kompleksi ortaya çıkarılmıştır. özellikle de bir caydırıcı ek değişiklikler diğer kompleksler için TAP yöntemle yapılabilir gerekebilirNP-40 önemi ermesi. Özet olarak, TAP saflaştırma yöntemi başarılı bir şekilde, yapısal çalışma için uygun kalitede bir ökaryotik kaynağından makromoleküler kompleksler saflaştırmak için kullanılabilir. Bu S. saflaştırılması için uygun bir yaklaşım kurduk cerevisiae U1 snRNP ve detay bu değişikliklerin birçoğu gerekçesi yanı sıra atılan adımlar. Diğer kompleksleri için, araştırmacı benzer yeterli miktarda ve karmaşık kalitesini verebilir protokol adımları denemenizi öneririz. muayene edilmelidir adımlar hücre parçalama, tuz ve katkı tipi ve deterjan içeren konsantrasyonlarını ve kalsiyum ve metal şelasyon EGTA kompleksin duyarlılığını içermektedir. Dahası, bu karmaşık yapıyı perturbing olmadan donmuş ve çözülmüş olabilir uzun vadeli çalışmalar için kritik önem taşımaktadır. Önemli bir şekilde, tek bir kompleks yapısını analiz etmek için çeşitli alternatif yollar sırasında ve arıtma aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır. yerli birnd SDS PAGE, negatif leke EM, ve ışık saçılması en TAP yöntemi kullanılarak homojen bir kompleks arındırmak için nasıl bizim soruşturma bize iyi hizmet etmiş.

Birçok önemli hücresel süreçler büyük protein ve protein-RNA kompleksleri 1 tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu tür komplekslerin biyo-fiziksel ve yapısal çalışmaları yapmak için önemli bir engel, uygun bir kalite (yani, homojen) ve uygun bir konsantrasyonda onları elde edilir. doğal bir kaynağından, bir kompleks izole alt birimlerin ilgili transkripsiyon sonrası ve / veya translasyonel modifikasyonlar tutma ve uygun karmaşık bir düzenlemesini sigortalanması dahil olmak üzere birçok avantajı vardır. Ancak, büyük hücre kompleksleri düşük kopya sayısında sık sık, bir hücrede mevcut olan ve arıtma için yüksek verimli olması ve karmaşık bütünlüğü korunmasını sağlamak için, yaklaşık olarak fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilmelidir. bir ökaryotik kaynaktan bir kompleks Arındırıcı özellikle zor ve mali engelleyici olabilir. Bu nedenle, verimli ve homojen bir kompleks elde stratejileri veya yöntemleri çok arzu edilir. olmuştur bir stratejionların ilk karakterizasyonu için ökaryotik hücrelerden yerli kompleksleri arındırıcı başarılı Tandem Affinity Arıtma (TAP) yöntemi 2,3 olduğunu. TAP yöntemde, faktör (ler) 2 etkileşim ile kompleks olarak çiçek mayası (S. cerevisiae) bir yerli proteini saflaştırmak için geliştirilmiştir. TAP yöntem iki etiket, aynı protein kodlayıcı gen sekansına tandem kaynaşık her etiket kullanılmaktadır. Sıkı ve seçici fizyolojik çözelti Koşullar korumak için bir arzu bir afinite reçineye bağlanmak için bir ihtiyaç dengelemek üzere etiketler seçilmiştir. Bu denge sonrası arıtma karakterizasyonu için faktör (ler) etkileşime ile etiketli protein istikrarlı etkileşimi (ler) korumak için hizmet vermektedir. etiketli biraz üzerinde 20 kDa&#39;lık bir ek - genomik dahil TAP etiketi sonunda yerleştirildi ve protein kodlama geninin (-terminal, C) Protein A ve ardından peptit (CBP) bağlanması bir kalmodülin kodlayan bir sekans oluşuyordu protein. CBP 2, kısa6 amino asit ve tanıdığı ~ 17 kDa proteini Kalmoduline 10 -9 sırasına M 4 bir KD ile kalsiyum mevcudiyetinde (CAM). Protein bir etiket tekrarlar arasında kısa bir bağlayıcı ile 58 kalıntıları arasında, iki tekrarlardan meydana gelen daha büyüktür. Her 58 amino asit tekrar K D ~ 10 -8 M 5 ile immünoglobulin G (IgG) tarafından kabul edilmektedir. Bu iki etiketin arasında TEV proteaz, Tütün Etch Virüsü 6,7 arasında bir endopeptidaz için bir tanıma sitesi dahil edilmiştir. TAP protein etiketli yöntemin birinci afinite aşamasında Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, etiketli protein TEV proteaz, özellikle de site arasındaki yaran ilave üzerinde kolon bölünmesine elüe edilir Protein A ile bir IgG reçineye bağlı iki etiketleri. Bu IgG etkileşimi olarak gerekli bir adımdır ve Protein Çok güçlü ve sadece yeterli denatüre çözüm koşullarında tedirgin olabilir. Bir Pr eksikBir etiket otein protein kalsiyumun varlığında cam reçinesine bağlanır ve metal iyonu kenetleyici, EGTA (etilen glikol tetraasetik asit) (Şekil 1) ek olarak, bu reçineden yıkandı. TAP yönteminin tanıtılması, bu üretmek için büyük çaplı bir çalışmada kullanılan kısa bir süre sonra bir S. karmaşık etkileşimlerin &#39;harita&#39; cerevisiae 8. Daha da önemlisi, bir bu çabanın tüm maya-TAP Etiketli Açık Okuma Çerçevesi (ORF) kütüphane sonucu yanı sıra bireysel TAP olarak 9 ticari bir kaynaktan temin edilebilir ORF etiketledi. Bu nedenle, tek bir herhangi bir maya kompleksi için etiketli bir protein ile bir maya suşu elde edebilir. TAP yöntemi de dahil olmak üzere, tadilatları ya da TAP etiketinin varyasyonları, teşvik: diğer ökaryotik hem de bakteri hücreleri 10,11 komplekslerin saflaştırılması için kullanımı; Protein A ve CBP farklı proteinler 12 üzerine yerleştirildiği bir &quot;bölünmüş&quot; etiketine, tasarımı; ve taBöyle Ca 2+ veya EGTA 13 kompleksin duyarlılık olarak, araştırmacının ihtiyacı karşılamak amacıyla gs değişti. Her iki enstrümantasyon ve metodoloji son gelişmeler makromoleküler kompleksleri 14 atom çözünürlüklü görüntülerden yakın, yüksek yol açmıştır yapı tayini için elektron mikroskobu (EM) uygulamasında önemli ilerlemelere yol açmıştır. EM bir kompleks elde çözünürlük, ancak, çalışma kapsamında kompleksinin kalitesi üzerine şarta kalır. Bu çalışma S&#39;den arındırmak için TAP etiketi yaklaşımını kullanmaktadır cerevisiae U1 snRNP, spliceosom 15,16 bir parçası olan bir 18-alt-birimi (-0.8 MDA), düşük kopya sayısı ribonükleoprotein kompleksi. bir dizi adım bu homojen ve yeterli bir konsantrasyon olacak şekilde bu karmaşık saflaştırmak için alınmıştır. arıtma için çeşitli aşamalarında karşılaşılan potansiyel problemler açıklanmıştır ve stratejiler Chall aşmak için alınanEnges vurguladı. dikkatle değerlendirilmesi ve saflaştırma adımları optimize ederek, U1 snRNP saflaştırılmış bir kalite ve olumsuz leke için uygun ve elektron mikroskopisi cryo (cryo-EM) çalışmaları bir miktarda yer almaktadır. Yapısal çalışmalar için yerel komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiş bir TAP yöntemi protokolü, burada tarif edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>S. cerevisiae TAP tagged strain</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3&amp;Delta;1, leu2&amp;Delta;0, met15&amp;Delta;0, ura3&amp;Delta;0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Coffee grinder</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Used for cell lysis</td></tr><tr><td>Hemocytometer, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Used to assess cell lysis</td></tr><tr><td>JA 9.100 centrifuge rotor&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to harvest the yeast cells</td></tr><tr><td>JA 20 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material</td></tr><tr><td>Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to further clear the soluble cell extract</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Temperature controlled shaker</td></tr><tr><td>Novex gel system</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG resin</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6 fast flow</td></tr><tr><td>Calmodulin resin</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Affinity resin</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, mini tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, large tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Dissolved in isopropanol</td></tr><tr><td>2 ml Bio-spin column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7326008</td><td>Used to pack and wash the Calmodulin resin</td></tr><tr><td>10 ml poly-prep column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Used to pack and wash the IgG resin</td></tr><tr><td>Precast native PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>NativeMark protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 &amp;mu;l for a silver stained gel and 5 &amp;mu;l for a SYPRO Ruby stained gel</td></tr><tr><td>Precast SDS PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Unstained protein standard used for Western blotting</td></tr><tr><td>SDS running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS Buffer</td></tr><tr><td>TAP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Primary antibody against CBP tag</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dialaysis units</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td></tr><tr><td>Centrifugal filter units, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td></tr><tr><td>Detergent absorbing beads</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2 absorbants</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>Molecular Probes</td><td>S-12000</td><td>Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm</td></tr><tr><td>Copper grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of native complexes for structural study using a tandem affinity tag method

Affinity arıtma yaklaşımları proteomik karakterizasyonu için yerli kompleksleri izole başarılı olmuştur. Yapısal heterojenite ve bir kompleksin kompozisyon heterojen bir derecesi genellikle bu tür çalışmalar yürüten ilerleme engel olmaz. Bunun aksine, yapısal karakterizasyon için amaçlanan bir kompleksi hem de içerik olarak ve yapısal olarak homojen olarak proteomik için gerekli olandan daha yüksek bir konsantrasyonda bir halde arındırılmalıdır. Son zamanlarda, büyük makromoleküler kompleksler yapı tayini için elektron mikroskobu uygulamasında önemli ilerlemeler olmuştur. Bu elektron mikroskobu ile yapısal tespiti için yeterli nicelik ve nitelikte yerli kompleksleri arındırmak için yaklaşımlar ilgi artırmıştır. Tandem Affinity Arıtma (TAP) yöntemi 18-altbirim ayıklamak ve arındırmak için optimize edilmiştir, ~ tomurcuklanan maya 0.8 MDa ribonükleoprotein montaj (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; negatif leke ve elektron cryo mikroskopi için uygun. Burada TAP yöntemiyle, bu değişiklikleri yapmak için gerekçesi yapılan değişiklikleri detaylı ve yaklaşımlar bir kompozisyon yönünden ve yapısal homojen kompleks için tahlil alınır.

Değiştirilmiş bir TAP yöntemi S&#39;den saflaştırmak için kullanıldı U1 snRNP, 18 alt birim ribonükleoprotein kompleksi cerevisiae&#39;de. Yayınlanmış bir protokol 2,3 takiben kompleksin bir başlangıç ​​TAP saflaştırma gümüş üç grup ana poliakrilamid jel (Şekil 2A) boyanmış şekilde göç heterojen çıktı bir kompleks elde edilmiştir. TAP yönteminin optimizasyonu birden fazla tur, daha homojen bir montaj (Şekil 2A) gösteren bir yerli jeli üzerinde, temelde tek bir bant geçirilmiş bir kompleks elde edilmiştir. Floresan boyalar kullanılarak protein ve nükleik asit hem de leke, saflaştırılmış kompleksi iki biyopolimerlerin mevcut olan (Şekil 2B) sahip olduğu tespit edilmiştir. Saflaştınldı kompleksi de SDS PAGE ve bir musluk takı antikoru (Şekil 3A) kullanılarak Batı beneklemesi ile analiz edilmiştir. Nati tutarlıJel sonucu ziyaretinde yayınlanan protokole göre saflaştırılmıştır kompleksi TAP proteolizi protein (Snu71) etiketli sergilemiştir. proteoliz miktarı, ancak önemli ölçüde TAP Yöntemin değişiklikleri ile indirgendi. Hemen hemen tüm U1 snRNP karmaşık yedi proteinlerinin SDS-PAGE ile çözülmüş ve pozitif MALDI kütle spektrometrisi (Şekil 3B) ile belirlenmiştir. Yanı sıra yerli ve SDS PAGE gibi karmaşık kalite negatif leke elektron mikroskobu (Şekil 4) ile saflaştırma farklı aşamalarında değerlendirildi. 4C den Şekil 4A ve B gözlenen ama yok tekil dağılımlı parçacıkların yapısal çalışma için iyi bir örnek örnektir. Bu analiz yöntemi TAP yöntemi değişikliklerin etkisi açısından kritik bilgiler verdi. TAP yöntemi iyonik olmayan deterjan NP-40 dahil edilmesi ve konsantre aramalarıkritik misel konsantrasyonu (CMC) ve yukarıda entration. Protokolde tarif edilen kompleks kalitesinin değerlendirilmesi için yöntemler sağlamlığı iyi zitteriyonik sürfaktan CHAPS, gliserol ya da birlikte-çözücü NP-40, tüm tamponlar içinde (Şekil 5) ile ikame edilmiş bir deneyle gösterilmiştir. doğal PAGE ve negatif Leke EM U1 snRNP Resim ko-solvent ilave etmek gliserol CHAPS&#39;a stabilite azalan NP-40 en çok homojen ve stabil görünmektedir. Bu maya U1 snRNP bir hidrofobik yüzü ve bu yüzey kaplayarak NP-40 önler agregasyon varlığı olduğu olabilir. Ne yazık ki, NP-40 diyaliz ile kaldırılamaz ve karmaşık konsantre sonra NP-40 yoğunlaşacaktır. yüksek NP-40 kompleksini karıştırmayı görünmedi iken, olumsuz gözlendi cryo-EM ve büyük misel benzeri agrega için vitreus buz parçacık donmasını etkisi saptanmamıştır. Deterjan emici boncuklar r başarılı bir şekilde kullanıldıaldır yapısal kompleksi etkisi görünmeden NP-40 U1 snRNP örnek çoğunluğu. Parçacıklar ve ayırt edici Örnek sınıf ortalamaları (Şekil 6) çim görüntü ile kanıtlandığı gibi protokol negatif leke ve kriyo-EM hem kompleks müsait detaylı değişiklikler ile kompleks saflaştırılmasını takiben, elde edilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig1.jpg" /> Şekil Tandem Affinity Arıtma (TAP) yönteminin 1. Genel Bakış. (A) iki aşamalı TAP yönteminin şematik. Çevrede (gri) kompleks TAP (siyah, U1 snRNP alt biriminin Snu71) alt birimi etiketli içeren genomik bir kalmodülin-bağlama peptidi içeren bir dizi ile kaynaşık (CBP, yeşil), site-spesifik proteaz için bir tanıma alanı, TEV (mavi), ve iki IgG (Pr, bir protein A bağlanma bölgeleri<html> , Kırmızı). 1. adımda, hücre lisatı, bir IgG reçinesi ile inkübe edilir ve kompleks protein dizisi ile etkileşimi ile tutulur. Karmaşık TEV aracılı bölünme ile reçineden serbest bırakılır. 2. aşamada, kompleks, bir Kalmoduline reçine, Ca2 + bağımlıdır reaksiyonu ile inkübe edilir. Karmaşık Ca 2 + kenetleme maddesi EGTA ilave edilerek serbest bırakıldı. Bir TAP, aşağıdaki (B), bir Western blot (A) &#39;da gösterildiği saflaştırma adımları protein etiketli. Örnekler 1 aşamasından sonra, hücre lizatının alındı ​​ve TAP yöntemin 2. adımından sonra bulundu. Hücre lizatı gözlenen reaktif protein TEV proteaz bölünme ve Protein dizisi böylece kaybı sonrasında, 1 aşamasından sonra hızlı göç eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54389/54389fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ure 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54389 / 54389fig2.jpg &quot;/&gt; TAP Yöntemi 2. Optimizasyonu Şekil. (A), gümüş TAP saflaştırılmıştır komplekslerin yerli jel boyandı. Doğal PAGE: protein standardı (şerit 1); Karmaşık orijinal TAP yöntemiyle 3 (şerit 2) göre saflaştırılmış, üç bant gözlendi (ok başları); tampon değişiklikler aşağıdaki aynı TAP saflaştırma üç ardışık elüsyon, iki bant (ok başları) (kulvarlar 3-5) gözlenen; temel olarak ~ 800 kDa&#39;da göç tek bir kompleks bant (kuşak 6) elde TAP yöntemine daha fazla değişiklik,. (B) saflaştınlmış kompleks bileşiminin analizi, protein ve RNA reaktif lekeleri her ikisi de tek birjel yolunda boyanarak. Doğal PAGE: bir protein floresan boya ile boyanmış protein standardı (şerit 1); kompleks protein floresan leke (şerit 2), gözlenen iki grup ile görüntülendi; Şerit 2&#39;de, aynı şerit, hemen bir nükleik asit floresan boya (yol 3), iki bant gözlenmiştir ile görüntülendi; ve üzeri flüoresan sinyalşeritli 2 ve 3 (şerit 4) lekeli kompleksin yatıyordu. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54389/54389fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54389/54389fig3.jpg" /> TAP Yöntemi 3. Optimizasyonu Şekil. (A) kompleksi kalitesinde iyileşme Western blot analizi aşağıdaki TAP alt birimi Snu71 α-Tap antikoru ile sondalandı etiketli. Çeşitli proteolizlenmiş bantları (yol 1), başlangıçta görebilir ama gelişmeler önemli ölçüde daha düşük bantların bir miktar (kulvarlar 2 ve 3). (B), bir flüoresan protein jel boyası ile boyanmış bir Örnek SDS jel azaltır. Jel kompleksinin 17 protein alt birimlerinin 12 giderir. Bantlarında protein Kimlik kütle spektrometresi tarafından kurulmuştur. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54389/54389fig3large.jpg" target="_blank">Bir larg görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın er sürümü. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54389/54389fig4.jpg" /> . Karmaşık sonrasÖ negatif leke elektron mikroskobu ile Negatif Leke Elektron Mikroskobu Değerlendirmesi tarafından Değerlendirilen TAP Yöntemi Dönemlerinde Şekil 4. Örnek Kalitesi: (B) TAP 2. adımı (A) TAP 1. basamak (C ) kompleksi istikrarsızlaştırdı. Ölçek çubuğu, 125 nm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54389/54389fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54389/54389fig5.jpg" /> TAP Yöntemi Tamponlar Bugünü Katkı Numune Kalitesi Şekil 5. Etki Lanes 1 -. 4 c TAP arıtma nihai ya da 2. aşamasının ilk dört elüsyon vardırmevcudiyetinde saflaştırılmıştır omplex: (A), iyonik olmayan bir deterjan nonil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), yerel PAGE (üst) ve negatif Leke EM (alt) ile analiz, (B), zvitteryonik deterjanın 3 - [(3- yerel PAGE (üst) ve negatif leke EM (alt) analiz (Cı) gliserol, nativ PAGE (üst) ve negatif leke EM (alt) analiz kolamidopropil) -dimetilamonyo] -1-propansülfonat (CHAPS); ve doğal PAGE (üstte) ve negatif leke EM (altta) ile analiz (D) hiçbir katkı maddesi. Ölçek çubuğu, 50 nm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54389/54389fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54389/54389fig6.jpg" /> TAP Yöntemi Şekil 6. Görselleştirme Kompleksi Arıtılmış. (A) Üst, negatif leke elektron mikroskobik bir temsili resimpy (EM) mikrografı. benzer şekilli parçacıkların bir çim gözlenen iki optimize TAP yöntemiyle arıtılmış, kutulu edilir. Alt, parçacık ayırt edici özelliklerini vurgulamak parçacıkların alınan sınıf ortalamalarının bir seçim. Ölçek çubuğu, 50 nm. (B) Üst, bir cryo-EM mikrografı temsili bir görüntü. kutulu iki tür bölgeleri görmek Gözlemlenen, parçacıkların yüksek kontrast temsilcisi bölgelerdir. vitreus buz dondurulmuş seçilmiş parçacıkların alt sınıf ortalamaları. Ölçek çubuğu, 50 nm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54389/54389fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method at JoVE.com

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Görüntüleme.  Brandeis University. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies. 

Video: Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Biyokimya

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>His etiketli FEN1 proteininin verimli bir şekilde saflaştırılması için FPLC'nin optimize edilmesi

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: His Etiketli FEN1 Proteini için Afinite Kromatografisini Optimize Etme

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Biyoloji

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Protein Kompleksi belirlenmesi

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu