Name: analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning
Uploaded: 2016-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning at JoVE.com

Biz eleştirel okuma ve el yazması geliştirmek için Thomas Bates teşekkür ederiz. Biz de balık bakımı için Christina Ebert ve Sabrina Stötzer teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri &#39;laboratuvar hayvanları bakım İlkeleri&#39; yanı sıra Hayvanları Koruma Kanunu Alman geçerli sürümüne göre yapıldı. Antisens-Morfolino 1. Hazırlama (MO) <ol><li> 3 mm MO stok solüsyonu hazırlamak liyofilize MO (cam şişede 300 nmol) için steril aşırı saf su 100 ul ekleyin. Tam çözünme için, 5 dakika için 65 ° C stok çözeltisi ısıtılır. Parafilm ile şişeyi Seal ve oda sıcaklığında (RT), MO stok solüsyonu saklayın. Bu flakon duvarları ile MO arasında bir ilişki neden olabilir çünkü MO stok solüsyonu soğuk yok. </li><li> steril aşırı saf su ile MO stok çözelti seyreltilerek 1 mM MO çalışma çözeltisi hazırlayın ve% 0.05 arasında bir nihai konsantrasyona kadar% 0.5 fenol kırmızı bir çözelti ilave edin. <ol><li> Bir MO çalışma çözeltisinin 10 ul olsun 3.3 ul MO stok çözeltisi ve 5.7 ul su,% 0.5 fenol-kırmızısı çözelti 1 ul ekleyin. olmakçözeltisi yeni bir çalışma parti hazırlamak nedenle, 5 dakika boyunca 65 ° C&#39;ye kadar, MO stok solüsyonu ısıtın. </li></ol></li><li> İğne tıkanmasını önlemek için, santrifüj MO çalışma çözümü kullanmak önce. Örneğin, 5 dakika boyunca (RT) 15,000 xg&#39;de MO stok çözeltisi 10 ul spin ve enjeksiyon için süpernatan 8 ul çıkarın. NOT: aktivitenin kaybı zaman 11 üzerinde morfolino çözümleri ortaya çıkabilir. Bu hariç tutmak için, tek bir üretici tarafından sağlanan protokole uyularak, UV spektrometresi ile çözüm test edebilir. Düşürülmüş etkinliği uzun bir depolama süresi boyunca gözlenmemiştir morfolino kullanılan wt1a halinde (3 mM çalışma çözeltisi uzun bir daha depolanmıştır yıl). </li></ol> 2. Çiftleşme Çiftleri Kurma ve Koleksiyon döllenmiş yumurta <ol><li> Ayırmak için çıkarılabilir bir elek ile donatılmış bir ıslah kapta hattı, her biri: (GFP wt1b) Önceki mikroenjeksiyon öğleden sonra Tg beş çift ayarlamakGece boyunca kadın ve erkekler. NOT: çiftleşme çiftleri olarak kullanılan balık ön elemeden ve iyi &quot;üretici&quot; olarak değerlendirilmiştir gerektiği kadar yumurta başarılı bir enjeksiyon deney için kullanılabilir sağlamak. </li><li> ışıklar açıldıktan sonra ertesi sabah, yumurtalarını yiyip balık engeller elek üstünde birlikte erkek ve dişi koyun. </li><li> yumurtlama izleyin. 4-hücreli aşamasından önce enjekte edilebilir koyulur yumurta bir miktar yine kadın dan (yaklaşık 50), ayrı erkek ulaşıldığında. Enjeksiyon bir birinci tur embriyo su ile dolu bir petri Pasteur pipeti ile yumurta transferi. yumurta ilave mermi almak için bir araya ve ayrı birkaç kez çiftleşme çifti yerleştirin. </li></ol> Mikroenjeksiyon 3. Hazırlık Çalışmaları NOT: Önceden adımları 3.1 ve 3.2 gerçekleştirin. <ol><li> enjeksiyonu (mikroenjeksiyon çanak) sırasında pozisyonda embriyolar tutan bir tabak, bir gl eklemek hazırlamak içinSıvı, şeffaf, saf, gıda sınıfı silikon ile dolu bir 94 mm Petri kabı içine bir 40-45 ° açıyla eşek slayt. Silikon sertleşmiş olduğunda slayt çıkarın. Bu silikon katman bir oluk oluşturur. NOT: Alternatif olarak, silikon agaroz yerine 1.5-3% kullanımı ve 4 ° C&#39;de çanak saklayın. </li><li> Bir iğne çektirmesi ile cam kılcal damarlar enjeksiyon iğneleri oluşturun. <ol><li> İç filamentleri ihtiva kılcal kullanın. NOT: Filament (3.3) dolgu sonra iğne ucuna doğru MO çözüm taşımak için yardımcı olacaktır. </li><li> İğne çektirmesi uygun ayarları kurmak. Zebrabalıkları içine enjeksiyon için iyi iğneler ince uzun uçları 12 olması gerekir. yaklaşık 10 mm uzunluğunda ve en sonunda 1.5-2 um bir çapı olan ipucu oluşturur. = Hız = 40, Zaman = 100 0 çekin, Isı = 330: Örneğin, aşağıdaki ayarlarla yatay iğne çektirmesi kullanın. </li><li> Bir küçük iğne kalitesinin incelenmesidiseksiyon mikroskobu ve kısa veya çok uzun ipuçları ile bu sıralamak. NOT: Kısa ipuçları ile İğneler çok uzun ve ince ipuçları viraj böyle koryon dokunurken ise embriyo zarar eğilimindedir ve nüfuz etmezler. </li></ol></li><li> Bir Microloader ucu kullanarak MO çalışma çözeltisi 2 ul iğne dolgu ve mikroenjeksiyon cihazının iğne tutucu takın. </li><li> iğneler ucu sonunda kapalı olarak, diseksiyon mikroskobu altında keskin cımbız ile iğne çok ucunu arka kısma bir açıklık oluşturur. Alternatif hafifçe sert bir yüzeye (örn., Küçük metal blok ya da cımbız arka) ucu itmek için mikroenjeksiyon aparatı kullanın. </li><li> bir mercek ağı yerleştirilen mineral yağı bir damla halinde MO çalışma çözeltisi enjekte edilmesiyle, enjeksiyon hacmi kalibre edin. yaklaşık 200 ul bir enjeksiyon hacmi elde etmek için 75 um&#39;lik bir damla çapı üretilmesi için enjeksiyon süresini ayarlayın. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. mikroenjeksiyon Prosedürü <ol><li> İğne (oluk 45 ° açı doğru) nereden geldiğini yönünde bitkisel kutup mikroenjeksiyon çanak oluk boyunca 1-hücre sahne embriyolar düzenleyin. </li><li> koryon ve iğne ile yumurta sarısı delmek ve 2 hücreli embriyolar, 1- sarısı içine 1mM MO çalışma çözeltisi (0.2 pmol), 200 pl enjekte edilir. </li><li> geniş bir açıklığı olan bir Pasteur pipeti kullanılarak, embriyo, su ile doldurulmuş bir petri tabağına enjekte edilen embriyoların toplamak ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe. </li><li> Öğleden sonra, geniş bir açıklığı olan bir Pasteur pipeti kullanarak ölü embriyolar kaldırmak ve embriyo su yerine. </li></ol> In vivo görüntüleme için embriyo 5. hazırlanması <ol><li> Ertesi sabah, melanization inhibe% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) içeren embriyo su ile embriyo su yerine. gastrulasyon sonunda bunun nedeni interf önce PTU geçerli değildirerken embriyonik gelişimi ile eres. DİKKAT: PTU toksik ve teratojenik olduğunu. her zaman eldiven giyin ve solunması ve cilt ile temasa geçin. </li><li> istenilen gelişimsel aşamada bir diseksiyon mikroskobu altında keskin cımbız ile embriyolar Dechorionate. cımbız bir çift ile koryon kapmak ve cımbız ikinci bir çift ile koryon diğer tarafında kapmak için deneyin. Dikkatle embriyo aksatmadan zıt yönlerde cımbız çekin. </li><li> PTU (% 0.003) ve% 0.02 Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (Tricaine) içeren embriyo su ile PTU içeren embriyo su (% 0.003) değiştirerek embriyo anestezisi. </li><li> agaroz 50 mikron taşınma ızgara ile bir coverglass tabanlı μ-çanak düşük erime embriyo gömün. Uygun katıştırma bazı pratik gerektirir. <ol><li> 1.5 ml&#39;lik tepkime tüpleri içinde% 0.7 agaroz 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve 36 ° C&#39;ye ayarlanmış bir sıcaklıkta bir blok üzerinde koydu. Tra geniş açılması ile Pasteur pipeti kullanınμ-çanak embriyo nsfer. ultra-ince uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak aşırı embriyo suyu çıkarmak ve temperli agaroz ile embriyo kaplaması. </li><li> Agaroz halen sıvı iken, ilgi konusu yapının yanı sıra yer değiştirme ızgarasına mesafe ile ilgili olarak, arzu edilen bir konumda, iki jel yükleyici uçları embriyo yönlendirmek. ızgara ve yakın çevresinde: olarak (aşağı dorsal burada) cam alt mümkün olduğunca yakın ilgi yapısını (burada pronephros) yerleştirin. </li><li> En iyi görüntü kalitesi için alttan mümkün olduğunca yakın embriyo ilgi yapısını yerleştirerek embriyo ve cam alt kısmı arasındaki agaroz katmanı en aza indirmek. Bunun yanı sıra, ızgaraya yakın çevresinde embriyo bulun ama grid ilgi yapısı ile bindirme olmayacak özen gösterin. Farklı μ-yemekleri 3-4 embriyo her embed ve en iyi konumlandırılmış birini kullanın. </li><li> Agaroz zor olduğunda yeterince 2 için embriyo beklemek tutmak için-3 Dakika ve% 0.003 PTU ve% 0.02 Tricaine içeren embriyo su ile gömülü embriyo kaplaması. Fazla embriyo suyu süzün ya da ultra-ince uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak kaldırın. buharlaşmasını önlemek için kilit konumunda μ-çanak kapağını kapatın. NOT: Görüntü Kaydı zarar gibi, μ-çanak hava kabarcıklarının oluşumunu kaçının. </li></ol></li></ol> 6. Mikroskopi NOT: yapılandırılmış aydınlatma yoluyla optik kesit için donatılmış bir mikroskop kullanın. Çok kanallı, Z-Stack, Zaman Serileri, Yazılım otofokus ve Genişletilmiş Odak: aşağıdaki modülleri içeren bir yazılım ile rekor görüntüler. <ol><li> Z-yığınlarının kazanılması <ol><li> μ-çanak ters çevirin. cam alt şimdi objektif dönük ve μ-çanak, bir görüntüleme odası olarak hizmet vermektedir. </li><li> ızgara pozisyonuna kaydırıcıyı geçiş ve yazılım kontrolleri yapılandırılmış aydınlatma modunu etkinleştirin. </li><li> ayarlamaknumune ile seçim kanal (lar) için ızgara odak Odak Kalibrasyon Sihirbazı&#39;nın yönergeleri izleyerek (gömülü embriyo) incelenecek. </li><li> z-Stack edinme modunu etkinleştirmek ve merkez moduna ayarlayın. Numunenin ortasına odaklanın ve Merkezi&#39;ni tıklatarak z yığının merkez düzlemi olarak ayarlayın. merkez konumu etrafında aralığı tanımlayarak z yığının boyutunu ayarlayın. Not: nesne yapıları, birinci ve z yığın son düzlemi dışında keskin görülmemelidir. </li><li> Optik bölümler arasındaki boşluğu ayarlayın. En iyi z çözümü için optimal düğmesine tıklayın. Yazılım Nyquist kriter (% 50 örtüşme) Aşağıdaki önerilen mesafe koyacaktır alan hedefleri derinliği dayalı. Not: daha küçük dosya boyutları ve yapısı izni hedefleyen, el büyük bir aralık boyutunu ayarlayın. Tavsiye edilenden daha küçük adımlar ayarlanması sadece daha sonra arttırmadan daha büyük dosya boyutlarına neden olural bilgiler. </li></ol></li><li> Time-lapse Görüntüleme <ol><li> Zaman Serisi aracını açın ve zaman serisi deney aralığını ayarlayabilirsiniz. örnek kayıt z yığın görüntü 5 saat arasında bir süre boyunca her 30 dakika karıştırıldı. </li><li> zamanla odak kayması düzeltmek için, bir otofokus stratejisi kurdu. Focus Strateji diyalog kutusunu işaretleyin açılan listeden Yazılım Autofocus seçin ve referans kanalı olarak TL-aydınlık kanalı seçin. </li><li> otofokus ile her zaman başlangıç ​​noktası. optimize edilmiş bir zaman dilimi içinde güvenilir bir arama aralığı sağlamak amacıyla, sabit bir 200 mikron bağıl arama aralığını ayarlayın. Bu aralık tamamen maksimum adım boyutu (Numune parametresi) temel kalite (Kalite parametresi) ile (Aralık Kapsama parametresi) taranır. </li><li> Çevrede (odak ROI) ve pozisyon odağı bölgede ölçümü etkinleştirmek, otofokus hassasiyetini artırmak için faiz yapı etrafında canlı görüntü penceresinde odak ROI söyledi. NOT: EğerSistem time-lapse kayıt sırasında otomatik olarak merkez z konumunu günceller Yazılım otofokus modülü yoksun, belirli bir zamanda deney duraklatmak ve Odağı manuel olarak ayarlayabilirsiniz ve denemelerimiz devam ediyor. </li><li> Zaman serisi kayıt sırasında potansiyel bir xy-sürüklenme telafi etmek için, yazılım crosshair&#39;i içine (görüntüleme odasının) baskılı ızgara belirli bir noktaya yerleştirin ve bir ekran yaparak konumlandırma kaydedin. </li><li> Zaman serisi deney başlayın. Zaman serisi aralığı bitmeden gerekirse, konumlandırma ekran göre yeniden ayarlayın, deney duraklatmak ve. deney ile devam edin. </li></ol></li></ol> 7. Görüntü İşleme <ol><li> işleme sekmesine geçin ve Yöntem diyalog kutusunda Focus (EDF) Genişletilmiş Derinliği seçin. Optik bölümler elde edilen bu yana, resim serisi Maksimum Projeksiyon algoritması uygulanır. NOT: Burada algoritma br proje olacakightest ya bir birinci aşamada bir bileşik 2D görüntü istiften en koyu piksel ve en sonunda, her bir zaman noktası için bir sonucu görüntü olarak en varyansı kullanmak. </li><li> EDF resim serisi dışında bir zaman atlamalı film (örneğin avi veya hareket dosyası) oluşturmak için Film verme yöntemini kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Drummond, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function.">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li><li>Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+pronephric+filtration+apparatus+in+zebrafish+requires+Nephrin,+Podocin+and+the+FERM+domain+protein+Mosaic+eyes.">Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes.</a> Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Kreidberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt-1+Is+Required+for+Early+Kidney+Development.">Wt-1 Is Required for Early Kidney Development.</a> Cell. 74 (4), 679-691 (1993).</li><li>Bollig, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros.">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).</li><li>Schnerwitzki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+Wilms+tumor+suppressor+1+(Wt1)+exon+4+results+in+protein+isoforms+with+different+functions.">Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions.</a> Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).</li><li>Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+morpholino-based+screening+in+zebrafish.">Lessons from morpholino-based screening in zebrafish.</a> Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).</li><li>Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+fish:+efficient+selection+of+transgenic+fish+by+co-injection+with+a+fluorescent+reporter+construct.">Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+imaging,+Part+2:+an+overview+of+fluorescence+microscopy.">Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).</li><li>Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+structured+illumination+microscope.">Optimization and characterization of a structured illumination microscope.</a> Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros:+differential+control+by+wt1+and+ff1b.">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).</li><li>O'Brien, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1a,+Foxc1a,+and+the+Notch+mediator+Rbpj+physically+interact+and+regulate+the+formation+of+podocytes+in+zebrafish.">Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish.</a> Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).</li></ol>

yazar Michael Graf Bu maddede kullanılan aletleri üreten Carl Zeiss Mikroskopi GmbH&#39;nin bir çalışanıdır.

Zebra balığı insan hastalıklarının omurgalı gelişimi ve modelleme çalışmaları için popüler bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyolar saydam kalır, çünkü beyin ve kalp gibi gelişmekte olan organlar bir standart hazırlama mikroskobu kullanılarak görülebilir. organ spesifik floresan transgenik yararlanarak floresan mikroskobu ile yaşayan embriyoların içinde farklı gelişim aşamalarında organogenez değerlendirmelerini sağlar. Standart Epifloresans mikroskobu ile tüm organların yapısal ayrıntıları görüntüleme için bir sınırlama odak düzlemi üstündeki ve altındaki nesnelerin gelen sinyallerin etkisidir. Bu out-of-focus ışığı değil azalmış görüntü kontrastı ve çözünürlüğü sadece sonuçlar, aynı zamanda ilgi 13,14 önemli yapılarını gizleyebilir. Disk confocal- veya multiphoton mikroskobu iplik gibi lazer tarama confocal- olarak çeşitli teknikler, out-of-focus bilgisini ve böylece increas en aza indirmek için geliştirilmiştire görüntü kontrastı yanı sıra eksenel çözünürlük. Optik bölümleri elde etmek için alternatif bir yöntem lazerli ve tarama ücretsiz yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi, düzenli bir mikroskop 15 uygulamak basit ve geniş bir alan bazlı aydınlatma tekniğidir. Burada sunulan sonuçlar mikroskop uygulanan ve genişletilmiş odak görüntüleri yeniden birlikte yapılandırılmış aydınlatma elde optik kesit, normal yapısal detayları görselleştirme sağladığını göstermektedir ve Zebra balığı böbrek gelişimini rahatsız. Özellikle, wt1a morphants GFP-pozitif hücreler değişik odak derinliklerde disperse edilir ve dışı olma odaklama bulanıklık sadece tek bir düzlemde görüntüleri fenotipi üç boyutlu karmaşık hafife olacaktır. Organ organizasyonu, düzenlenmesi ya da bozulma dinamiklerini takip etmek, zaman atlamalı floresan mikroskopi karmaşık tekniği olsa bir güçlüdür. time-lapse sırasındagörüntüleme hafif titreşimler veya küçük sıcaklık dalgalanmaları x, y veya z yönünde sürükleniyor neden olur. Bu istikrarlı sonuçlar elde etmek için ek donanım (çevre odasını, titreşim önleyici tablo) gerektirir. sunulan yöntem ekstra cihazlar olmadan zaman atlamalı görüntüleri kaydetmek için motorlu odak sürücü ile bir mikroskop yeteneği kullanır. istikrarlı bir odak sağlamak için, bir otofokus stratejisi kurulmuş ve görüntüleme odasının dibine baskılı bir tehcir ızgara x düzeltilmesi, y istikrarsızlık kullanıldı. embriyonun uygun gömme protokolü içinde kritik bir adımdır. Bazı uygulama onunla bindirilirken olmadan ızgara olarak cam alt mümkün olduğu kadar yakın ve yakın çevresinde ilgi yapısını yerleştirmek için gereklidir. yöntemin en önemli avantajı bu tür yaşam büyüme ve göç gibi gelişim süreçleri doğrudan gözlem için uygun fiyatlı ve basit bir araçtır olmasıdırbirkaç saat boyunca embriyolar. Ayrıca, bu tür görünüm ve genişletilmiş çalışma mesafesi geniş alanı olarak diseksiyonu mikroskop özgü yararları bütün organları dahil büyük örneklerin incelenmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, bazı sınırlamalar göz önünde tutulması gerekir. Kontrol ve konumlandırma yeniden ayarlamak için deney duraklatma işlemi zaman alıcı ve sağlam bir sıcaklık kontrolü yokluğu zebrabalıkları 16 28.5 ° C&#39;de saat sonra döllenme olarak tanımlanan &quot;standart&quot; gelişimsel zaman, değişiklikleri yapar. Bir diğer potansiyel sorun çıkar yapısı embriyo veya larva içinde bulunan, özellikle hayvana görüntüleme kısıtlı derinliğidir. Böyle bir yapı Somitlerin ve yolk kesesi arasında yer almaktadır Zebra balığı Pronephric glomerulus vardır. glomerul görüntüleme için sınırlayıcı derinliği yaklaşık 200 um, gelişme 5 gün sonra ulaşılır bir mesafe olduğu bulunmuştur. Bunun aksine, L flüoresan yapılar olduğuDaha uzun bir süre için görüntülenebilir hayvanın yüzeyine yakın ocated. Örneğin karaciğer hücreleri en az 9 dpf&#39;e kadar görüntüleme için erişilebilir. Bir başka sınırlama agaroz ve Tricaine tedavisinde embriyo veya larva uzun süreli immobilizasyon sırasıyla büyüme geriliği ve kalp ödemi neden olmasıdır. Bu normal gelişim engel olabilir, çünkü ilgi belirli bir süre için time-lapse kayıt süresini kısıtlamak için önerilmektedir. ilgi görüntüleme yapılarının sırasında emin olmak için bir hayvan olduğu ile genel görünümünü aynı deney koşulları altında, ancak gömme ve Anesthetization olmadan muhafaza (sonunda) karşılaştırmak yararlı olur normalde gelişir. 5 saat ve odak görüntü uzatılmış derinliği daha sonra hesaplama bir süre boyunca her 30 dakikada bir, normal erken olayları mekansal ve zamansal bilgiler ve optik kesit bir z-yığın kayıt b indüklenmiştir böbrek gelişimi rahatsızy wt1a ve demonte morfolino aracılı. Sabit zaman görüntüleme pronephros geliştirilmesi için GFP hattı 9,10 işaret ortaya. Daha önce gerçekleştirilen morfolino demonte deneyler Mevcut böbrek markör 17,18 ve transjenik wt1b istihdamı in situ hibridizasyon Wt1a pronephros oluşumunda bir erken ve gerekli bir rol oynadığı göstermiştir kesintiye glomerüler morfojenezinde o wt1a eksikliği sonuçları ve podosit şartname başarısız oldu. Bu statik yaklaşımların aksine, zaman atlamalı kayıtları doğrudan erken kontrol embriyolar nefrogenezisi ve wt1a morphants uzak Pronephric bölgeden GFP pozitif hücrelerin göç dinamiklerini görselleştirmek. zamanla yanlış yönlendirilmiş hücreleri izlemek için olasılık daha detaylı fenotip analiz sağlar. Genel olarak, burada sunulan yöntem sağlayan ucuz ve karmaşık alternatif kullanımı kolay ve daha az erişilebilir setups normalde böyle (bir çevre odasına ve anti-vibrasyon masası ile donatılmış) lazer tarama mikroskobu veya hafif levha mikroskop gibi zaman atlamalı görüntüleme için kullanılır. sürüklenme sorunları gidermek için açıklanan rutin ayrıca floresan stereo mikroskop gibi optik kesit seçenekleri olmadan kurulumları zaman atlamalı görüntüleri gerçekleştirmek için uygulanabilir. tekniği, sadece böbrek gelişimi araştırmak için uygundur, ancak, aynı zamanda, kalp, karaciğer ve diğer organların normal ve kusurlu morfonogenezi izlemek için uygulanabilir. Bundan başka, metot, yara iyileşmesi veya rejenerasyonu embriyonik ve yetişkin model organizmaların çeşitli dinamik işlemleri gözlemlemek için kullanılabilir.

gastrulasyon ardından, organogenesis bir bireyin yaşam döngüsünün bir sonraki aşamasıdır. Bu doku ve organların üretmek için yeniden düzenleme, etkileşim ve hücrelerin çok sık göç içerir. organların gelişimini altında yatan süreçlerinde yanlışlık genellikle ileri yaşlarda hemen ya da kendilerini ortaya çıkabilir hastalıklara yol açar. Böylece, organogenezi anlama gelişimsel biyoloji ve biyomedikal araştırmalarda önemli bir çaba olmuştur. Belli bir organ gelişimine araştırmak edebilmek için, bu da embriyo gövde duvarı aracılığıyla görünür olması gerekir. Bu gelişim sırasında meydana gelen mekansal ve zamansal değişikliklerin kaydedilmesini sağlar. Ayrıca organogenez katılan faktörlerin önemi analiz etmek amacıyla, bu manipülasyon duyarlı olması gerekir. In vivo organogenez soruşturma son derece uygun olan bir organizma Zebra balığı olduğunu. onun transparFloresan transgenik hatların kullanımı ile kombinasyon halinde, embriyonik gelişimi sırasında Ensi protein lokalizasyonu ve ifade dinamiklerinin gözlem, aynı zamanda, iç organların 1 görselleştirme sağlar. Bu kimin organları mikroskopik analiz için erişilemez memeli modellere göre gerçek zamanlı olarak, organ gelişiminin soruşturma ile ilgili benzersiz bir avantaj sağlar. Ayrıca, farklı araçlar zebrafish embriyo gelişimini işlemek için kullanılabilir. Mutant çizgilerinin üretilmesine yanında, antisens morfolino oligonükleotitler (MO), bazı organların gelişiminde dahil olan belirli bir gen aktivitesinin demonte etmek için kullanılabilir. MOs bir ekleme sitesi veya translasyon başlangıç ​​kodonunu (Ağustos) hedef ve böylece ön-mRNA veya çeviri eklenmesine engel ya. Zebra balığı embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimi ve gen işlevini incelemek için anatomik basit ama değerli bir modeldirböbrek hastalıklarının 2 ile ilgili es. Bu nefron denilen sadece iki fonksiyonel birimden oluşmaktadır. Her nefron kan filtrasyon yer 3 alan bir glomerulus oluşur. Ayrıntılı bileşenler kısa boyunlu bölgenin yanı sıra kloakanın 4 biter sekresyon ve çözünen maddelerin reabsorbsiyonunun ve kanal için parçalı borucuk vardır. Ne olursa olsun basit kompozisyon, organizasyon ve zebra balığı pronephros farklı hücre tipleri memeli böbrek 5,6 çok benzer. Böbrek gelişiminde kritik rol oynayan bir faktör, Wilms Tümör baskılayıcı gen WT1 7 tarafından kodlanmıştır. Balığı wt1a adlandırılan iki paralog sahiptir ve pronephros 8 geliştirilmesi sırasında üst üste binen, ancak aynı desen içinde ilave edildiği, wt1b. GFP-etiketli pronephros yapılarla transgenik zebrafish kullanılarak, wt1a &lt;o tam devirerek gösterilmiştir/ em&gt; veya belirli bir ekleme formu embriyonik böbrek ağır ya da hafif malformasyonlar, sırasıyla 9,10 yol açar. Burada anlatılan yöntemi yapılandırılmış aydınlatma yoluyla optik kesit için donatılmış bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak Zebra balığı embriyolarının normal ve bozulmuş nefrogenezisi zaman atlamalı analiz sağlar. Genel olarak optik kesitler sadece odak içi bilgi içeren görüntü edinme sağlar. Out-of-odak bilgiler, matematiksel algoritmalar (örn. Deconvolution), optik tasarım (örneğin Konfokal lazer tarama mikroskopisi) ya da her ikisinin kombinasyonu (örneğin yapılandırılmış aydınlatma) gibi çeşitli yaklaşımlarla önlenebilir. Böbrek geliştirme kusurları neden biz bir antisens bir transgenik zebrafish hattı enjekte edildi wt1a karşı MO (GFP) Tg (wt1b) kullanılır. Bu hat glomerulus, boyun ve ön GFP floresan gösterirtübül 9,10 parçası. Böyle lazer tarama veya hafif levha mikroskoplar gibi optik kesit ile time-lapse kayıtları için daha karmaşık kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir yakınlaştırma mikroskop kullanımı kolay ve ucuzdur. Ayrıca, yapılandırılmış aydınlatma ekipmanı kolayca uzun bir çalışma mesafesi ve bakış geniş alanı olarak geleneksel floresan ekipmanı (örneğin floresan lamba, filtreler) ve mikroskop özel avantajlar diseksiyon teklifler ile kombine edilebilir. sürüklenme ile ilgili sorunlar genellikle istikrarlı sonuçlar için gerekli olan ek donanım (çevre odasını, titreşim önleyici tablo) kullanmadan çözüldü. bir otofokus stratejisi kurulmuş ve baskılı taşınma ızgaraları ile görüntüleme odaları x veya y yönünde bir sürüklenme aşağıdaki konumlandırma yeniden ayarlamak için kullanılmıştır odak kayması için düzeltmek için. Bu çözümler aynı zamanda, floresans, stereo m optik kesit amaç olmadan mikroskoplar uygulanabiliricroscopes ve normal gelişim gösteren dokular ve organ dinamiklerinin zaman atlamalı kayıt için kullanılan daha karmaşık ekipman için bir alternatif sunuyor.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control Morpholino</td><td>Gene tools, LLC</td><td>Standard control oligo</td><td>Prepared&amp;nbsp;control&amp;nbsp;oligo</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;wt1a&lt;/em&gt; Morpholinos&amp;nbsp;</td><td>Gene tools, LLC</td><td>customized</td><td>Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. &lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>0.5% Phenol red solution</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Injection tracer</td></tr><tr><td>peqGOLD universal agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td>To prepare microinjection dish</td></tr><tr><td>Glass capillaries&amp;nbsp; (GC100F-10)</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>30-0019</td><td>To generate injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>To load the microinjection needle</td></tr><tr><td>Dumont forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Sience Tools</td><td>91150-20</td><td>To generate an opening at the needle tip&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Embryo water (0.3x Danieaus&amp;acute; solution)</td><td></td><td></td><td>1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;,&amp;nbsp; 0.6 Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue!</td></tr><tr><td>Graticule 5 mm/0.05 mm</td><td>Science Services</td><td>PY68039-02</td><td>For calculation of injection amount</td></tr><tr><td>Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml</td><td>Roth</td><td>E305.1</td><td>To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos</td></tr><tr><td>Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml</td><td>Roth</td><td>E304.1</td><td>To remove excess of water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>For suppression of melanization</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>To anethesize zebrafish</td></tr><tr><td>Low melting agarose</td><td>Biozym</td><td>850111</td><td>For embedding&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;micro;-dish&lt;sup&gt; 35 mm, high&lt;/sup&gt; Glass Bottom Grid-50</td><td>ibidi</td><td>81148</td><td>Imaging chamber</td></tr><tr><td>Gel loader tips</td><td>Hartenstein</td><td>GS05</td><td>To orient the embryo for proper embedding</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller (model P-97)</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>To generate injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Saur Laborbedarf</td><td></td><td>For microinjection</td></tr><tr><td>Thermomixer copact</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermoblock for tempering the low melting agarose</td></tr><tr><td>SZ61 (Stereomicroscope)</td><td>Olympus</td><td></td><td>For injection control</td></tr><tr><td>Axio Zoom. V16</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For embedding and imaging</td></tr><tr><td>ApoTome.2 slider</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For optical sectioning</td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Zeiss</td><td></td><td>For image acquisition&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZEN 2012</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging software</td></tr></tbody></table>

analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning

organogenez anlamak için, doku gelişimi sırasında meydana gelen uzamsal ve zamansal değişiklikler kaydedilmesi gerekir. Burada anlatılan yöntemi yapılandırılmış aydınlatma ve z-yığın edinimi için donatılmış bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak Zebra balığı embriyolarının normal ve bozulmuş böbrek gelişiminin time-lapse analiz sağlar. Ile floresan etiketli böbrek yapıları kullanılmıştır: nefrogenezisi, transgenik zebra balığı (GFP) Tg (wt1b) görselleştirmek için. Böbrek kusurları Wilms tümörü geni wt1a, böbrek gelişimi için çok önemli olduğu bilinen bir faktör karşı antisens morfolino oligonükleotid enjeksiyonu ile tetiklenmesi. deney düzeneği avantajı ek donanım olmadan x, y veya z yönünde yeniden ayarlama hareketler için basit stratejileri ile zoom mikroskop birleşimidir. sıcaklık değişimlerine ve mekanik titreşimler tarafından uyarılan odak kayması aşmak içinBir otofokus stratejisi yerine genellikle gerekli çevresel odasını kullanan uygulandı. nedeniyle xy-sürüklenme için konumsal değişiklikler yeniden ayarlamak için, baskılı tehcir ızgaraları ile görüntüleme odaları istihdam edilmiştir. Böyle konfokal lazer tarama veya hafif levha mikroskoplar gibi optik kesit ile time-lapse kayıt için daha karmaşık kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir yakınlaştırma mikroskop kullanımı kolaydır. Ayrıca, bu tür alan yüksek derinliği ve uzun bir çalışma mesafesi olarak mikroskop özgü yararları diseksiyon sunmaktadır. Burada sunulan organogenez çalışma yöntemi aynı zamanda optik olarak kısımlara ayırma yeteneğine sahip değildir Flüoresans stereo mikroskobu ile birlikte kullanılabilir. yüksek verimlilik için sınırlı olmasına rağmen, bu tekniğin normal gelişim gösteren dokular ve organ dinamiklerinin zaman atlamalı kayıt için kullanılan daha karmaşık ekipman için bir alternatif sunuyor.

Time-lapse mikroskopi uzun bir süre boyunca dinamik biyolojik süreçleri izlemek için güçlü bir tekniktir. Time-lapse görüntüleme sırasında sık meydana gelen bir sorun sıcaklık değişimlerine ve mekanik titreşimler tarafından uyarılan sürüklenme denir x, y veya z yönünde bir hareket, olduğunu. Burada sunulan yöntem, çevre odasında ve anti-vibrasyon tablo olmadan bir diseksiyon mikroskobu Zebra balığı embriyolarının veya larva içinde floresan etiketli yapıları kayıt time-lapse sağlar. Xy-sürüklenme tazmini için, numune bir baskılı tehcir ızgara (Şekil 1) ile bir görüntüleme odasında gömülü idi. Yazılım aracı kursöre ilgili ızgara belirli bir noktasının konumu önceden ayarlanmış bir konumda (Şekil 2A) için numune dönmek için kullanılmıştır. Sunulan sonuçlar, bir yakınlaştırma mikroskobu kullanılarak elde edilmiştiryapılandırılmış aydınlatma (Şekil 2B) üzerinden optik kesit için entegre bir kaydırıcı ile. Sürekli odak düzeltme, bir otofokus stratejisi kuruldu. Bu stratejide, yazılım otofokus her zaman noktasından önce maksimum kontrast dayalı odak bulmak için kullanılır. Bu yüzden tanımlanmış odak düzlemi sonradan z yığın edinimi için merkez planı olarak ayarlanır. Otofokus aşama (Şekil 2C) esnasında yeterince kısa bir kalma süreleri verir gibi numunede fototoksisite en aza indirmek için, iletilen ışık aydınlık kanalı referans kanalı olarak kullanılır. Yöntem, bir transgenik zebra balığı hattının kontrol ve wt1a morphant embriyolar (GFP) Tg (wt1b) böbrek gelişimi karşılaştırmalı analizi uygulandı. Erken nefrogenezisi sırasında bu hat böbrek atalarıdır 9,10 ve daha sonra ortaya çıkan, orta tabaka mezodermin yeşil floresan gösterirşekillendirme tübüller ve nefron primordia (Şekil 3). Time-lapse görüntü kayıt kontrol morfolino enjekte edilen embriyolar nefrogenezisi (sonuçlar gösterilmemiştir) uninjected olanlar karşılaştırıldığında değiştirilmemiş ve erken zebrabalıkları böbrek gelişimi 3 açıklanan adımları takip ettiğini ortaya koymaktadır. Gelişmekte olan Pronephric tübüller hpf 20 görünür ve onların ön ucunda at, şekillendirme nefron Primordia temsil hücrelerin küresel birikimleri, tespit edilebilir. Bir sonraki saatlerinde, tübüller ve nefron taslakları büyür ve daha sonra primordia üzerinde orta hat (Şekil 4, Video 2) de kaynaşmaya başlar. Bunun aksine, nefrogenezisi ciddi wt1a morphant embriyolarda bozulur. GFP-pozitif boru şekilli yapılar 20 hpf görebilir de, daha yaygın ve daha az gelişmiş olduğu görülmektedir. Ayrıca, hiçbir şekilde nefron taslakları oluşturulmuştur. En çarpıcı fark tAncak o gelişmekte pronephros (Şekil 4, Video 2) dışında floresan hücrelerin çok sayıda ortaya çıkmasıdır, bu zaman noktasında kontrol embriyolarına. Daha sonra, bu hücreler Pronephric alanını terk ve ventral (Video 2) göç. Kontrol embriyo ve wt1b transgenik hattın wt1a morphants Böbrek gelişme, daha önce farklı sabit zaman noktalarında 9,10 görüntüleri alarak karşılaştırılmıştır. Bu statik yöntemi aksine, time-lapse kayıt normal nefrogenezisi ve wt1a tükenmesi nedeniyle böbrek progenitör hücrelerin yanlış iletilmesi dinamiklerini takip etmesini sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig1.jpg" /> Şekil 1: Tehcir Izgaralar ile Ticarete Elverişli Odası Gömülü Embriyo şematik İllüstrasyon. çanak varDört ızgaralar, her biri bir cam lamel altına baskılı 50 um bir tekrarlanma mesafesi bölünmüştür. Yansıması için embriyo bir gözlem kareye yakın böbrek yapısı ile, baş aşağı gömülü ama ızgara ile kaplanacağı olmadan. Olan <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53921/53921fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig2.jpg" /> Şekil 2:. Time-lapse Görüntüleme ve Yapılandırılmış Aydınlatma Izgara Projection içinde Drift Tazminat için ayarlamalar taşınma ızgara bir farklı pozisyon görüntü merkezi haline getirildi (sarı crosshairs ile işaretlenmiş) ve daha sonra xy-uyum için bir referans noktası olarak hizmet küçük vardiya halinde. Kırmızı dikdörtgen otofokus stratejisi (A) kullanılan faiz (ROI) bölgesini temsil eder. Optik kesit wayapılandırılmış aydınlatma ile elde s. Görüntü doğru kalibrasyon (B) sonrasında odak düzlemi öngörülen bir ızgara yapısını göstermektedir. Otofokus stratejisi (kırmızı dikdörtgen) için ROI faiz (C) yapısına güvenilir otomatik netleme sağlayan (Somitlerin burada) aksine yüksek ayırt edici embriyonik yapıların kapsayacak şekilde ayarlanır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53921/53921fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53921/53921fig3.jpg" /> Şekil 3: Transgenik wt1b. Yeşil Floresan ile GFP Embriyolar Gelişmekte Böbrek dorsal (A) veya yan (B) iletim ve floresan görüntüleri Kaplamaları sol anterior gösterilir. np, nefron primordium; nk, Pronephric tübül; Eh işteakar. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53921/53921fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53921/53921fig4.jpg" /> Şekil 4: wt1a demonte Embriyonik Böbrek Geliştirme bozan Temsilcisi time-lapse kayıtları odak görüntüleri genişletilmiş derinliği.. Kontrol morfolino enjekte edilen embriyolar, böbrek gelişme orta hatta sigorta başlangıç ​​büyüyen tübüller ve nefron primordiasında normal ilerleme gösterir. Bunun aksine, wt1a morphants uygun nefron Primordia formu başarısız ve GFP pozitif hücrelerin büyük bir miktarı Pronephric alanının dışındadır. (np, nefron primordium, pt, Pronephric tübül). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53921/53921fig4large.jpg" target="_blank">Bu fi büyük halini görmek için tıklayınız</a>şekil. <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53921/co-MO.mov" target="_blank">Kontrol morfolino enjekte edilen embriyoların normal böbrek gelişiminin Ek Video 1. Time-lapse kayıt. . (Sağ indirmek için tıklayın)</a> tübül büyür ve nefron taslakları kaynaştırmak başlar nasıl bir video gösterir. 20 HPF başlayarak, görüntü 5 saat arasında bir süre boyunca 30 dakika aralıklarla alındı. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53921/wt1a-MO.mov" target="_blank">Wt1a morphant embriyolarda rahatsız nefrogenezisi arasında Ek Video 2. Time-lapse kayıt. (Sağ indirmek için tıklayın).</a> Video Pronephric bölge dışına GFP pozitif hücrelerin göçünü gösteriyor. 20 hpf başlayarak, görüntüler 30 mi alınmıştır5 saat arasında bir süre boyunca N aralıkları.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning at JoVE.com

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

analysis-zebrafish-kidney-development-with-time-lapse-imaging-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Görüntüleme.  Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute (FLI).  Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar. 

Video: Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Gelişim Biyolojisi

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Polikistik Böbrek Hastalığı Olası Zebra balığı Modeli: demonte<em&gt; Wnt5a</em&gt; Zebra balığı Böbrekler Kistler Nedenler

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Tıp

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

Oküler Morfogenezi Lightsheet Microscopy ile rx3:GFP Transgenik Zebra Balığı Kullanarak Görselleştirme

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biyoloji

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...