Name: functional characterization of regulatory macrophages that inhibit graft-reactive immunity
Uploaded: 2017-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity at JoVE.com

Mount Sinai&#39;deki Araştırma Mükemmellik Akım Sitometresi, Mikrocerrahi ve Biyo-depo / Patoloji Merkezlerinin teknik katkılarını kabul ediyoruz. Bu çalışma, COST Action BM1305: Hücre Tolerojenik Tedavilere Odaklanma ve İyileşme Eylemi (A FACTT), Mount Sinai Recanati / Miller Transplantasyon Enstitüsü kalkınma fonları, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R ve SAF2016-80031-R tarafından desteklenmiştir. JO

<html> Bu çalışmada fareler, Birleşik Devletler Tarım Bakanlığı yönergelerine ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Halk Sağlığı Hizmeti Kılavuzu&#39;nun önerileri uyarınca yerleştirildi. Hayvan kullanımını içeren tüm deneysel teknikler, Sina Üniversitesi Tıp Fakültesi&#39;nin onaylı protokolleri olan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca gerçekleştirildi. 1. Medya Hazırlığı <ol><li> 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM zorunlu olmayan amino asitler, 5 mM HEPES ve 0.05 mM 2 kullanarak,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (10,000 U / mL) ile komple RPMI 1640 ortamı hazırlayın. mersaptoetanol. </li></ol> 2. Allograft İzolasyon ve Tek Hücreli Süspansiyon NOT: Pulmoner arter ve inferior kava veninin transplantasyon ve anastomoz tekniği başlangıçta Corry ve işbirlikçileri tarafından tanımlanmıştır ve Liu ve Kang&#39;da görselleştirilebilirS = &quot;xref&quot;&gt; 10 , 11 ( Şekil 1A ). <ol><li> Bir indüksiyon odasında% 4-5 izofluran içeren bir fare anestezisi. Servikal dislokasyonla onu kurban edin. </li><li> Standart makasla orta hat abdominal insizyon yapın ve aorta lokalize etmek için abdominal içeriği kaldırın. NOT: Transplante kalp, alıcı abdominal aortanın sağ tarafında olacaktır ( Şekil 1B ). </li><li> İnce keskin dişli forseps kullanarak yavaşça grefti çekin ve hemen buz gibi RPMI ortamına yerleştirin. NOT: Grefti aorta ayırmak için bir ameliyat makasının kullanılması grefte zarar verebilir ve bazı dokuların alıcının üzerine yapışmasına neden olabilir. </li><li> Tüm greftler toplandıktan sonra, doku işleme için steril bir kültür başlığına taşıyın. Grefti bir petri kabına yerleştirin ve steril, kütik, mikrocerrahi makası kullanarak dokuyu küçük parçalara (1 mm) zar atın. </li><li> Keskin dişli forc ileEps, parçaları 5 mL kollajenaz A (steril 1x PBS&#39;de 0.1 mg / mL kollajenaz) ile 50 mL&#39;lik bir tüpe aktarın. 37 ° C&#39;lik bir banyoda 1 saat inkübe edin. </li><li> Kollajenazı nötralize etmek için 1 mL&#39;lik bir şırınganın pistonu yardımıyla 100 μm&#39;lik süzgeçle numuneyi aktarmak için 5 mL&#39;lik RPMI ortamı ekleyin. </li><li> Numuneyi 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de döndürün. </li><li> Pelleti 1 mL ACK liziz tamponuna tekrar süspanse edin. İyi karıştırın ve 4 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. </li><li> Liziz tamponunu nötralize etmek için 1 mL RPMI ortamı ekleyin ve numuneyi 4 ° C&#39;de 5 m süreyle 400 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> RPMI ortamı 200 mcL hücre pelletini süspanse edin ve 5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüp aktarın. NOT: Polipropilen tüpler daha az yapışmayı destekler. Ayrıca, hücreleri 4 ° C gibi düşük sıcaklıklarda tutmak, yapışmayı azaltır. </li></ol> 3. Fluoresansla aktive edilmiş Hücre Sıralamasını Kullanarak Greftle Sızma Makrofajlarının İzolasyonuing <ol><li> Fc reseptör bloke edici mAb (sıçan anti-fare CD16 / 32) kullanarak miyeloid hücreler üzerindeki istenmeyen spesifik bağlanmayı bloke edin. Yüzey boyamadan 15 dakika önce örnek başına 1-2 μL ekleyin. </li><li> Anti-fare CD11b Percp / Cy5.5 (RPMI ortamında 0.6 μg / μL son konsantrasyon), anti-fare CD45 APC / eFluor780 (0.6 μg / μL), anti-fare Ly6C APC (2 μg / μL) Ve anti-fare Ly6G Pe / Cy7 (2 ug / ml). Floresan antikorları ışığa karşı korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 45 dakika boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında tüpleri inkübe edin. NOT: Tek leke dengelemeleri için negatif bir kontrol tüpü (leke yok) ve flokromların her biri ile tek tek etiketlenmiş hücreler içeren tüpler hazırlayın. Kapıyı ayarlamaya yardımcı olmak için, izotip kontrolleri özellikle Ly6C (IgG2a) ve Ly6G (IgG2b) için kullanılabilir. </li><li> Hücreleri RPMI ortamı ile iki kez yıkayın ve 400 xg&#39;de 5 dakika süreyle 4 ° C&#39;de döndürün. Tripan mavisi ve hemositomet kullanarak hücreleri sayın.R ve 1 x 10 6 hücre başına 1 mL RPMI ortamında seyreltin. Sınıflamadan önce, numuneleri 5 mL, 70 μm hücre süzgeç borusu başlığı ile aktarın. Bir hücre yaşayabilirlik markörü olarak DAPI (1 μg / mL) ekleyin ve sıralama yapmaya devam edin. </li><li> Makrofajlar hassas ve kırılgan hücreler olduğundan, sıralama koşullarını 20 psi&#39;ye ayarlayın ve makrofajları 4 yönlü saflık modu kullanarak izole etmek için 100 μm&#39;lik bir meme boyutu kullanın. </li><li> Toplama tüplerini 1 mL&#39;lik RPMI ortamı ile 5 mL&#39;lik bir polipropilen tüp içerisinde hazırlayın. </li><li> Sorgulayıcı yazılımını kullanarak yeni deneyler açın ve ayarları tanımlamak için boş bir panelle boş deney seçin. </li><li> En düşük ileriye ve yan dağılım gösteren döküntüleri ve kümeleri hariç tutarak, tüm lökositlerde ileri (FSC) karşı yan dağılım (SSC) ve kapıyı gösteren bir nokta çizelgesi kurun. Bu ana kapıda, SSC&#39;yi vs. DAPI ve kapıları DAPI hücrelerinde görüntüleyen yeni bir nokta çizelgesi oluşturun. <ol><li> Yeni kontrol edilen bu nüfusta reklam oluşturunCD11b&#39;yi CD45&#39;e ve kapıyı çift-pozitif (CD11b + CD45 + ) makrofajları ve nötrofilleri görüntüleyen ot parsel. </li><li> Buradan Ly6C - Ly6G görüntüleyen ve istenen popülasyonları gösteren son bir nokta çizelgesi oluşturun: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - ve Ly6C int Ly6G + ( Şekil 2 ). </li></ol></li><li> Sıralamadan sonra saflık ve hücre yaşayabilirliğini kontrol edin (&gt;% 90) ve toplama tüplerini 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 400 xg&#39;de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometreyi kullanarak hücreleri sayın ve tam RPMI ortamında istenen konsantrasyonda ( örn., 1 x 10 6 makrofaj / mL) tekrar süspanse edin. </li><li> 100 uL komple RPMI ortamı ile 96 oyuklu, yuvarlak tabanlı bir plakada oyuk başına 50 x 10 3 makrofaj. Hücreleri en az 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de rahatsız bırakmayın. </li></ol> 4. İzolatioFloresansla Etkinleştirilmiş Hücre Ayırma Kullanan T Hücrelerinin n NOT: C57BL / 6-Foxp3tmlFlv / Jn, Foxp3 (forkhead kutusu P3) genini monomerik kırmızı flüoresan proteini (mRFP) ile birlikte işaretleyen hücrelere işaret eden, X bağlantılı hedeflenmiş bir kapanmış fare suşudur. <ol><li> Adım 2.1&#39;de daha önce anlatıldığı gibi C57BL / 6 ve C57BL / 6-Foxp3tmlFlv / J (H-2b) farelerini anestezikle ve feda edin. Dalak ve lenf düğümlerini (LN: kasık, lomber, aksiller, brakiyal ve servikal) izole edin ve onları hızlıca buz gibi soğuk RPMI ortamına yerleştirin. </li><li> LN&#39;yi izole etmek için fareyi yatay bir pozisyona getirin, alttan üste doğru orta hat cilt insizyonu yapın, dikkatli bir şekilde periton keserek cildi hafifçe dışarıya yayın. Tüm inguinal, bel, aksiller, brakiyal ve servikal LN toplandığında ( Şekil 1C , kırmızı renklidir), periton kesilir ve bağırsağın sol üst tarafındaki dalağı izole eder. </li><li> Dalak ve LN&#39;yi 100 μm&#39;lik bir filtre yerleştirerek ayırın.50 mL&#39;lik bir tüpün üstünde. 1 mL&#39;lik şırınganın pistonu kullanarak, dokuyu hafifçe bastırın. Filtreyi temizleyene kadar RPMI ortamı ile gerektiği kadar çalkalayın. NOT: Her fareden alınan LN ve dalaklar, aynı tüp içerisinde bir araya getirilebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 400 xg&#39;de döndürün. </li><li> Pelleti 2 mL ACK liziz tamponuna tekrar süspanse edin. İyi karıştırın ve 4 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. </li><li> Liziz tamponunu nötralize etmek için 2 mL RPMI ortamı ekleyin. 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 400 xg&#39;de döndürün. </li><li> RPMI ortamı 200 mcL hücre pelletini süspanse edin ve 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp aktarın. </li><li> Anti-fare CD4 APC (0.6 μg / μL) ve / veya anti-fare CD8 PeCy7 (2 μg / μL) için boyayın. Floresan antikorları ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 45 dakika süreyle 4 ° C&#39;de buzdolabında tüpleri inkübe edin. NOT: Tek lekeli telafi için negatif bir kontrol tüpü hazırlayın (leke yoktur) veFlorokromların her biri ile tek tek etiketli hücreler içeren tüpler. </li><li> Hücreleri RPMI ortamı ile iki kez yıkayın ve 400 xg&#39;de 5 dakika süreyle 4 ° C&#39;de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. NOT: CFSE boya, genellikle 50 ug&#39;de karboksiflüoresein diasetat süksinimidil ester tozu olarak sağlanır. 5 mM son stok solüsyonu için bir CFSE şişesine 18 uL DMSO ekleyin ve birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> CFSE etiketi için, CD8 lekeli hücreleri, stok çözeltisinden 5 μM CFSE&#39;nin nihai bir çalışma konsantrasyonunda PBS içinde mL başına 10 6 hücreye kadar bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon haline getirin. Daha önce tarif edildiği gibi 5 dakika süreyle 20 ° C&#39;de bir banyoda inkübe edin 6 . NOT: (ÖNEMLİ ADIM) Düşük konsantrasyonda (≤10 6 / mL) hücreler için, hücrelerin, CFSE&#39;nin toksik etkilerini tamponlamak için ilave protein varlığında etiketlenmesi gereklidir. Bu nedenle, PBS% 5 FBS içerebilir. Unutmayın ki benDiom kullanılırsa, serbest amino asitler CFSE için rekabet ederek etiketleme verimliliğini düşürebilir. </li><li> CFSE&#39;yi 2 mL RPMI ortamı ile nötralize edin. 400 xg&#39;de 5 dakika süreyle 4 ° C&#39;de döndürün. 1 x 10 6 CD8 T hücre başına 1 mL RPMI orta ekleyin. </li><li> Sınıflamadan önce, numuneyi 5 mL&#39;lik tüp kapakta 70 μm&#39;lik hücre süzgeci ile aktarın. Bir hücre canlılığı markörü olarak 50 μL 1x DAPI (1 μg / mL) ekleyin ve sıralama devam edin. NOT: 1x, reaktifin diğer bileşene göre 1: 1 oranı anlamına gelir. </li><li> Çifte pozitif CD8 + CFSE + T hücrelerini izole etmek için sıralama koşullarını 20 psi ve 100 μm nozul boyutunda ayarlayın ( Şekil 3A ). </li><li> Toplama tüplerini 1 mL&#39;lik RPMI ortamı ile 5 mL polipropilen tüp içerisinde hazırlayın ve sıralamaya devam edin. </li><li> Sorgulayıcı yazılımını kullanarak yeni deneyler açın ve ayarları tanımlamak için boş bir panelle boş deney seçin. </li><li> CD4 + T hücre izolasyonu için,Dendritik hücreler gibi büyük taneli hücrelerin yanı sıra enkaz hariç, FSC&#39;yi SSC ve kapı lenfositlerini çalar. <ol><li> Bu ana kapıda, SSC&#39;yi vs. DAPI ve kapıları DAPI hücrelerinde görüntüleyen yeni bir nokta çizelgesi oluşturun. </li><li> Bu yeni kapılı popülasyonda, tüm CD4 + hücrelerini izole etmek için SSC&#39;ye CD4&#39;ü gösteren bir nokta çizelgesi oluşturun ( Şekil 3B ). Alternatif olarak saf T hücre popülasyonlarının izolasyonunu sağlamak için bir anti-CD3 mAb kullanılabilir. NOT: Tüm CD4 + T hücrelerinin küçük bir fraksiyonu (% 5-10) Foxp3 + mRFP + olmalıdır. </li></ol></li><li> Sıralamadan sonra saflık ve hücre yaşayabilirliğini kontrol edin (&gt;% 90) ve toplama tüplerini 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 400 xg&#39;de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 2x10 6 T hücre başına 1 mL eksiksiz RPMI ortamı kullanarak tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Daha önceden sıralanmış makrofajlar ile T hücrelerini kültürleyerek bastırma tahlilini oluşturun. Plaka 10 x 10 4 CD4 + T ve 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T hücrelerinin aynı oyukta 100 ul tamamlanmış RPMI ortamında eklendi. 96 saat boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de inkübe edin. NOT: Makrofajlar ve T hücreleri 1: 4 oranında kullanılmıştır. </li><li> Azid içeren tamponu temizlemek için bunları kullanmadan önce T hücre bölünmesini T hücresi etkinleştiricisi CD3 / CD28 manyetik boncuklarını 2 mL PBS içinde yıkayarak stimüle edin. Her göz başına 5 μL fare T hücresi etkinleştiricisi CD3 / CD28 boncuk ekleyin. NOT: Manyetik boncuklar, antijen sunan hücrelere benzer boyuttadır ve anti-CD3 ve anti-CD28 mAb ile birleşir ve T hücrelerinin aktivasyonu ve genişletilmesi için basit bir yöntem sunar. </li></ol>

<ol>
	<li>Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+act+as+effectors+of+tissue+damage+in+acute+renal+allograft+rejection.">Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection.</a> Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).</li><li>Oberbarnscheidt, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-self+recognition+by+monocytes+initiates+allograft+rejection.">Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection.</a> J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).</li><li>Garcia, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytic+suppressive+cells+mediate+cardiovascular+transplantation+tolerance+in+mice.">Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).</li><li>Conde, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-SIGN(+)+Macrophages+Control+the+Induction+of+Transplantation+Tolerance.">DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance.</a> Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627 (2014).</li><li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes.">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> J Vis Exp. (70), e4287 (2012).</li><li>Poujol, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+evaluation+of+lymphocyte+transformation+test+based+on+5-ethynyl-2'deoxyuridine+incorporation+as+a+clinical+alternative+to+tritiated+thymidine+uptake+measurement.">Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement.</a> J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).</li><li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li><li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D,+H-2K,+and+non-H-2+antigens+in+rejection.">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).</li><li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+heart+transplantation+in+mice.">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp. (6), e238 (2007).</li><li>Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Suppressor+Cells+in+Transplantation.">Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation.</a> Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).</li><li>Gallina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8++T+cells.">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gr-1+CD115++immature+myeloid+suppressor+cells+mediate+the+development+of+tumor-induced+T+regulatory+cells+and+T-cell+anergy+in+tumor-bearing+host.">Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host.</a> Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).</li><li>Luan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+accumulate+in+renal+transplant+patients+and+mediate+CD4(+)+Foxp3(+)+Treg+expansion.">Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion.</a> Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+immune+cell+proliferation+and+cytotoxic+potential+using+flow+cytometry.">Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, farklı murin deneysel modellerindeki diğer dokular için de geçerli olan, deneysel bir mürin kalp transplantasyon modelinde greft infiltre eden miyeloid hücre alt gruplarını immüno-karakterize eden yöntemleri tanımlamaktadır. 20 psi&#39;de düşük basınç hücreli sıralama, saf hücre alt gruplarının iyi bir verimliliğini izole etmek için tercih edilen yöntemdi. Her bir miyeloid alt kümesinin saflığını muhafaza etmek, farklı miyeloid popülasyonlar arasındaki baskılayıcı kapasitenin kesin sonuçlarını oluşturmak için kritik önem taşır. Bununla birlikte, ticari zenginleştirme kitleri gibi çeşitli lökosit popülasyonlarının izolasyonu için başka yöntemler kullanılabilir. Hücrenin ilgi odağı ne olursa olsun, optimal yüzey lekesi ve akış sitometrisi sonuçları için, nakledilen dokudan canlı tek hücre süspansiyonlarının elde edilmesi gereklidir. Yanlış doku manipülasyonu, hücre kaybına ve dolayısıyla düşük miyeloid altkümeye neden olabilir. Verimi artırmak için numuneyi u işlediğinizden emin olun.Soğuk tamponlar söyleyin ve hücreleri düşük hücre aderanslı kaplarda (polipropilen tüpler) muhafaza edin. Bu protokolde, birçok doku tipinin ayrıştırılması için yaygın olarak kullanılan C. histolyticum&#39;dan ( örneğin akciğer, kalp, kas, kemik, yağ, karaciğer, böbrek, kıkırdak, meme bezi, plasenta, kan) kolajenaz A kullanılmıştır. Damar, beyin ve tümör). Sıralama sırasında hücrelerin kaybedilmesini önlemek için, antikorların optimize edilmesi ve etkili bir geçiş stratejisi oluşturulması şiddetle tavsiye edilir. Bu protokolde, CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, Ly6C / APC ve Ly6G Pe / Cy7 floresan konjuge antikorları ve akış sitometrisi kullanarak sıçangil makrofajlarını karakterize ettik. İnsan epitomları Ly6C / G olmadığından, insan miyeloid hücrelerini ayırmak için CD14 / CD15 / CD16 kullanımı gerekir 15 . Çok renkli akış sitometrisi analizinde, seçilen florokromların olası spektral örtüşmeleri oluşabilir. Bu nedenle, belirtildiği gibi befoTek leke dengelemeleri, örtüşen konuları önlemek için çok yararlıdır. Ek olarak, antikor titrasyonu, arka plan floresanını azaltmak ve en iyi sonuçları elde etmek için şiddetle tavsiye edilir. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için bir diğer önemli husus canlılık boyalarının kullanılmasıdır. Bu protokolde DAPI yaşayabilirlik boyası olarak kullanılır. DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol), DNA&#39;daki AT zengini bölgelere güçlü bir şekilde bağlanan mavi floresan bir boyadır. DNA&#39;ya bağlı DAPI için uyarma maksimum değeri 358 nm ve emisyon maksimum değeri 461 nm&#39;dir. Protokole göre kullanıldığında, DAPI akış analizinde ölü hücreleri hariç tutarak, az miktarda veya hiç sitoplazmik etiketleme yapmadan çekirdeği özellikle lekeler. Bununla birlikte, seçilen antikorların paneline bağlı olarak, 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) ve propidyum iyodür (PI) gibi diğer yaşamsal boyalar kullanılabilir. Hassas hücre dışı bırakma ve canlı hücre tanımlama, in vitro T hücrelerini başarılı bir şekilde izlemek için ön şarttır, çünkü önemlidir.Lenfosit çoğalmasını, hücre yaşayabilirliği ve fonksiyonu için en ufak bir bozulma ile izleyebilecek prosedürlere sahip olmak. Yukarıda belirtildiği gibi CFSE gibi hücre izleme boyaları ile hücre etiketleme ve proliferasyon analizleri için kritik adımlar vardır. Literatürde açıklanan bir örnek olarak, CFSE 16 kullanıldığında üniform dağılımlar ve ayırt edilebilen kızı doruk noktaları elde etmek için ölü / ölmekte olan hücrelerin dışlanmasına dikkat edilmelidir. Boyama panellerine bağlı olarak, piyasada bulunan birçok hücre takip boyası vardır. Hücre izleme boyalarına alternatif olarak, kanser çalışmalarında lenfositlerin ve diğer hücrelerin proliferasyonunu değerlendirmek için timidin titrasyonlu analiz gerçekleştirilmiştir 13,14. Timidin birleştirme protokolleri, radyo işaretli 3H- veya 14C-timidin ölçüsü ile hücre bölünmesi sırasında DNA replikasyonunu değerlendirir. Bu yöntem iThymidine titrasyon tekniğinin en büyük dezavantajı radyoaktiviteye sahip olması ve tek hücre seviyesinde bilgi sağlamamasıdır. Öte yandan, CFSE akış sitometrisi analizi, yanıt veren lenfosit altkümeleri hakkında açık bilgi verir ve interlaborasyon ve intralaboratuvar değişkenliği daha azdır.

Bu protokol, T hücre yanıtlarını modüle edebilme yeteneklerine göre, kardiyak allograftlardan izole edilen dokuya sızdıran makrofajların fonksiyonunu incelemek için in vitro teknikleri tanımlamaktadır. Literatürde yaygın olarak tarif edilen floresan hücre izleme boyaları, akış sitometrisiyle kombinasyon halinde, in vitro ve in vivo spesifik hücre tiplerinin baskılayıcı fonksiyonlarını incelemek için güçlü araçlardır . Protokolümüz , in vitro lenfosit proliferasyonunu izlemek için karboksiflüoresase süksinimidil ester (CFSE) yöntemini izlemektedir. Bir CFSE etiketli hücre bölünürse, nesli karboksiflüoresantin ile etiketlenen moleküllerin sayısının yarısını alır 6 . Akış sitometresi ile hücre floresanındaki karşılık gelen düşüş, hücre bölünmesini değerlendirmek için, baskılayıcı makrofajların T hücre immün yanıtlarını modüle etme kapasitesini izlemek için kullanılabilir. CFSE floresein bazlı bir boya olduğu için, bir br ile uyumludur.Çok renkli akış sitometrisi için uygun hale getiren, diğer florokromlardan daha geniş bir yelpazede. Fenotipleme için florokromların uygun seçimi, aşırı spektrum örtüşmesini ve özellikle CFSE 7 gibi görünür protein boyaları ile antikor pozitif hücrelerin tanınamamasını önlemek açısından önemlidir. Floresan boyaları, radyoetiketlenmiş timidin (TdR) 8 kullanan timidin toplama testi gibi hücre çoğalmasını ölçen alternatif teknikler üzerine kullanmanın birçok avantajı vardır. Bu deney, mitotik hücre bölünmesi sırasında kromozomal DNA&#39;nın yeni iplikçiklerine dahil edilmiş, parçalanmış timidin (3H-TdR) kullanmaktadır. Bu tahlil ile ilgili bir güvenlik endişesi, radyoizotopların kullanılmasıdır, çünkü bir sintilasyon beta-sayacı, hücre bölünmesinin derecesini belirlemek için hücrelerden alınan DNA&#39;daki radyoaktiviteyi ölçmek için kullanılır. Metodolojik olarak, kıyılmış timidin kıçAy, boyama sonrası düşük hücre sayısı ve gecikmiş analiz gibi önemli klinik laboratuvar kısıtlamalarına uyacak kadar esnek değildir. Aksine, CFSE boyamasının hücre proliferasyonunu önlediği ve CD69, HLA-DR ve CD259 gibi kritik aktivasyon belirteçlerine müdahale ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, her bir metodolojinin avantajlarını ve kısıtlamalarını anlamak, özellikle farklı renk türlerini izlemek için birden fazla boyanın kullanıldığı çok renkli çalışmalar için doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik önem taşır.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1,000x 2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100x Non Esential amino acids</td><td>Corning</td><td>25025039</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES buffer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25060CL</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Sodium Pyruvate</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptavidyn</td><td>ThermoScientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Collagenese A</td><td>Roche</td><td>70381322</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (w/o calcium&amp;amp;magnesium)</td><td>Corning</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>CFSE-FITC</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>96 well&amp;nbsp; U-bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6C-APC</td><td>eBioscience</td><td>175932-80</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6G-Pe/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b-Percp/Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45011282</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>47045182</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4-APC</td><td>eBioscience</td><td>17004181</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8-P/ Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25008181</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Flow Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J&amp;nbsp;</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>008374</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of regulatory macrophages that inhibit graft-reactive immunity

Nakil yapılan organlarda makrofaj birikimi, allograft reddi 1&#39;in bir özelliği olarak uzun zamandır bilinmektedir. Immunogenic monocytes, transplantasyondan hemen sonra allogrefte infiltre olur, nakledilen organa karşı bir greft reaktif yanıt verir ve organ reddi başlatır 2 . Son yıllardaki veriler, baskılayıcı makrofajların başarılı uzun vadeli transplantasyon 3&#39;ü kolaylaştırdığını ve transplantasyon toleransının indüksiyonu için gerekli olduğunu göstermektedir4. Bu makrofaj fonksiyonunun izolasyonu ve analizi için yeni bir yol haritası isteyen, makrofaj ontogenezi, aktivasyonu ve fonksiyonunun çok boyutlu bir kavramını önermektedir. Makrofajların esnekliği nedeniyle makrofajları doku ortamına bağlı olarak izole etmek ve karakterize etmek için bir metodoloji sağlamak ve fonksiyonlarını farklı senaryolara göre tanımlamak gerekir. İşte, açıklıyoruzGreft sızdıran makrofajların bağışıklık karakterizasyonu için bir protokol olabilir ve CD8 + T proliferasyonunu inhibe etme ve CD4 + Foxp3 + Treg genleşmesini in vitro teşvik etme kapasitelerini fonksiyonel olarak değerlendirmede kullandığımız yöntemler olabilir .

Temsili sonuçlar yukarıdaki protokolde açıklanan geçiş stratejisini göstermektedir. Sonuçlar, greftle sızdıran makrofajlar ile birlikte kültürden sonra T-hücresi çoğalma aktivitesinin analizini de göstermektedir. Makrofaj alt gruplarının in vitro baskılayıcı kapasitesi Şekil 4&#39;te analiz edilmiştir. Sonuçlar, toleranslı alıcılardan elde edilen Ly6C lo Ly6G - makrofajların baskılayıcı olduğunu göstermektedir. Sonuçlar aynı zamanda, Ly6C int Ly6G + hücrelerinin mütevazı bir baskılayıcı kapasite sergilediğini de gösterir. Sadece Ly6CoL6G - hücreleri in vitro CD4 + Foxp3 + Treg genleşmesini arttırdı. Birlikte, veriler, greft infiltrasyonlu CD11b + Ly6C lo Ly6G - makrofajların monosit türevi baskılayıcı hücreler 12 ile ilişkili olduğu bildirilen birçok özelliğe sahip olduğu sonucunu desteklemektedir.CD8 T-hücresi çoğalmasını 13 inhibe etme kabiliyetlerini ve CD4 + Foxp3 + Treg genleşmesini 14 arttırma kabiliyetlerini kapsar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54242/54242fig1.jpg" /> Şekil 1: Hayvan modeli. ( A ) Balb / c kalpleri (H2-d) daha önce tarif edildiği gibi 10 tamamen allojenik C57BL / 6&#39;ya (H2-b) nakledildi. Alıcının cava veninin ve abdominal aortanın vericinin pulmoner arteri ve artan aortu ile anastomozu gösterilmiştir. Alıcı fareler, 0, 2 ve 4. günlerde tolerans indüksiyonu için 250 μg anti-CD40L mAb (klon MR1) ile tedavi edildi, çünkü son zamanlarda 4 bildirildi. Greft fonksiyonu her geçen gün abdominal palpasyon ile izlendi. Reddetme, palpe edilebilir bir kalp atışının tamamen kesilmesi olarak tanımlandı ve doğrudan görselleştirme ile teyit edildi.<html> laparotomi. ( B ) Temsilcisi Görüntü ve ( C ) LN ve dalak (kırmızı renkte) ve allograftın (mor renkte) anatomik konumunun gösterimi <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54242/54242fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen buraya</a> tıklayınız <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54242/54242fig1large.jpg" target="_blank">.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54242/54242fig2.jpg" /> Şekil 2: Makrofaj sıralama stratejisi. Sol üst soldan başlayarak, lökositler önce boyuta göre kapatıldı ve sonra singlet hücreleri enkaz ve kümelerden ayırt edildi. Singletlerden ölü hücreler, DAPI negatif fraksiyonunda geçit alma işlemi dışındadır. Canlı hücrelerden, CD45 + CD11b + , miyeloid hücreleri tanımlamak için kullanılır. Üç myeloid hücre popülasyonu ayrıca Ly6C ve Ly6G ekspresyonuna dayanarak tanımlanır.= &quot;_ Blank&quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/54242/54242fig3.jpg" /> Şekil 3: Lenfosit ayırma stratejisi. Lenfosit ayırma stratejisi için temsili akış sitometrisi sonuçları. Sol üstten, lenfosit popülasyonunun ön ve yan dağılımına göre kapısı. Enkaz ve kümeleri hariç tutun. Singletlerden ölü hücreler, DAPI negatif fraksiyon üzerinde geçitleme yoluyla hariç tutulur. Canlı hücrelerden, ( A ) CD8 + CFSE + çift ​​pozitif hücreler ve ( B ) Foxp3 + pozitif hücrelerin bir fraksiyonu içeren tüm CD4 + T hücreleri kapılır. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54242/54242fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src=&quot;/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg&quot; /&gt; Şekil 4: Bastırma tahlili. ( A ) Her miyeloid alt grubun in vitro baskılayıcı kapasitesi. CD8 + T hücresi çoğalması, 96 saatlik miyeloid altkümeler ile birlikte kültürden sonra CFSE seyrelmesi ile izlendi. ( B ) Her bir miyeloid alt grubunun in vitro Treg genleşmesi. Miyeloid alt-grupları ile birlikte kültürden 96 saat sonra CD4 + T hücrelerinde Foxp3 ekspresyonunun akış sitometrisi analizi. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54242/54242fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity at JoVE.com

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

functional-characterization-regulatory-macrophages-that-inhibit-graft

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K Görüntüleme.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır. 

Video: Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Kanser Araştırmaları

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Fenotipik ve Kronik Lenfositik koryomenenjit Virüs ile enfekte Fare İzole Aktif Düzenleyici T hücrelerinin Fonksiyonel Analiz

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Aloimmün kaynaklı Vasküler Reddi ve Nakli arterioskleroz Fare Modeli

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Tıp

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

Vitro ve In Vivo değerlendirme T, B ve Myeloid hücrelerin süpresif etkinlik ve nakli alıcılardan gelen Humoral yanıt

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

Fare kemik iliği ve Periton makrofaj harekete geçirmek antikor bazlı ilaçlara etkileri değerlendirilmesi

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...