We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.

1. Hücre floresan etiketleme NOT: floresan boyalar 9 Etiket glioblastoma hücre hatları ve mikroglia. Seçenek olarak ise, 14 de tarif edildiği gibi konstitütif GFP / RFP gibi floresan proteinleri ifade eden hücre hatları oluşturmak. <ol><li> boyama gününde% 80 konfluent - 6 gözenekli bir plakada Plaka hücreleri 70 olacak şekilde. Fare glioblastoma hücre hattı GL261 ve insan glioblastoma hücre hattı U87, plaka 1 x 10 6 ve 1.5 x 10 6 hücre, sırasıyla boyama önce 6 cm çanak 24 saat üzerinde. </li><li> DMSO içinde floresan hücre leke boya çözeltisini hazırlayın ve ortama 5 uM boya ekleyin ya Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI) veya makrofaj serum barındırmayan ortam (MSFM) de vorteks. </li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 için boya ile inkübe hücreleri. </li><li> boya içeren ortamı çıkarın ve hücrelere taze ortam (RPMI veya MSFM) ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Not: Hücreler artıklekeli ve hazır denemede kullanılır. </li></ol> 2. Ön kaplı Matrix Odası Coculture Invasion Testi <ol><li> Forbol miristat asetat (PMA) 15 kullanılarak, THP-1 hücreleri ayırt. <ol><li> Plaka 2 - 6 bölmeli bir kültür tepsisi RPMI /% 10 FBS, 1.5 ml 3 x 10 5 THP-1 hücreleri. Kaplamadan hemen sonra, 100 nM PMA ekleme ve 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edilir. Not: 48 saat sonra, başarılı bir farklılaşma geçirmiş THP-1 hücreleri yapışkan olacak ve de yuvarlak bir morfolojisi alarak altına yayılır. </li><li> 1x bir kez PBS ile yıkanarak PMA çıkarın ve taze RPMI /% 10 FBS ile değiştirin. Hücreler tayininde kullanıma hazır olana kadar başka bir 48 saat bekleyin. </li></ol></li><li> Bir tek başına medya 500 ul içeren (hiçbir serum) onları yerleştirerek ve üstüne tek başına medya 500 ul ekleyerek matris önceden kaplanmış odaları dengelenmesi. 37 ° C de 2 saat ve% 5 CO2 için bir oda inkübe edin. <br/&gt; Not: Ön kaplı odaları üreticiden satın alındı; Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız. </li><li> yavaşça hücreler (floresan etiketli glioblastoma hücre hatları ve mikroglia / makrofajlar) çıkarmak için, aspirasyon ile hücrelerden ortamı çıkarın. 2 mM EDTA / PBS ile yemeğin üzerine hücreleri yıkayın. 2 mM EDTA / 500 ul PBS ilave edin ve 5 inkübe edin - 37 ° C&#39;de bir hücre kuluçka makinesi içinde, 10 dakika ve% 5 CO2. </li><li> % 0.3 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden ortam 5 ml içinde süspanse hücreleri. </li><li> 120 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> MSFM /% 0.3 BSA ortam aspire supernatant ve tekrar süspansiyon pelet ya da (U87 ve THP-1 hücreleri için) RPMI /% 0.3 BSA (GL261 hücreleri ve mikroglia için) hücre konsantrasyonu 1 x 10 6 hücre / ml&#39;ye eşit olduğu şekilde . hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın. </li><li> 24 gözlü plakanın her bir kuyucuğu 500 ul ortam /% 0.3 BSA ekleyin. </li><li> En az 2 saat (adım 2.2) için dengelenmiş olan odaları bulunan ortamı çıkarın. Yeri Chambeiyi 500 ul medya /% 0.3 BSA (adım 2.7) ihtiva eden rs. </li><li> inhibitörleri makrofaj üzerindeki etkisini incelemek için kullanılıyorsa / mikroglia alt ve odanın üst kısımlarına hem uygun konsantrasyon ekleyin glioma işgali uyarılır. Not: CSF-1R konsantrasyonları GL261 glioblastoma istilası Referans 9 bulunabilir uyarılmış tam mikroglia inhibe etmek için kullanılır inhibitördür. </li><li> Fare glioblastoma (2.10.1) ve insan glioblastoma (2.10.2) kullanılan hücre hatları bağlı olarak, aşağıdaki iki adımda tarif edildiği gibi üst bölmeye hücreleri ekleyin. <ol><li> 1.5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) hücreleri (150 ul) ve 5 x 10 4 fare mikroglia (50 ul) (ortam detayları için adım 2.6) karıştırın. 300 ul MSFM /% 0.3 BSA eklenerek 500 ul hacim kazandırın. Üst bölmeye hücre karışımı ekleyin ve 48 st için 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edilir. NOT: i tarif edildiği gibi Fare mikroglia yenidoğan farelerin izole edilmiştirn, 1 ila 6. </li></ol></li></ol> 7.5 x 10 4 U87 (glioblastoma) hücreleri (75 ul) ve 2.5 x 10 4 THP1 (makrofaj) hücreleri (25 ul) karıştırın. 400 ul RPMI /% 0.3 BSA ilave edilerek 500 ul hacim getirin. üst bölmeye hücre karışımı ekleyin. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. <ol><li> kuluçkadan sonra hafif aspirasyon ile odasının üst hücreleri çıkarmak ve PBS içinde% 3.7 formaldehit içinde yerleştirerek odaları düzeltin. Chambers, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (ya da gece boyunca 4 ° C) sabitleştirici kalmasına izin verir. Nazik aspirasyonu ile Fiksatif çıkarın ve PBS 1x 500 ul ile değiştirin. görüntü analizi için bölüm 4 geçin. NOT: Deney şu anda durdurulmuş ve 1x PBS içinde görüntüleme için kaydedilebilir. Floresan boya sinyalleri tespit sonrasında en fazla 2 hafta tespit edilebilir. </li></ol> Matrix glioma ve makrofajlar / mikroglia katıştırma 3. Invasion Testi &quot;3D&quot; <ol><li>gece boyunca 4 ° C&#39;de çözülme matriks karışımı. kaputu buz üzerinde matris kullanarak tüm diğer manipülasyonlar gerçekleştirin. </li><li> Buz üzerinde% 0.3 BSA ile ortam matrisin 10 mg / ml konsantrasyon (MSFM veya RPMI) hazırlayın. Not: matris stok konsantrasyonu tipik olarak yaklaşık 15 mg / ml&#39;dir. </li><li> matris içinde süspansiyon için (adım 1 &#39;de etiketli) hücreler hazırlamak için, aspirasyon ile hücrelerden ortamı çıkarın. 2 mM EDTA / PBS ile yemeğin üzerine hücreleri yıkayın. Hücrelere 2 mM EDTA / 500 ul PBS ilave edin ve 5 inkübe edin - 37 ° C&#39;de kuluçka makinesi içinde, 10 dakika ve% 5 CO2. </li><li> % 0.3 BSA ihtiva eden ortam 5 ml içinde süspanse hücreleri. </li><li> 120 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> pelet Süpernatant aspire. Hücre konsantrasyonu 1 x 10 6 hücre / ml&#39;ye eşit olduğu şekilde ortam /% 0.3 BSA içinde süspanse pelet. hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın. </li><li> 1.5 ml mikrofüj tüpüne + 5 x 10 4 mikroglia hücreleri (50 ul) (150 ul) 1.5 x 10 5 GL261 hücreleri ekleyin.Ayrı bir 1.5 ml mikrofüj tüpe 2 x 10 5 GL261 hücreleri (200 ul) eklenir. Not: Tek başına mikroglia olmayan GL261 hücreleri, kontrol olarak hizmet eder. </li><li> 120 x g&#39;de 5 dakika boyunca mikrofuj Spin hücreleri. </li><li> buz üzerinde 200 ul soğuk matris içinde süspanse edin hücreleri. </li><li> 8 mcM gözenek boyutu odası ucun üst bölmesinin merkezi üzerine plakası 50 ul (50,000 hücreler). </li><li> polimerizasyon meydana gelmesi için, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Alt de üst bölmesi ve 700 ul serum içeren hücre büyüme ortamına 200 ul serumsuz ortam ekleyin. </li><li> 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> kuluçkadan sonra hafif aspirasyon ile odasının üst hücreleri çıkarmak ve PBS içinde% 3.7 formaldehit içinde yerleştirerek odaları düzeltin. Chambers, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (ya da gece boyunca 4 ° C) sabitleştirici kalmasına izin verir. Nazik aspirasyonu ile Fiksatif çıkarın ve PBS 1x 500 ul ile değiştirin. bölüm 4 fo geçinr görüntü analizi. </li></ol> 4. Görüntüleme Tahliller <ol><li> % 3.7 formaldehit odaları çıkarın ve PBS 1x taze 500 ul içeren iyi yıkayın. NOT: odalar kurumasına izin vermeyin. </li><li> bir pamuklu kullanarak, yavaşça filtre yüzeyi kazınarak filtrenin üst kısmı (yan bölmesinin içine bakan) için invazif olmayan hücreler temizleyin. yavaşça başlayın ve giderek basıncı artar. odasının başına bu en az 3 kez yapın. </li><li> ya bir cam tabanlı çanak odaları yerleştirin veya 24 plaka bırakın. </li><li> Kamera ve görüntü yakalama yazılımı 9,10 ile donatılmış bir epifluorescent veya lazer konfokal floresan mikroskop sahnede örnek yerleştirin. </li><li> temsili alanların birkaç 10X veya 20X fotoğraf çekmek. </li><li> Örneğin ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak, alt 9,10 filtreyi geçti glioblastoma hücrelerinin sayısını saymak. </li><li> &quot;3D görüntüleme Eğer. 4.6 Yukarıda açıklanan - &quot;işgali tahlil (bölüm 3 açıklanan), bir floresan lazer konfokal mikroskop 5-6 kullanarak Z yığını serisi oluşturmak görüntü için filtrenin alt invaziv hücre popülasyonunu, protokolü takip 4.2 adımları. </li></ol>

<ol>
	<li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+tumors.">Central nervous system tumors.</a> Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).</li><li>Furnari, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+astrocytic+glioma:+genetics,+biology,+and+paths+to+treatment.">Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.</a> Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. 60 (3), 502-514 (2012).</li><li>Li, W., Graeber, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+profile+of+microglia+under+the+influence+of+glioma.">The molecular profile of microglia under the influence of glioma.</a> Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).</li><li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+brain+tumors.">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li><li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophages+promote+glioma+progression.">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li><li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+glioma+migration.">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li><li>Wesolowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-derived+TGF-beta+as+an+important+regulator+of+glioblastoma+invasion:+an+inhibition+of+TGF-beta-dependent+effects+by+shRNA+against+human+TGF-beta+type+II+receptor.">Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor.</a> Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).</li><li>Coniglio, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+stimulation+of+glioblastoma+invasion+involves+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+and+colony+stimulating+factor+1+receptor+(CSF-1R)+signaling.">Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling.</a> Mol Med. 18, 519-527 (2012).</li><li>Miller, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semapimod+sensitizes+glioblastoma+tumors+to+ionizing+radiation+by+targeting+microglia.">Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Goswami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+promote+the+invasion+of+breast+carcinoma+cells+via+a+colony-stimulating+factor-1/epidermal+growth+factor+paracrine+loop.">Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop.</a> Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).</li><li>House, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+functional+S100A4+monomers+are+necessary+for+regulating+nonmuscle+myosin-IIA+and+HCT116+cell+invasion.">Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion.</a> Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+status+of+cofilin+is+directly+related+to+invasion,+intravasation,+and+metastasis+of+mammary+tumors.">The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors.</a> J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).</li><li>Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+immunohistochemistry+as+a+novel+experimental+tool+for+the+detection+of+glioma+cell+invasion+in+vivo.">Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo.</a> Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Dobrenis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+cell+culture+and+in+transplantation+therapy+for+central+nervous+system+disease.">Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease.</a> Methods. 16 (3), 320-344 (1998).</li><li>Coniglio, S. J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+microglia+stimulated+glioblastoma+invasion.">Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion.</a> Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).</li><li>See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+regulatory+T+cells+and+microglia+in+glioblastoma-associated+immunosuppression.">The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression.</a> J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

yüksek dereceli astrositomların ve glioblastoma son derece invaziv doğası bu beyin kanserleri çok ölümcül olun. Bu glioblastoma işgali moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak nedenle büyük önem taşımaktadır. Çok glioblastoma işgali zaten 17 süreci hakkında öğrenilmiştir. 10 kat - Bu yazıda ayrıntılı tahlil formatları kullanarak, bizim laboratuvar tümörle ilişkili makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali uyarabilir, hem fare ve insan modellerinde gösterilmiştir. Bu Cocultu...

Glioblastom tanı 1,2 andan itibaren yaklaşık 12 aylık medyan sağkalım agresif bir insan beyin kanseri olduğunu. Glioblastoma standart kemoterapi ve cerrahi rezeksiyon refrakter olarak en ölümcül ve klinik zorlu kanserlerden biridir. glioblastoma yaygın doğası cerrahi tamamen rezeke gelişmiş tümör neredeyse imkansız hale normal beyinden yayılan tümör hücrelerini tanır. Bu son derece invaziv yönü glioblastoma ve diğer gelişmiş astrositomaların damgasını özelliğidir. Bu nedenle, bir çok çalışmanın odağıdır glioblastoma hücre istilası moleküler mekanizması olmuştur. Glioblastoma tümör mikro malignite 3-6 kurulmasında hayati bir rol oynar. Tümör ilişkili makrofajlar / mikroglia glioblastoma işgali 7,8 teşvik sorumlu olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmaların çoğu, ancak kullanarak makrofajlar / mikroglia etkisini ölçtükfiziksel glioblastoma hücreleri ayırmak tahlilleri. Laboratuvarımız bize glioblastoma işgali cocultures makrofajlar / mikroglia bağlıdır nasıl çalışması ve işgali sırasında görüntü aralarındaki fiziksel etkileşimi sağlayacak izin geliştirilmiş tahlilleri üretmek için yola çıkmıştır. Klasik deneyleri hücre işgali &quot;standart&quot; Boyden çemberinin kemotaksisini ve kemo-istila formatlarını içerir ölçmek için. çalışılacak Burada hücreler belirli bir boyutu (çapı genellikle arasında 0.4 ve 8 uM) gözeneklere sahip altında bir polikarbonat filtresi içeren plastik odasına yerleştirilir. hücrelerinin istilasını süreci genellikle hücre dışı matris proteini arasında oluşan fiziksel bir bariyer kapsar. kemo-istila deneyinde, kullanılan tercih edilen matris Matrigel (bundan böyle &quot;matris&quot; olarak anılacaktır), Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tarafından salgılanan bir hücre dışı matris proteini karışımı, fare sarkoma hücreleri ve büyük ölçüde col oluşmaktadırlagen tip IV ve laminin. Chambers, sonra ya da işgali uyarma şüphelenilen büyüme faktörleri olmaksızın hücre kültür ortamı ihtiva eden bir doku kültür çukuruna yerleştirilir. daha yüksek bir frekansta hücre dışı matris kaplı filtre ile istila ve filtrenin alt tarafına bağlı bir yüksek invaziv kapasitesine sahip hücreler. Biz glioblastoma hücre işgali üzerine mikroglia ve tümör ile ilişkili makrofajlar rolünü değerlendirmek için bu testte değiştirdiniz. 10 kat 9,10 - Biz mikroglia 5 iki glioblastoma hücre hatları işgali uyarabilir bu kağıt içinde açıklanan kokültürünün analizleri kullanılarak belirlemek mümkün olmuştur. Bu glioblastoma hayvan modellerinde gözlemlenmiştir yansıtan. Ayrıca, glioblastoma hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimler / mikroglia daha doğrudan incelenebilir üç boyutlu işgal tahlil geliştirildi. macropha ile uyarılan glioblastoma hücre invazyonu3D tahlilinde ges / mikroglia matrisi kaplı bölme yaklaşımı kullanılarak görülen şeyin karşılaştırılabilir. Benzer deneyler daha önce işgali 11-13 sırasında makrofajlar ile meme kanseri etkileşimleri incelemek için geliştirilmiştir. Bu yazıda anlatılan iki yöntem glioblastoma hücreleri makrofaj / mikroglia uyarılan işgali moleküler mekanizmasını (ler) incelemek yeteneği yardımcı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix</td><td>Corning/Fisher Scientific</td><td>Cat: 354481</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX Dye</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>GL261 cell line</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87 cell line</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (500 ml)</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 &amp;micro;M pore) 48 per pack.</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>Cat: 10500064</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated</td><td>Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

coculture assays to study macrophage and microglia stimulation of glioblastoma invasion

Glioblastom (Evre IV glioma) 1 yıl sonrası tanı medyan sağkalım çok agresif bir insan kanser türüdür. glioblastoma doğuran moleküler olayların daha iyi anlaşılmasına rağmen, bu kanser halen geleneksel tedaviye son derece dirençli olmaya devam etmektedir. yüksek dereceli beyin tümörlerinin cerrahi rezeksiyon nedeniyle glioblastoma hücreleri son derece infiltratif doğaya nadiren tamamlandı. glioblastoma hücre işgali hafifletir tedavi yaklaşımları dolayısıyla cazip bir seçenektir. Laboratuvarımız ve diğerleri bu tümör ilişkili makrofajlar ve mikroglia (ikamet beyin makrofajlar) kuvvetle glioblastoma işgali teşvik göstermiştir. Bu yazıda anlatılan protokol in vitro kültür analizleri kullanılarak glioblastoma-makrofaj / mikroglia etkileşimi modellemek için kullanılır. Bu yaklaşım büyük ölçüde bu habis Behav sağlayan makrofajlar ile iletişimi bozan ilaçların geliştirilmesi ve / veya keşif kolaylaştırabilirIOR. 10 kat - Biz mikroglia / makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali teşvik iki güçlü kokültürünün işgali testleri kurduk. Bir flüoresan işaretleyici ya da yapısal olarak bir flüoresan proteini ifade ile etiketlenmiş glioblastoma hücrelerinin matris kaplı polikarbonat odası ekler üzerinde olmayan ve makrofajlar / mikroglia ile kaplama ya da üç boyutlu bir matris içinde yer almaktadır. Hücre işgali filtrenin alt sadece invaziv hücreler görüntü floresan mikroskopi kullanılarak ve saymak tarafından değerlendirilir. Bu tahliller kullanılarak, çeşitli farmakolojik inhibitörleri (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib ve Semapimod) makrofaj blok tanımlanmıştır / mikroglia glioblastoma işgali uyarmıştır.

Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, mikroglia ve makrofajlar esas glioblastoma hücre istilasını uyarabilir göstermiştir. İki farklı invazyon tahlilleri kullanılabilir ve Şekil 1 &#39;de tasvir edilmiştir. Şekil 2&#39;de, kurucu floresan proteini MCherry eksprese GL261 hücreler ve 48 saat mikroglia olmayan önceden kaplanmış odaları ekildi. mikroglia invaziv kapasitesi yaklaşık 10 kat artarak, ancak zaman kültür GL261 hücreleri ...

Watch this Scientific Journal Video about Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion at JoVE.com

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

coculture-assays-to-study-macrophage-microglia-stimulation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.9K Görüntüleme.  Kean University. Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

Video: Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Kanser Araştırmaları

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite significant advances in the genetics of these tumors, how GBM cells invade the healthy brain parenchyma is not well understood. Notably, it has been shown that GBM cells invade the peritumoral space via different routes; the main interest of this paper is the route along white matter tracts (WMTs). The interactions of tumor cells with the peritumoral nervous cell components are not well characterized. Herein, a method has been described that evaluates the impact of neurons on GBM cell invasion. This paper presents an advanced co-culture in vitro assay that mimics WMT invasion by analyzing the migration of GBM stem-like cells on neurons. The behavior of GBM cells in the presence of neurons is monitored by using an automated tracking procedure with open-source and free-access software. This method is useful for many applications, in particular, for functional and mechanistic studies as well as for analyzing the effects of pharmacological agents that can block GBM cell migration on neurons.

Here, we present an easy-to-use co-culture assay to analyze glioblastoma (GBM) migration on patterned neurons. We developed a macro in FiJi software for easy quantification of GBM cell migration on neurons, and observed that neurons modify GBM cell invasive capacity.

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Tıp

<meta charset="utf8"></head><body>Makrofaj-Tümör Sferoid Etkileşimlerinin 3 Boyutlu Kollajen Matriks Kurulumunda İncelenmesi

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Direct-Contact Co-culture of Astrocytes and Glioblastoma Cells Patterned using Polyelectrolyte Multilayer Templates

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most abundant and fatal malignant brain cancer. There are more than 13,000 cases projected in the United States in 2020 and 2021. GBM tumors most often arise from astrocytes and are characterized by their invasive nature, often recruiting healthy tissues into tumor tissue. Understanding communication between astrocytes and glioblastoma cells is vital for the molecular understanding of tumor progression. This protocol demonstrates a novel patterned co-culture method to investigate contact-mediated effects of astrocytes on GBM employing layer-by-layer assembly and micro-capillary-force driven patterning. Advantages include a protein-free cell culture environment and precise control of cellular interaction dictated by the pattern dimensions. This technique provides a versatile, economical, reproducible protocol for mimicking cellular interaction between glioma and astrocytes in glioma tumors. This model can further be used to tease apart changes in GBM molecular biology due to physical contact with astrocytes or with non-contact mediated soluble cofactor communication.

<meta charset="utf8"></head><body>Polielektrolit Çok Katmanlı Şablonlar Kullanılarak Modellenmiş Astrositlerin ve Glioblastoma Hücrelerinin Doğrudan Temas Ko-kültürü

This protocol describes a patterned direct contact glioma-astrocyte co-culture utilizing micro-contact printing on polyelectrolyte multilayers (PEMs) to pattern U87 or A172 GBM cells and primary astrocytes.

Polielektrolit Çok Katmanlı Şablonlar Kullanılarak Modellenmiş Astrositlerin ve Glioblastoma Hücrelerinin Doğrudan Temas Ko-kültürü

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most abundant and fatal malignant brain cancer. There are more than 13,000 cases projected in the United States in ...

Biyomühendislik

Matrix-Based Tumor Invasion Model Using Microglia Glioblastoma Co-Culture

Source: Coniglio, S., et al.&#160;<a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53990">Coculture assays to study macrophage and microglia stimulation of glioblastoma invasion.</a> J. Vis. Exp. (2016)
In this video, glioblastoma and microglia cells are mixed with a polymer matrix solution and transferred to a porous chamber insert where a gel forms, embedding the cells. Microglia stimulate the migration of glioblastoma cells through the porous insert, mimicking tumor cell invasion into surrounding tissue, Cells are then fixed and prepared for further analysis.

Source: Coniglio, S., et al.&#160;Coculture assays to study macrophage and microglia stimulation of glioblastoma invasion. J. Vis. Exp. (2016)
In this ...

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Polielektrolit Çok Katmanlı Şablonlar Kullanılarak Modellenmiş Astrositlerin ve Glioblastoma Hücrelerinin Doğrudan Temas Ko-kültürü

Polielektrolit Çok Katmanlı Şablonlar Kullanılarak Modellenmiş Astrositlerin ve Glioblastoma Hücrelerinin Doğrudan Temas Ko-kültürü

Matrix-Based Tumor Invasion Model Using Microglia Glioblastoma Co-Culture