Name: delivery of therapeutic sirna to the cns using cationic and anionic liposomes
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes at JoVE.com

We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.

Tüm fareler yetiştirilen ve Colorado State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca Değerlendirmesi ve Lab Hayvan Bakım International, Akreditasyon Derneği tarafından akredite Lab Hayvan Kaynakları, muhafaza edilmiştir. LSPCs hazırlanması 1. <ol><li> 1 DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonyum propan): LSPCs kolesterol oranı 1 kullanın. 1 kloroform: bir şişe içinde metanol çözeltisine 4 nmol lipozom hazırlanması için, DOTAP 2 nmol ve 1 10 ml kolesterol 2 nmol karıştırın. </li><li> Bir çeker ocak içinde N2 gazı ile metanol çözeltisi: kloroform 9 ml buharlaştınn. Gaz olmadan gecede davlumbaz çözücü son 1 ml buharlaşır. Şişenin altındaki ince bir lipid film dikkate alınmalıdır. </li><li> 55 ° C&#39;ye kadar bir% 10 sukroz çözeltisi ısı 10 mi. </li><li> /, Yavaş yavaş dk yani 1 ml ince lipid film üzerine ısıtılmış% 10 sukroz solüsyonu dökün ge ikenntly şişeyi dönen. lipit molekülleri jel sıvı fazda kalması için 55 ° C&#39;de lipidler ile% 10 sukroz ve balon koruyun. çok katmanlı vezikül (MLV) oluşumu ile ve tekrar su ile sonuçlanır. </li><li> lipidler lipozomlar boyutlandırma önce en az bir saat süreyle 55 ° C &#39;de rehidrate izin verin. </li><li> 1.0 um filtre ile, üretici talimatlarına göre bir ekstruder araya veya boyutlandırma 1.0 um şırınga filtreleri kullanmak. </li><li> 11 defa sıkıcıda şırınga birine ısıtıldı lipozom süspansiyonu 1 ml ilave edilir, ve iki şırınga arasında süspansiyon geçmektedir. Süspansiyon 11 geçer sonra başlayan şırınga daha ters şırınga olduğundan emin olun. </li><li> Ebat lipozomlar daha 0.45 um ile, sonra 0.2 um filtreler büyük tek katmanlı veziküller (LUVler) üretir. kolay boyutlandırma için ısıtılmış lipozom süspansiyonu tutun. </li><li> (4 20 uM 200 ul 4 nmol lipozom süspansiyonu (200 uM) 20 ul inkübenmol toplam) oda sıcaklığında 10 dakika için stok siRNA çözeltisi. </li><li> 500 uM, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile siRNA / lipozom çözeltisi (40 nmol toplam) hazır RVG-9R çözeltisi 80 ul inkübe edin. LSPCs mümkün olduğu kadar kısa bir süre kullanılabilir olması gerekir, ancak hazırlandıktan sonra birkaç saat kadar kullanılabilir. hazırlandıktan sonra birkaç saat 4 ° C&#39;de saklayın LSPCs. </li></ol> PALETS 2. hazırlanması <ol><li> 40: DSPE&#39;nin (1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin) ya da 5 mol oranı: kolesterol: DSPE-PEG veya DOTAP: kolesterol: DSPE-PEG PALETS için 55 kullanımı. 1 kloroform: bir şişe içinde metanol çözeltisine 4 nmol lipozom preparatı için DSPE ya DOTAP da 2.2 nmol, kolesterol 1.6 nmol, ve 2, 10 ml DSPE-PEG 0.2 nmol karıştırın. </li><li> Aşama 1.1 ve yukarıdaki 1.2 de tarif edildiği gibi tam olarak lipozom süspansiyonu hazırlanır. 1 x PBS, 10 ml DSPE lipozomlar rehidrate 1 ml / dakika ekleme 75 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. lipidler de 75 ° C&#39;de rehydrate izin verboyutlandırma önce en az 1 saat. </li><li> Boyut lipozom süspansiyonu tam olarak adım 1.6-1.8 açıklandığı. </li><li> Pipet DOTAP DSPE lipozomlar sonra tek kullanımlık kısma 4 nmol (200 uM) lipozom süspansiyonları her birinin 20 ul boyutlu yapılmış ve bir tezgah üstü, dondurarak kurutma (Şekil 2) ile, 30 dakika boyunca liyofilize var. </li><li> 20 uM DSPE PALETS lipozomlara kapsüllenecek olan siRNA, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile protamin sülfat 26.6 uM çözeltisi 1.4 ul (4 nmol toplam) hazır siRNA çözeltisi 200 ul inkübe edin. </li><li> siRNA 4 nmol stok çözeltisinden 200 ul DOTAP PALETS lipozomlar rehidrate veya siRNA / protamin çözeltisi 201.4 ul DSPE PALETS lipozomlar rehidrate. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lipozom / siRNA çözeltisi inkübe edin. </li><li> Her iki DOTAP DSPE PALETS için lipozom / siRNA çözeltiye 60 mM 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) çözeltisinin 10 ul ekle. </li><li> Her iki DOTAP DSPE PALETS için lipozom / siRNA çözeltisine 150 mM N-hidroksi-(sülfo-NHS) çözeltisi 10 ul ekle. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca siRNA / lipozom süspansiyonu ile EDC ve sülfo-NHS inkübe edin. </li><li> 500 uM, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile çözelti çapraz bağlama siRNA / lipozom (40 nmol toplam) hazır RVG-9R çözeltisi 80 ul inkübe edin. NOT: EDC / sulfo-NHS PEG lipidler kovalent bağa RVG-9R sağlar. hazırlanması sonra birkaç saat içinde PALETS kullanın. hazırlandıktan sonra birkaç saat 4 ° C&#39;de saklayın PALETS. </li><li> PALETS siRNA kapsülleme etkinliğini belirlemek için: <ol><li> önce ve protamin ve 260 nm&#39;de bir spektrofotometre kullanılarak lipozomlar ilave edildikten sonra siRNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. </li><li> 50 kDa santrifüj filtre kullanarak lipozom / kapsüllü siRNA süspansiyon kapsülsüz siRNA Filtre. 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> konsantrasyonunu ölçmekkapsüllenmemiş filtre siRNA ve 260 nm&#39;de bir spektrofotometre kullanılarak retentat kapsüllenmiş siRNA&#39;nın konsantrasyonu. </li></ol></li></ol> 3. LSPCs ya PALETS olan farelere enjekte <ol><li> damarsal genişletmek için bir ısı lambası 5-10 dakika fareler Açığa. </li><li> 2-3% isofluorane / oksijen ile fare anestezisi enjeksiyondan önce ve enjeksiyon sırasında 5-10 dakika akış. Hayvan artık ayakta ve solunuma bir ayak tutam yaparak yavaşladı zaman anesthetization onaylayın. kuyruk ven erişmek için kendi arkasında veya yanında fare yerleştirin. anestezi altında iken kurumasını önlemek için farenin gözleri veteriner merhem kullanın. </li><li> / Wipe% 70 EtOH ile kuyruk sprey ve 26 G insülin şırınga kullanarak fare kuyruk damarından üzerine LSPCs veya PALETS 300 ul enjekte edilir. kuyruk damar içine enjekte distal başlayın ve damar çökmesi ya da kırılmalar eğer proksimale hareket ettirin. </li><li> sternal yatma tutar kadar temiz bir kafes içinde fare yerleştirin. mo koymayınTamamen iyileşene kadar diğer kafes arkadaşları ile kullanın. Fareler 5 ila 15 dakika içinde geri gerekir. Bunlar, bir ısıtma yastığı veya kurtarma uzun sürerse vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi için bir ısı lambası altına yerleştirilebilir. Fareler aşırı ısınma karşı korumak için yakından izlenmelidir. </li><li> Anestezi kapalı giyer sağlamak için enjeksiyondan sonra hayvan birkaç saat Monitör ve tedavi hiçbir kötü etkileri vardır. LSPCs veya PALETS en az 24 saat dönmesine izin verin. </li></ol> Akım Sitometrisi aracılığıyla Protein Ekspresyonu 4. Analizi <ol><li> 15 dakika boyunca% 20 CO2 akış oranı ile farelerin öldürülür. </li><li> makas kullanarak fare deri ve kafatası uzak keserek beynin yarım yarımkürede parçalara ayır. Peel uzakta yarım uzak maşa ya da makasla ucunu kullanarak kafatasından beyin yarıküre. </li><li> FACS tampon 2.5 mi ile 40 mikron gözenekli bir hücre süzgecinden her fareden beyin basın yarım küre (1x, Bir şırınga pistonu ile bir Petri kabı PBS,% 1 fetal bovin serumu, 10 mM EDTA). </li><li> FACS tampon ek 2,5 ml hücre süzgecinden ve Petri çanağı yıkayın. Buz üzerinde 15 ml konik bir tüp içinde tek bir hücre süspansiyonu koyun. </li><li> Pipet 350 x g&#39;de 5 dakika boyunca 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj içine 5 ml&#39;lik tek bir hücre süspansiyonu 100 ul. FACS tampon 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon hücre pelletini atın. 5 dakika boyunca 350 xg&#39;de Spin. FACS tampon başka bir 1 ml ile tekrarlayın. buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li><li> 1 100 ul hücreleri inkübe: FACS tampon maddesi içinde 0.5 mg / ml sıçan anti-fare Fc Bloku 100 seyreltme, buz üzerinde 30-60 dakika karıştırıldı. Pelet ve adım 4.5 olarak hücreleri yıkayın. buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li><li> 30-60 dakika boyunca buz üzerinde FACS tamponu içinde% 7 fare serumu fare PrP C&#39;ye karşı bir 20 ug / ml fluoresan antikor, 100 ul hücre inkübe edin. Pelet ve adım 4.5 olarak hücreleri yıkayın. hücre süspansiyonu tutunbuzda. </li><li> Pelet ve 1 dakika boyunca RBC liziz tamponu için 1 ml (1 x PBS, 155 mM NH4CI, 12 mM NaHCO 3, 0.1 mM EDTA) içinde hücrelerin yeniden askıya. Aşama 4.5 Topak ve FACS tamponu 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri. buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li><li> Daha önce 10 açıklandığı gibi bir akış sitometresinin kullanarak PrP ​​C ifadesini analiz edin. Kapı toplam hücre popülasyonunun hücreleri yaşıyor. Kapı PrP C + canlı hücre popülasyonundan gelen hücreler MFI (ortalama floresan yoğunluğu) belirlemek gerekmektedir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).</li><li>McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protease-resistant+protein+is+a+structural+component+of+the+scrapie+prion.">A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion.</a> Cell. 35 (1), 57-62 (1983).</li><li>Pruisner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie.">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li><li>Jeffrey, M., McGovern, G., Sis&#242;, S., Gonz&#225;lez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+sub-cellular+pathology+of+prion+diseases:+relationship+between+morphological+changes,+accumulation+of+abnormal+prion+protein+and+clinical+disease.">Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease.</a> Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).</li><li>B&#252;eler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+PrP+are+resistant+to+scrapie.">Mice devoid of PrP are resistant to scrapie.</a> Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).</li><li>Pfeifer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivector-mediated+RNAi+efficiently+suppresses+prion+protein+and+prolongs+survival+of+scrapie-infected+mice.">Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice.</a> J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).</li><li>White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+treatment+with+RNAi+against+prion+protein+rescues+early+neuronal+dysfunction+and+prolongs+survival+in+mice.">Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).</li><li>Gallozzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prnp+knockdown+in+transgenic+mice+using+RNA+interference.">Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference.</a> Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).</li><li>Mallucci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cellular+prion+protein+reverses+early+cognitive+deficits+and+neurophysiological+dysfunction+in+prion-infected+mice.">Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice.</a> Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).</li><li>Pulford, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome-siRNA-peptide+complexes+cross+the+blood-brain+barrier+and+significantly+decrease+PrPC+on+neuronal+cells+PrPRes+in+infected+cultures.">Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures.</a> PLoS One. 5 (6), (2010).</li><li>Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposome-mediated+RNA+transfection.">Cationic liposome-mediated RNA transfection.</a> Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+efficiency+of+cationic+liposome-mediated+intravenous+gene+delivery.">Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery.</a> Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).</li><li>Freimark, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+enhance+cytokine+and+cell+influx+levels+in+the+lung+following+administration+of+plasmid:+cationic+lipid+complexes.">Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes.</a> J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).</li><li>Balzas, D. A., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+for+use+in+gene+delivery.">Liposomes for use in gene delivery.</a> J Drug Deliv. , (2011).</li><li>Srinivasan, C., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+anionic+lipoplexes+for+gene+delivery.">Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery.</a> J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).</li><li>Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+are+protected+from+excitotoxic+death+by+p53+antisense+oligonucleotides+delivered+in+anionic+liposomes.">Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes.</a> J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).</li><li>Tao, Y., Han, J., Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeting+gene+delivery+using+a+rabies+virus+glycoprotein+peptide+modulated+hollow+liposomes:+bio-behavioral+study.">Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study.</a> J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).</li><li>Li, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+via+intravenous+administration+of+cationic+lipid-protamine-DNA+(LPD)+complexes.">In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes.</a> Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).</li><li>Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cationic+lipid-protamine-DNA+(LPD)+complexes+for+intravenous+gene+delivery.">Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery.</a> Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system.">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39-43 (2007).</li><li>Voinea, M., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+of+'intelligent'+liposomes+for+efficient+delivery+of+drugs.">Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs.</a> J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+are+protected+from+excitotoxic+death+by+p53+antisense+oligonucleotides+delivered+in+anionic+liposomes.">Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes.</a> J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).</li><li>Li, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+via+intravenous+administration+of+cationic+lipid-protamine-DNA+(LPD)+complexes.">In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes.</a> Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).</li><li>B&#252;eler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+development+and+behaviour+of+mice+lacking+the+neuronal+cell-surface+PrP+protein.">Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein.</a> Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).</li><li>Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+the+messenger:+short+RNAs+that+silence+gene+expression.">Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).</li><li>Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression+in+the+human+hippocampus.">Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus.</a> J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).</li><li>Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prion+proteins+are+synthesized+in+neurons.">Scrapie prion proteins are synthesized in neurons.</a> Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).</li><li>Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+the+prion+protein+gene+in+glial+cells.">Developmental expression of the prion protein gene in glial cells.</a> Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).</li><li>Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+can+infect+primary+cultured+neurons+and+astrocytes+and+promote+neuronal+cell+death.">Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).</li><li>Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie-associated+prion+protein+accumulates+in+astrocytes+during+scrapie+infection.">Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu rapor verimli MSS için siRNA taşımaları iki hedeflenmiş dağıtım sistemleri oluşturmak için bir protokol açıklar. CNS siRNA teslim önceki yöntemler beyin, hedeflenen siRNA intravenöz enjeksiyon veya hedefli olmayan lipozom siRNA kompleksi intravenöz enjeksiyon doğrudan siRNA / shRNA enjekte vektörler dahildir. CNS&#39;ye siRNA / shRNA vektörlerinin enjeksiyon hedef protein sentezleme seviyelerinde bir düşüşe neden yoktur. Bununla birlikte, siRNA / shRNA CNS serbestçe nüfuz etmez. Bundan başka, bu enjeksiyonlar bitişik sinir dokusu 6-9 hasara neden olur. hedeflenen siRNA, damar içine enjeksiyon, hedef proteinin azaltılması ile sonuçlanır. Ancak, SiRNA çoğu serum proteinleri 20 tarafından parçalanır. Son olarak,, mononükleer fagosit sisteminin 21 ile karaciğer ve bozulma olan siRNA tutulmasıyla hedeflenmemiş lipozom siRNA Kompleksi venöz içine enjekte edilmesi. siRNA taşıyıcıYukarıda tarif edilen araçlar, LSPCs ve PALETS, merkezi sinir sistemine doğrudan siRNA sağlayarak daha önceki yöntemlere göre daha güvenli, daha etkili ve verimli bir dağıtım sistemi sağlar. LSPCs ve PALETS da merkezi sinir sistemine diğer küçük moleküllü ilaçlar taşıma yeteneğine sahiptirler. PALETS ya LSPCs monte edildikten sonra bir kaç saat içinde kullanılmalıdır. Aksi takdirde, siRNA bozulmuş / işlevsel olmayan olma riski vardır. kesintiye durdurulamaz diğer kritik adım / flow sitometri için hücre süspansiyonu hazırlanması ve çalışıyor. Süspansiyon analizi için canlı olması gerekir, canlı hücreleri içerir, çünkü hücre süspansiyonu hazırlanır, aynı gün flow sitometri yapılması önemlidir. Orada LSPCs ya PALETS, küçük moleküllü ilaç LSPCs ya PALETS yüklenir ne in vitro veya in vivo olarak kullanılacak bağlı olarak değiştirilebilir protokol olan birkaç adım ve işçilikatory tercihi. İlk olarak, LSPCs ve PALETS lipid mol oranları, diğer uygulamalar için optimize edilebilir. % 60 ağırlık / ağırlık veya daha yüksek kullanıldığında Ancak, fosfatidiletanolamin (DSPE&#39;nin PE) kötü nemlendirir. Bu daha yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, DSPE molekülleri birbirleriyle bir araya ve lipid çözünmeyen bir kütle oluşturacak. lipidlerin Bu kitle siRNA saklanması mümkün değildir. N2 gazı mevcut değilse, lipit karışımı buharlaştırma ile kurutulur. Buharlaştırma yaklaşık 3 gün sürer, ve bağlı metanol ve kloroform kullanımına bir çeker ocak içinde yapılmalıdır. Bu protokol, ince lipid filmi 1X PBS ile yeniden süspanse edildi, ancak, aynı zamanda, diğer hidrasyon tampon ile yeniden süspanse edilebilir. Diğer tamponlar su,% 10 sukroz, veya diğer herhangi bir sulu tampon olabilir. Rehidrasyon tamponu seçimi lipozomlar kullanım amacına bağlı olup, madde, lipozom 22,23 içinde kapsüllenmektedir. hidrasyon tampon jel liq yukarıda tutulmalıdırlipidlerin veya lipozomların kimliği kristal geçiş sıcaklığı (Tc veya Tm) düzgün rehydrate olmaz. anlatılan protokolde, süspansiyon lipozomlar homojen bir kalıp kullanılarak boyutlandırılmıştır. Bununla birlikte, lipozomlar da şırınga filtreleri ve sonikasyon kullanılarak boyutlandırılabilir. ekstrüzyon için kullanılan aynı filtre gözenek boyutları şırınga filtreleri olarak kullanılabilir. Ayrıca, lipozom süspansiyon siRNA çözeltisi ile hidrasyon sonra yeniden boyutlandırılabilir. Hidrasyon aşama (yayınlanmamış veriler) sonra, ekstrüder ile boyutta, ancak biz lipozomlardan siRNA bir kayıp gözlendi. PrP C biyolojik rolü henüz 5 anlaşılamamıştır olduğundan, PrP Cı düzeylerini azaltarak tarafından üretilen bazı zararlı etkileri olabileceği mümkündür. Prion proteini eksikliği olan farelerde geliştirmek Ancak, davranmaya ve yaş normalde 24, bu zararlı etkilerin gözle görülemeyecek küçük ya da değil olurdu ya olasıdır. Ayrıca, PrP&#39;nin siRNA demonte &lt;sup&gt; C ifadesi tamamen Lentivector RNAi 23 farklı protein ifadesini ortadan kaldırmak ve viral onkogenezde imkanı yoktur tamamen tersine çevrilebilir olmaz. dağıtım sistemlerine ilişkin sınırlamalar nedeniyle katyonik lipidler anyonik biyolojik membranlar PALETS ve LSPCs immünojenite alımını azaltılmasıdır. LSPCs immünojenisitesi gözlenirse, PALETS alternatif olarak kullanılabilir. Anyonik biyolojik membranlar anyonik PALETS azalma alımı, katyonik PALETS kullanarak veya katyonik ve anyonik lipid karışımı ile anyonik PALETS yeniden formüle aşılabilir. Bu raporda, PrPC azaltılması fare fare yaygın olarak değişir. Bu değişim, çeşitli faktörlere bağlı olabilir: siRNA&#39;nın fareleri arasındaki farklılıklar, farelerde damarların küçük çaplı ya da bozulması. kendilenmiş farelerin kullanılması farelerin arasında değişkenlik çok ortadan kaldırmak gerekir, ama varyasyon bile her zaman mümküninbred fareler. Ayrıca, fareler, diğer hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında çok küçük damarlar var. Yani, farelerin damarlarına büyük bir ses enjekte sorunlu olabilir. Biz PALETS veya LSPCs enjekte denemeden önce enjeksiyonları pratik öneririz. Ancak, hatta uygulama ile, bazen de fare içine PALETS / LSPCs tüm hacmi elde etmek için enjeksiyonlar bir çift alır ve ven bu enjeksiyonların herhangi birinde çökebilir. Başka bir farenin sadece PALETS / LSPCs hacminin 75-90% alabilirsiniz oysa Yani, bir fare, PALETS / LSPCs tüm hacmini alabilirsiniz. varyasyon Diğer olası kaynakları serum proteinlerinin tarafından dolaşım süresi ve siRNA bozulmasını içerir. PALETS / LSPCS varyasyonu açıklayabilir başka karşılaştırıldığında bir fare beyin, ulaşmadan önce uzun sirküle olabilir. Sadece LSPCs Yukarıdaki deneyde fareler ötenazi edilmeden önce, 24 saat için dolaşmaya bırakılmıştır. dolaşım süresi varyasyonu neden oluyorsa, o zaman Sirkülasyon artan24 saat ötesine tirme süresi bazı varyasyonu azaltmak gerekir. Biz PALETS / LSPCs ile siRNA paket olsa da, siRNA ve / veya teslimat araçlarının bozulması olasılığı her zaman vardır. Daha önce belirtildiği gibi, katyonik lipidler biraz immünojeniktir. kan içinde bağışıklık hücreleri araçlarına saldırıyor Yani eğer, o zaman araçlar beyne iletilmesi için daha uzun sürer veya araçlar bozulmuş haline gelebilir. PALETS anyonik katyonik lipidler geçiş katyonik lipidler kullanırken yavaş dolaşım süresi veya bozulmasını azaltmaya yardımcı olabilir. RVG-9r peptid nikotinik asetilkolin reseptörlerini içeren CNS içinde herhangi bir hücreye LSPCs ve PALETS taşır. Bu nöronal hücrelerin mikroglial hücreleri ve astrositler 26 içerir. PALETS ya LSPCs prion hastalıkları için etkili bir tedavi olduğu için, prion patogenezine katkıda bulunan tüm hedef hücrelere önemlidir. Nöronal hücrelerin en PrP C içeren </sup&gt; CNS içindeki herhangi bir başka hücre tipinin. Bu nedenle, nöronal hücrelerin beyne 27,28 boyunca prion yayılmasını katkıda yardımcı olur. Hücrelerin PrP C ifadesi nöronal hücreleri hedef ve azaltılması prion patogenezinde bir azalmaya neden olabilir. Ancak nöron hücreler prion hastalığına neden Sadece hücre tipi değildir. Astrositler prion 29,30 replikasyonu implike edilmiştir. Bu nedenle, sadece önemli nöronal hedef hücrelere değil, aynı zamanda prion patogenezi azaltmak için astrositleri hedef etmektir. Burada tarif edilen uygulama sistemleri hastalığı geniş bir uygulama aralığı için uygun hale olacak çeşitli iyileştirme stratejileri için uygun. LSPCs ve PALETS araç az nörodejeneratif hastalıklardan daha fazla tedavi etmek için bir potansiyele göre merkezi sinir sistemi değil, sadece siRNA, herhangi bir küçük moleküllü ilaç taşıma yeteneğine sahiptirler. PALETS ve LSPCs etkileyen herhangi bir hastalığı tedavi etmek için kullanılabiliraraçlara yüklenen küçük moleküllü ilaç bağlı beyin. Ayrıca, hedef peptid değişen teslimat araçları yerine asetilkolin reseptörlerini olan herhangi bir hücrenin, merkezi sinir sistemi içindeki hücrelerin belirli bir alt kümesiyle küçük moleküllü ilaçların teslim izin verebilir. PALETS ve LSPCs merkezi sinir sistemini etkileyen hastalıkları tedavi etmek için, küçük moleküllü ilaçlar için yeni, daha verimli ve esnek dağıtım sistemi temsil etmektedir.

Prionlar merkezi sinir sistemini etkileyen şiddetli nörodejeneratif hastalıklar bulunmaktadır. Prion hastalıkları PrP Res adlı bir enfeksiyon izomer normal hücresel prion proteininin, PrP C, hatalı katlanması sonucu. Bu hastalıklar, insanlarda 1-3 sığırlarda sünger formlu ineklerde ensefalopati, Scrapie koyun, Cervidlerin kronik halsizlik hastalığı- ve Creutzfeldt-Jakob hastalığı dahil olmak üzere türleri ve çeşitli etkiler. Prionlar sinaptik kaybı ile başlar ve vakuolizasyonu ilerleyen nörodejenerasyon, gliozis, nöron kaybı ve plak mevduat neden olur. En sonunda, 4 ayrı hayvan / ölümü ile sonuçlanır. Onlarca yıldır, araştırmacılar yavaş ya da prion hastalığın ilerlemesini durdurmak amacıyla bileşikler araştırdık. Bununla birlikte, araştırmacılar, başarılı bir tedavi veya etkili bir sistemik dağıtım aracı ya bulamadık. Endojen PrP C ifadesi prion hastalıklarının 5 gelişimi için gereklidir </s&gt; Yukarı. Bu nedenle, azaltan veya ortadan PrP Cı ifade, bir gecikme ya da hastalığın iyileştirilmesi neden olabilir. Çeşitli gruplar prion hastalığı PrP C ifadesi düzeylerinin rolünü araştırmak için fare beyin dokusu içine doğrudan shRNA ifade PrP C seviyelerinde düşme veya enjekte lentivectors ile transgenik fareler yarattı. Nöronal PrP C miktarını azaltarak bulundu Bu araştırmacılar prion hastalıklarının ilerleyici nevropatolojisi durdurulması sonuçlandı ve hayvanların 6-9 ömrü uzatılmış. Biz fare nöroblastom hücrelerinde 10 PrP Res temizlenmesi o PrP C siRNA tedavi sonuçlarını bildirmişlerdir. Bu çalışmalar, bu tür tedaviler, küçük müdahale edici RNA (siRNA) böler mRNA gibi PrP Cı ekspresyon seviyelerini azaltmak için yeterli Prion hastalıklarının ilerlemesini geciktirebilir düşündürmektedir. Bununla birlikte, Prion hastalıklarının incelenmiştir tedavilerin çoğunluğu pratik olmazdı şekilde teslim edildiBir klinik ortamda. Bu nedenle, bir siRNA tedavisi merkezi sinir sistemine, venöz içine verilen ve hedeflenen bir uygulama sistemiyle, ihtiyacı vardır. Araştırmacılar, gen tedavi ürünleri için salıverme araçları olarak lipozomların kullanılmasını inceledik. Katyonik ve anyonik lipitler hem lipozomlar oluşturularak kullanılmaktadır. katyonik lipid ve DNA / RNA arasındaki yük farkı verimi arttırmak üzere sağlar, çünkü katyonik lipidler daha yaygın anyonik lipidler daha kullanılmaktadır. Katyonik lipidlerin diğer bir avantajı, diğer lipidler 11-14 daha kolay hücre zarlarını olmasıdır. Bununla birlikte, katyonik lipidler anyonik lipidler 13,14 daha immünojeniktir. Bu nedenle, araştırmacılar lipozomlarda lipitleri anyonik katyonik kullanarak kaymaya başlamıştır. Gen terapisi ürünler etkin bir şekilde bir DNA / RNA molekülleri 15-19 yoğunlaşır pozitif yüklü peptid protamin sülfat kullanılarak anyonik lipozomlara paketlenebilir. anyonik Lipi yanaDS katyonik lipidler onlar sirkülasyon süreleri artmış olabilir ve daha hayvan modellerinde 13,14 tolere edilebilir daha az bağışıklık vardır. Lipozomlar, lipozomlara bağlı peptidleri hedef kullanarak belirli dokulara hedeflenir. Nikotinik asetilkolin reseptörlerine bağlanan RVG-9R nöropeptid, CNS 17-20 kadar siRNA ve lipozomlar hedeflemek için kullanılmıştır. Bu rapor bir protokol üç siRNA teslimat araçlar üretmek için, ve paketlemek ve nöronal hücrelerin (Şekil 1) siRNA teslim özetliyor. Lipozom siRNA peptit kompleksleri (LSPCs) siRNA ile lipozomlar oluşan ve peptidini hedefleme RVG-9R elektrostatik lipozomun dış yüzeyine bağlı. Peptit RVG-9r kovalent lipit PEG gruplarına bağlı olan, siRNA ve lipozom içinde kapsüllü protamin oluşan terapötik siRNA (PALETS) kapsüllü lipozom hitap etti. Aşağıdaki yöntemleri kullanarak LSPCs ve palet oluşturmak içinS PrP C siRNA tedavi veya büyük ölçüde prion hastalığı patoloji başlamasını geciktirmek için muazzam umut vaat nöronal hücrelerin% 90 e kadar PrP C ifadesini azaltır.

<table><tbody><tr><td>DOTAP lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Avanti Lipids</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Avanti Lipids</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>EMD Millipore</td><td>113351</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;sub&gt; Gas</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1.0, 0.4, and 0.2 &amp;#956;m filters</td><td>Avanti Lipids</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>Aliquoted for single use</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>Aliquoted for single use</td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PrP antibody (PRC5)</td><td>Proprietary - PRC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

delivery of therapeutic sirna to the cns using cationic and anionic liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

anyonik PALETS içinde siRNA encapsulation verimliliğini artırmak için, siRNA protamin ile karıştırıldı. 1 (Şekil 3A): 1 ila 2: siRNA En iyi protamin konsantrasyonunu belirlemek için, siRNA 1, protamin farklı konsantrasyonları ile karıştırılmıştır. protamin kullanılmadan anyonik lipozomlar içinde bir% 60-65 siRNA Kapsülleme verimliliği oluştu. Protaminin Örnekleri: 1&#39;den 1.5: 1 ila siRNA molar oranları 1 (133-266 nM)% 80-90 siRNA kapsülleme vardı. 1.5 Yukarıdaki mol oranları 1 siRNA / protamin komplekslerinin çökeltilmesi ile sonuçlanmıştır. Bu çökelmiş kompleksler anyonik lipozomlar içine kapsüllenmiş değildi. siRNA Protaminin ilave edildikten sonra bağlı seyreltme siRNA konsantrasyonda hafif bir düşüş vardı; Bununla birlikte, konsantrasyon protamin eklenmesinden (Şekil 3B) sonra sabit kalmıştır. 50 kDa filtresi, siRNA% 90-95 lipozomlar süzüldükten sonrasiRNA% 5-10 süzüntüde &#39;serbest&#39; iken, lipozom filtreden geçmeyen kısım ile ilişkilendirilmiştir. Hiçbir siRNA protamin veya lipozom sadece numune (Şekil 3C) saptandı. in vivo LSPCs etkisini belirlemek için, vahşi tipli fare, 24 saat için LSPCs ile muamele edilmiştir. LSPCs ile muamele vahşi tip farelerin PrP Cı ekspresyon seviyeleri 1X PBS ile tedavi edilmiş farelerde ve PrP nakavt (KO PrP) farelerde (Şekil 4) ile karşılaştırılmıştır. LSPCs ile tedavi edilen farelerin beyinlerinde PrP C akış sitometrik analizi PrP C seviyelerinde bir düşüş göstermiştir (Şekil 4A ve 4B). Bir deney içinde, tüm fareler, PrP KO farelerde (Şekil 4A) gözlendi PrP Cı seviyesine yakın PrP C seviyelerinin% 80-90 azalma vardı. Iki bağımsız deneyde LSPCs ile tedavi edilen farelerde PrP ° C&#39;lik bir% 40-80 azalma &lt;gösterdi/ sup&gt; düzeyleri (Şekil 4B). Toplam LSPCs dışında (n = 14) ile tedavi edilen farelerin, sadece bir fare LSPCs hiçbir yanıt vardı oldu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54106/54106fig1.jpg" /> Şekil 1:. PALETS / LSPCs oluşturun ve Fareler MSS ile İntravenöz siRNA sunun Protokol Genel Bakış Lipozomlar ince lipid filmi hidrasyon yöntemi ile oluşturulmuştur. PrP Cı siRNA daha sonra bir elektrostatik etkileşim yoluyla ya da kapsülleme yoluyla lipozomlara tutturuldu. PALETS ya LSPCs CNS hedef peptid RVG-9R ilavesiyle tamamlanmıştır. Montajdan sonra, PALETS / LSPCs farelerin kuyruk venleri içine enjekte edilmiştir ve 24 saat tedavi sonrası PrP C ifadesi sitometri. Akış yoluyla değerlendirildi <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54106/54106fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </a&gt; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54106/54106fig2.jpg" /> Şekil 2: İnce lipid film Hidrasyon yöntemi Protokol PALETS verici vasıta için DSPE Lipozomlar oluşturmak için lipitler çözündürüldü ve kloroform içinde karıştırılmıştır. Kuru lipid filmi oluşturmak için buharlaştınldı metanol çözeltisi. Kuru lipid filmi çok katmanlı veziküller (MLV) oluşturmak için 1 x PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. MLVlerin daha sonra muntazam luvs oluşturmak için bir ekstrüzyon presini kullanarak boyutlandırılmıştır. Luvs sonra süspansiyon kullanılan, ya da tek kullanımlık alikotları liyofilize edilebilir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54106/54106fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54106/54106fig3.jpg" /> Şekil 3: içine siRNA Kapsülleme Verimliliği DSPE PALETS u<html> Şarkı Protamin sülfat (A). siRNA yaklaşık% 60-65 protamin eklenmeyen kapsül haline getirilmiştir. 1 ve 1.5: 1: protamin: siRNA oranı protamin eklenmesiyle 1 ila% 90 Kapsülleme verimliliği oldu. Kapsüllenmemiş siRNA% 5-10 filtre bulundu ise (B) herhangi bir serbest siRNA gelen lipozomlar üzerinden süzüldükten sonra, siRNA% 90, lipozomal bir fraksiyon halinde bulunmuştur. (C) Protamin ve lipozom sadece çözüm kapsüllü SiRNA ücretsizdir. siRNA yaklaşık% 60-65 protamin kullanılmadan DSPE Lipozomlar içinde kapsül haline getirilmiştir. 186.2 nM bir konsantrasyonda protamin kullanımı ile, siRNA yaklaşık% 90, DSPE lipozomlar içinde kapsül haline getirilmiştir. Hata çubukları SEM&#39;i göstermektedir. **** P &lt;0.0001 gösterir. * P &lt;0.01 gösterir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54106/54106fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 1 &quot;&gt;:&quot; keep-together.within sayfa = fo &quot;ve_content <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54106/54106fig4.jpg" /> Şekil 4:. Beyin hücre süspansiyonları Örnek akış sitometrik analizi LSPCs ile muamele edildikten sonra 24 saat LSPCs vahşi tipli fare ve beyinleri kuyruk venleri içine enjekte edilmiştir 24 saat sonra hasat edilmiştir. PBS tedavi kontrol olarak kullanılmıştır, ve PrP KO fare PrP Cı seviyeleri için bir kontrol olarak kullanıldı. LSPCs ile tedavi (A) Fare vahşi tip PrP C seviyelerini gösterir PBS kontrolüne kıyasla PrP C düzeylerinde önemli bir azalma göstermiştir. Fareler tedavi LSPCs bir PrP KO fare buna yakın PrP C düzeylerini gösterdi. Aynı 24 saat tedavi protokolü kullanılarak, üç bağımsız deneyin (B) toplu veri PBS vahşi tip PrP C nispi miktarını gösteren ve LSPCs fareler işlemden geçirildi. Üç deneyde fareler LSPCs Sho ile işlemden geçirildiPBS yabani tipteki kontroller ile karşılaştırıldığında, PrP C seviyelerinde önemli azalmalar evli. Hata çubukları SEM&#39;i göstermektedir. *** &lt;0.0003 P gösterir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54106/54106fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes at JoVE.com

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

delivery-therapeutic-sirna-to-cns-using-cationic-anionic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Görüntüleme.  Colorado State University. The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases. 

Video: Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 &#176;C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 &#177; 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 &#177; 0.22 &#215; 1012 particle/mL and 8.3 &#177; 1.7 &#215; 1010 particle/&#181;g, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.

An exosome is a new generation of drug delivery carriers. We established an exosome isolation protocol with high yield and purity for siRNA delivery. We also encapsulated fluorescently labelled non-specific siRNA into exosomes and investigated the cellular uptake of siRNA-loaded exosomes in cancer cells.

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Kanser Araştırmaları

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Biyomühendislik

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Nörobilim

Using Lipid Nanoparticles for the Delivery of Chemically Modified mRNA into Mammalian Cells

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic applications, including a novel class of vaccines, protein replacement therapies, and immune therapies. Among delivery vectors, lipid nanoparticles are found to be safer and more effective in delivering RNA molecules (e.g., siRNA, miRNA, mRNA) and a few products are already in clinical use. To demonstrate lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery, we present an optimized protocol for the synthesis of functional me1&#936;-UTP modified eGFP mRNA, the preparation of cationic liposomes, the electrostatic complex formation of mRNA with cationic liposomes, and the evaluation of transfection efficiencies in mammalian cells. The results demonstrate that these modifications efficiently improved the stability of mRNA when delivered with cationic liposomes and increased the eGFP mRNA translation efficiency and stability in mammalian cells. This protocol can be used to synthesize the desired mRNA and transfect with cationic liposomes for target gene expression in mammalian cells.

The protocol presents in vitro transcription (IVT) of chemically modified mRNA, cationic liposome preparation, and functional analysis of liposome enabled mRNA transfections in mammalian cells.

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic ...

Biyokimya

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical success for treating previously &#8216;undruggable&#8217; hepatic disease targets with siRNA has been achieved. However, efficient tumor siRNA delivery necessitates additional pharmacokinetic design considerations, including long circulation time, evasion of clearance organs (e.g., liver and kidneys), and tumor penetration and retention. Here, we describe the preparation and in vitro physicochemical/biological characterization of polymeric nanoparticles designed for efficient siRNA delivery, particularly to non-hepatic tissues such as tumors. The siRNA nanoparticles are prepared by electrostatic complexation of siRNA and the diblock copolymer poly(ethylene glycol-b-[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-butyl methacrylate]) (PEG-DB) to form polyion complexes (polyplexes) where siRNA is sequestered within the polyplex core and PEG forms a hydrophilic, neutrally-charged corona. Moreover, the DB block becomes membrane-lytic as vesicles of the endolysosomal pathway acidify (&#60; pH 6.8), triggering endosomal escape and cytosolic delivery of siRNA. Methods to characterize the physicochemical characteristics of siRNA nanoparticles such as size, surface charge, particle morphology, and siRNA loading are described. Bioactivity of siRNA nanoparticles is measured using luciferase as a model gene in a rapid and high-throughput gene silencing assay. Designs which pass these initial tests (such as PEG-DB-based polyplexes) are considered appropriate for translation to preclinical animal studies assessing the delivery of siRNA to tumors or other sites of pathology.

Methods to prepare and characterize the physicochemical properties and bioactivity of neutrally-charged, pH-responsive siRNA nanoparticles are presented. Criteria for successful siRNA nanomedicines such as size, morphology, surface charge, siRNA loading, and gene silencing are discussed.

Sitosolik siRNA teslim için Nötrsel olarak şarj edilmiş, pH duyarlı polimerik nanopartiküller hazırlanması

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the central nervous system (CNS). Recent studies demonstrate the use of a peptide, RVG9R, incorporating the minimal receptor-binding domain of the Rabies virus glycoprotein, in eliciting the delivery of siRNA into neurons in the brain. In this protocol, the peptide-siRNA formulation is delivered intranasally with a pipette in the dominant hand, while the anesthetized mouse is restrained by the scruff with the nondominant hand in a "head down-and-forward position" to avoid drainage into the lung and stomach upon inhalation. This precise gripping of mice can be learned but is not easy and requires practice and skill to result in effective CNS uptake. Furthermore, the process is long-drawn, requiring about 45 min for the administration of a total volume of ~20-30 &#181;L of solution in 1-2 &#181;L droplet volumes per inhalation, with 3-4 min rest periods between each inhalation. The objective of this study is to disclose a mouse positioning device that enables the appropriate placement of mice for efficient IN administration of the peptide-siRNA formulation. Multiple features are incorporated into the design of the device, such as four or eight positioning chairs with adjustable height and tilt to restrain anesthetized mice in the head down-and-forward position, enabling easy visualization of the mice's nares and a built-in heating pad to maintain the mice's body temperatures during the procedure. Importantly, the ability to treat four or eight mice simultaneously with RVG9R-siRNA complexes in this manner enables studies on a much quicker time scale, for the testing of an IN therapeutic siRNA approach. In conclusion, this device allows for appropriate and controlled mouse head positioning for IN application of RVG9R-siRNA and other therapeutic molecules, such as nanoparticles or antibodies, for CNS delivery.

Here, we present a protocol using a mouse positioning device that enables the appropriate placement of mice for the intranasal administration of a brain-targeting peptide-siRNA formulation enabling effective gene silencing in the central nervous system.

Merkezi Sinir Sistemine İntranazal siRNA Teslimi Sırasında Farelerin Yerleştirilmesi için Bir Konumlandırma Cihazı

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Biyoloji

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Sıçan Merkezi Sinir Sisteminde Antisense Oligonükleotidlerin İntinal Teslimi

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...