NIH tarafından desteklenen sej için R01HL105635 verin. Yazarlar teknik danışmanlık için Diego V. Bohórquez teşekkür etmek istiyorum. Biz de teknik yardım için R. Ian Cumming teşekkür ve Duke İnsan Aşı Enstitüsü Araştırma Sitometrisi Paylaşımlı Kaynak Tesisi (Durham, NC) flow sitometri gerçekleştirmek. sitometri Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (adet UC6-AI058607) dan yapımı için kısmi destek aldı Duke Bölgesel biyosınırlılık Laboratuarında gerçekleştirilmiştir Akış.

Hayvan denekleri Prosedürleri Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Hızlı Mavi 1. Burun İdaresi Hızlı Blue, en az 2 gün fare ötenazi önce boya yönetmek. boya sekiz hafta boyunca devam edecektir. <ol><li> yavaş başlar nefes kadar hafif inhalasyon anestezisi (% 2.5 sevofluran) ile fare anestezisi. </li><li> Fareyi sağlamak için zaman zaman duraklayarak, yavaş yavaş burun deliğine boya solüsyonu 40 ul (0.4 mM Hızlı Mavi,% 1 dimetil sülfoksit, DMSO, fosfat tamponlu tuz, PBS) aşılamak için filtrelenmiş ipuçları ile 200 ul pipet kullanın çözümü aspire edilir (Şekil 1A). </li><li> Dikey fare tuşunu basılı tutun başkanlık ve yavaşça boya akciğerlere yayılır sağlamak için göğüs masaj yapın. </li></ol> Diseksiyon ve Analiz gününde 2. Hazırlıklar <ol><li> 10 ml hazırlayın0, tablo 1 &#39;de belirtildiği gibi bileşenleri karıştırarak Ganglion ayrışma çözeltisi (GADS). </li><li> özel bir laboratuvar alanında RNA çekimini gerçekleştirebilecek. deney,% 70 etanol,% 10 çamaşır suyu ve RNaz dekontaminasyon reaktifi ile temiz yüzeyler başlamadan önce. Bu RNA santrifüj, herhangi bir tüp rafları ve pipet içermektedir. RNA kullanım için özel filtre ucu kutuları vardır emin olun. Bu örnekler kontamine olarak, DNA hazırlığı için bu ekipmanı ve bölgeyi kullanmayın. </li><li> RNaz içermeyen su ile, taze% 70 ve% 80 etanol karıştırın. örnek başına 1 mi, RNA ekstraksiyonu kullanılmak üzere hazırlanır. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> miktar </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 </td><td> 9.5 mi </td></tr><tr><td> glutamin </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> N2 takviyesi </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> B27 (vitamin A) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> NGF (50 ug / ml) </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Ganglion Ayrılma Çözüm (GADS&#39;nin) Tablo 1. Reaktif Karışımı. 3. Diseksiyon Prosedürü <ol><li> 500 ul GADS, her bir deney numunesi için bir pozitif ayıklama kontrol için bir ve negatif ayıklama kontrol için bir tane olan 1.5 ml tüpler doldurun. diseksiyon boyunca buz üzerinde saklayın tüpleri. </li><li> boğumlu ganglion inceleyin ve ayrışma kolaylaştırmak için iki kısmi kesimler yapmak, daha sonra deneysel örnek tüpüne koyun. Boğumlu ganglionlar 16 ve DRG 17 diseksiyon için aşağıdaki vallahi protokolü bakınız. </li><li> sıralama kontrolleri için, incelemek ve kısmen böyle dorsal kök gangliyon (DRG) olarak etiketli olmayan ganliyonunu kesti. Pozitif kontrol ve iki Gangli için iki ganglionlar kullanınNegatif kontrol için, bir. </li><li> Başarılı sıralama için yeterli boğumlu nöronlar elde etmek için, bir deney örnek tüpü içeren GADS&#39;yi içine 5 farelerden alınan ganglionlar birleştirir. </li></ol> 4. Duyu Ganglion Ayrılma <ol><li> tüp içinde ganglionlar bırakarak, 500 ul GADS&#39;yi dışarı pipetle. ganglionlar sonra, tüpün dibine yerleşmek PBS dışarı pipetle için 1 ml PBS ekleyerek bir kez ganglionlar yıkayın, bekleyin. </li><li> 1 mi GADS ve sindirim enzimi 22 ul (kolajenaz I / II ve proteaz karışımı, 2.5 mg / ml H2O) için her bir tüp ekleme. </li><li> Pozitif kontrol tüpüne 20 ul Hızlı Mavi (5.26 mM) eklenir. </li><li> daha önce 37 ° C&#39;ye ayarlanmış bir su banyosu ya da ısıtma bloğunda tüpleri koyun. Not: ganglion sindirim zaman sindirim enzimi yaşına bağlıdır. 6 ay 45 dakika süreyle sindirmek - 2 içinde sindirim enzimi çözülmesi 1 ay içinde, 30 dakika boyunca sindirmek. Enzim 6 aydan eski ise, gangliyon f sindirmekya da 60 dakika. </li><li> Her 15 dk sallamak tüpleri kısaca ve ganglionlar sağlamak için onları fiske çözümü ile kaplıdır. </li><li> gangliyon dijeste edilir ve bu esnada bir partikül (polivinilpirolidon ile kaplanmış koloidal silis parçacıkları) kullanılarak yoğunluk gradyanları hazırlar. <ol><li> GADS&#39;de% 12 parçacık çözümü, numune başına 500 ul karıştırın. </li><li> GADS&#39;de% 28 parçacık çözümü, numune başına 500 ul karıştırın. </li><li> Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde, her bir numune için yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içinde 400 | il% 28 yoğunlukta çözeltisi üzerine 400 ul% 12 yoğunlukta çözeltisi ilave edilir. iki kat karıştırmak için izin vermeyin. İki farklı katmanlar tüp içinde görünür olmalıdır; Diğer daha koyu bir. </li></ol></li><li> ganglion sindirilir edilirken, (sıralama numune başına bir Hızlı pozitif Mavi ve bir Hızlı Mavi negatif tüp) sıralama için yeni 1.5 ml toplama tüpleri etiket. interfer etmeyecek şekilde sıralama tesis gereksinimlerine bağlı olarak, bu tüpler sökülebilir kapaklar olmalıdırhücre sıralayıcı ile e. </li><li> Uygun sindirim süresinden sonra, sindirim enzimi ile GADS çıkarın ve 1 ml PBS ile iki kez ganglionlar yıkayın. Her tüpe taze GADS&#39;nin 200 ul ekleyin. </li><li> ayrı hücreler kırmak için yukarı ve aşağı birkaç kez 100 ul hacme ayarlanmış 200 ul pipet, ve pipet ganglion kullanın. doku bozulmamış bir parça görülmektedir kadar tekrarlayın. çözeltide kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden ayrışmış hücrelere geçerler. </li><li> Sol kalan sokak hücreleri pick up ve hücre süzgecinden ek çözüm geçmek için orijinal ayrışma tüpüne başka bir 100 ul GADS&#39;yi ekleyin. Yeni bir pipet ucu kullanarak, süzgecinden geçirildi ve örgü sarıldı herhangi bir kalan hücre ihtiva eden sıvı toplanması. GADS&#39;de asılı hücrelerin son hacim 300 ul olduğunu. </li><li> Dikkatle önce yapılmış yoğunluk gradyanı üstünde hücrelerinin 300 ul katman. kabarcıkları önlemek ve c karıştırmayoğunluklu tabakalar arşın. </li><li> RT&#39;de 2,900 x g&#39;de 10 dakika süre ile santrifüjlenir. </li><li> Hücreler santrifüj iken aşağıdaki gibi lizis tamponu (deneysel örnek başına 1 mi) karışımı: 10 ul 2-merkaptoetanol (RNA ekstraksiyon kiti), 1 ml tampon RLT bölgesindeki. <ol><li> Hızlı Mavi pozitif toplama tüpüne 300 ul lizis tamponu ve Hızlı Mavi negatif toplama tüpüne (adım 4.7 etiketli tüpler) 600 ul ekleyin. Bu hacim, tahsil edilmesi beklenen hücre sayısına bağlıdır. 7.000 hücreleri 600 ul için &lt;2.000 hücreleri, 300 ul ekleyin&gt;. Bu anlamlı lizis tamponu sulandırmak değil sıralama kılıf sıvısı sağlayacaktır. </li></ol></li><li> Santrifüj tamamlandıktan sonra, dikkatlice çıkarın ve üst 700 ul katmanı atın. Bu katman, aksi takdirde hücre sıralama engel olacak hücre enkaz çoğunluğunu içerir. </li><li> çözümü ve pipet içeren kalan hücreye 700 ul taze GADS&#39;yi eklete yukarı ve aşağı birkaç kez karıştırın. </li><li> pelet hücreleri 2.900 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Hücreler santrifüj iken, 1 mi GADS 5 ul DNase (10 mg / ml) eklenerek GADS (numune başına 500 ul) sıralama karıştırın. </li><li> santrifüj yapıldıktan sonra, dikkatli bir şekilde hücre pelet bırakarak kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Yeniden askıya 200 hücre pelletini - yukarı pipetleme ve 200 ul birkaç kez ayarlanmış bir 1000 ul pipet yardımıyla aşağı 300 ul sıralama GADS&#39;yi. buz üzerinde örnekleri koyun. Hücreler artık sıralanması için hazırız. </li></ol> 5. Floresan Aktif Hücre (FAC) Sıralama Not: Bu bölümde operasyonel FACS sıralayıcı bilgi ya da kalifiye personel yardım gerektirir. <ol><li> hücre canlılığı test etmek için her bir örnek için 1 ul propidyum iyodür (PI) stok solüsyonu (50 ug / ml) eklenir. 2 tüpler, PI ile diğeri olmadan içine negatif kontrol Böl. PI sadece ölü hücreleri DNA bağlar. Eğerİlk birkaç türlü sonra, PI kullanımı gerekli değildir etiketlemek için hiçbir ölü hücreler vardır. </li><li> Ulaştırma hücreleri buz üzerinde örneğin., BD FACS AriaII Diva 8 yazılımını çalıştıran, enstrüman akış sitometri. </li><li> Hücre boyutu, bu popülasyonda, değişken olduğu için, ayırma için büyük bir ağızlık (100 um) kullanın. stres hücreleri deneyimi miktarını azaltmak ve hücre canlılığı düşük basınç (20 psi) kullanmak artırmak. </li><li> Analiz araziler, gerektiğinde ileri dağılım, yan dağılım (SSC), Hızlı Mavi ve PI, kurmak için FACS sıralayıcı yazılımını kullanın. </li><li> hücrelerin yeniden askıya yavaşça sıralayıcı yerleştirmeden önce örnek kısaca vorteks. </li><li> Kapı eşiği (Şekil 2A) ayarlamak için, negatif kontrol, hiçbir Hızlı Mavi veya PI ile başlayın. Bu hücre popülasyonunun otofloresan miktarını belirler. İsteğe bağlı: Ölü hücrelerden oluşan bir nüfus var olup olmadığını belirlemek için PI negatif örnek çalıştırın. </li><li> (Inc pozitif kontrol örneği sıralamaktazminat parametrelerini ayarlamak için,) Hızlı Blue ile ubated. </li><li> kapılar ve parametreler ayarlandıktan sonra, deneysel örnekleri sıralama başlar. Örnekler RNA lizis tampon içeren hazır toplama tüpleri içine sıralanır. </li><li> Hücre sıralama tamamlanana kadar buz üzerinde sıralanan örnekler tutun. </li><li> Hücreler sıralanır hemen sonra RNA ekstraksiyon adımını başlayın. </li></ol> 6. RNA Ekstraksiyonu <ol><li> 1 dakika süre ile liziz tamponunda Vortex kriteri hücreler homojenleştirin. </li><li> Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme tarafından% 70 etanol ve karışımı 1 hacim ekleyin. </li><li> spin kolona numunenin 700 ul kadar aktarın. 8000 x g&#39;de 15 saniye boyunca santrifüj. flow-through atın. <ol><li> Numunenin toplam hacmi eğirme kolonundan geçirildi kadar tekrar edin. </li></ol></li><li> üreticinin Protoco göre DNaz aşaması da dahil, 350 ul Tampon RW1 ekleyin ve RNA saflaştırma işlemine devamhücreler l. </li><li> RNA ekstre edildikten sonra, üreticinin talimatlarına göre bir mikroakışkan elektroforez sistemi kullanılarak RNA kalitesini test. </li></ol>

<ol>
	<li>Manteniotis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+RNA-Seq+Expression+Analysis+of+Sensory+Ganglia+with+a+Focus+on+Ion+Channels+and+GPCRs+in+Trigeminal+Ganglia.">Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia.</a> PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).</li><li>Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+mRNA+expression+analysis+of+TRP+channel+genes+at+the+single+trigeminal+and+dorsal+root+ganglion+level+in+mouse.">Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).</li><li>Paintal, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+sensory+receptors+and+their+reflex+effects.">Vagal sensory receptors and their reflex effects.</a> Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).</li><li>Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+tracing+shows+that+CGRP-immunoreactive+nerves+of+rat+trachea+and+lung+originate+from+vagal+and+dorsal+root+ganglia.">Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.</a> J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).</li><li>Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interganglionic+segregation+of+distinct+vagal+afferent+fibre+phenotypes+in+guinea-pig+airways.">Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways.</a> J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).</li><li>Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transient+receptor+potential+channels+and+two-pore+potassium+channels+in+subtypes+of+vagal+afferent+neurons+in+rat.">Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).</li><li>Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemistry+of+the+nodose+ganglion.">Neurochemistry of the nodose ganglion.</a> Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).</li><li>Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+Sensory+Neuron+Subtypes+that+Differentially+Control+Breathing.">Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing.</a> Cell. 161, 1-12 (2015).</li><li>Kaczy&#324;ska, K., Szereda-Przestaszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodose+ganglia-modulatory+effects+on+respiration.">Nodose ganglia-modulatory effects on respiration.</a> Physiol Res. 62, 227-235 (2013).</li><li>Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+pulmonary+oxidative+stress+by+lung+vagal+afferents.">Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).</li><li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+mediates+the+inflammatory+actions+of+environmental+irritants+and+proalgesic+agents.">TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents.</a> Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).</li><li>Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+vagal+and+glossopharyngeal+sensory+neurons+is+dependent+upon+dystonin.">The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin.</a> Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).</li><li>Hondoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+expression+of+cold+receptors+(TRPM8+and+TRPA1)+in+the+rat+nodose-petrosal+ganglion+complex.">Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex.</a> Brain Res. 1319, 60-69 (2010).</li><li>Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+and+sympathetic+innervation+of+guinea-pig+lung+and+trachea+as+studied+by+retrograde+neuronal+tracing+and+double-labelling+immunohistochemistry.">The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry.</a> Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).</li><li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus:+A+comparison+of+Fast+Blue,+Fluoro-ruby,+Fluoro-emerald,+Fluoro-Gold+and+DiI.">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).</li><li>Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+of+Nodose+Ganglia+Injection+in+Sprague-Dawley+Rat.">A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat.</a> J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).</li><li>Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+sensory+neuron+populations+for+study+of+expressed+ion+channels.">Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels.</a> J Vis Exp. (82), e50782 (2013).</li><li>Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM8+function+and+expression+in+vagal+sensory+neurons+and+afferent+nerves+innervating+guinea+pig+esophagus.">TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus.</a> Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).</li><li>Kwong, K., Lee, L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE(2)+sensitizes+cultured+pulmonary+vagal+sensory+neurons+to+chemical+and+electrical+stimuli.">PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli.</a> J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).</li><li>Joachim, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+induces+substance+P+in+vagal+sensory+neurons+innervating+the+mouse+airways.">Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways.</a> Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).</li><li>Kaan, T. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2/3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats.">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li><li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon.">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li><li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains.">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, vagus sinirinin nodoz ganglionlarda hava yolu innerve nöronların hedeflemek için bir yöntemi anlatmaktadır. Bir kez etiketlenmiş, ganglionlar yavaşça optimum hücre sayıları ve canlılığı korumak için ayrışmış. Bu nöronlar FAC lizis tamponu doğrudan sıralanır ve RNA ayıklanır daha sonra. Bu protokolün önemi, hedef izole ve belirli duyusal hücre popülasyonunun kalitesini korumak için yeteneğidir. Gen ekspresyonu nöronların bu küçük nüfus anlatılan ve organa özel fonksiyonları ve sinir ağları tanımlanır. Bu protokol kritik adımlar ayrışma sürecinde hızlı ilerlemesi ve sonraki hücre sıralama içerir. O ayrışma hemen sonra başlar, öyle ki sıralama zamanı planlamak için önemlidir. RNA ekstraksiyonu için tüm tüpler ve ekipmanları tüm RNA ekstraksiyon reaktifleri, taze% 70 ve% 80 etanol çözeltileri taze yapılır ve bu da önemlidirücretsiz, temiz ve RNaz bulunmaktadır. Bu protokol, hücrelerin tek hücre RNA ekstraksiyonu ve sekanslama için delikli plakalara tek kriteri şekildedir değiştirilebilir. Aynı zamanda, arka kök gangliyon (DRG) ve diğer duyusal gangliyon hücreleri izole etmek için kullanılabilir. DRG&#39;lerde geri izleme için farklı vücut parçaları boya enjeksiyonu önce yapılmış 17 nitelendirdi. Bu protokol, aynı zamanda işlevsel analiz için hücreleri toplamak için modifiye edilebilir. Bunun yerine lizis tamponu içine hücreleri sıralama, hücreler nöronal kültür ortamı, GADS&#39;yi halinde sıralanır. Bu hücreler daha sonra kültürlenmiş ve kalsiyum görüntüleme veya elektrofizyoloji gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılmaktadır. Hızlı Mavi pozitif nüfus beklenen sonucu küçükse, yeni sindirim enzimi satın. Sindirim enzimi yaşı sindirim verimliliği ile bağlantılıdır. sindirim enzimi satın alma 1 yıl içinde kullanılması gerekmektedir. hücre sayısı yüksek olması durumunda,RNA ekstre edildi ve kalite test edilmiştir. RNA bozuluyorsa bu reaktifler taze değildir, ya da kontamine olmuş olduğunun bir göstergesidir. Bu durumda, tüm RNA ekstraksiyon alanları, pipetler, raflar, ve bir şey örnek tüpleri ile temas edeceğini iyice temizleyin emin olun. Taze RNase ve DNaz ücretsiz% 70 ve% 80 etanol olun. Bu çözümleri yapmak için kullanılan su ve etanol de diğer laboratuvar malzemeleri ayrı tutulması ve RNA ekstraksiyonu için sadece kullanılmalıdır. FAC sıralama Fast Blue pozitif hücrelerin izole edilmesi için hızlı ve etkili bir yöntemdir, ancak bir sınırlama hücre yoğunluğu ml tampon için 1 ila 2 milyon hücre olmasıdır. Bu protokol mevcut hücre sıralayıcı modellerinin sınırını iter. boğumlu ganglion hücrelerinin sayısı azdır. hücre sıralayıcı için bir hücre verimi yeterli elde etmek için, beş hayvandan alınan hücreler toplanır. 300 ul ve az 100.000 askıya hücreleri vardır - açıklanan sıralama hacmi 200. TTavsiye yoğunluğunun altında, ml başına yaklaşık 450,000 hücre, bir konsantrasyona yaptığı anlamına gelir. Bir hücre ayırıcıyla için bir seçenek, bir flüoresan mikroskop ve bir cam pipet 24 seçmenize etmektir. Bu teknik, daha yavaş ve 30 toplamak için kullanılmaktadır - her seferinde 100 hücre. Bu nedenle, bu protokol, mevcut yöntemlere kıyasla daha hızlı, yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır. Bu protokolün gelecekteki uygulamalar havayolu-innerve sinirlerin, belirli bir nüfusun transkripsiyonel profilini belirlemek için yeteneği vardır. Bu protokol kullanılarak toplanan, yüksek kaliteli RNA toplandı nöronların Transcriptome karakterize etmek için cDNA sentezi ve yeni nesil dizilemesi ve diğer teknikleri için bir şablon olarak kullanılabilir. Bu şekilde, genler veya yollar bu nöronların spesifik olan saptanabilir. Bu bilgi, bu nöronlar, normal fizyolojik koşullarda oynamak fonksiyonel rolünü aydınlatmak için yardımcı olacaktır. temel kezifade kalıpları sistem akciğer innerve nöronlarda gen regülasyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için fiziksel ve kimyasal uyaranlara veya patojenler tarafından itiraz edilebilir, kurulmuştur. Son olarak, genler düzenlenir hangi belirleyerek yeni farmakolojik hedefler belirlemek ve hava yolu hastalıklarında sinir fonksiyonu akut ve kronik değişikliklere müdahale etmek terapötik etkilerini araştırmak için başlayabilirsiniz.

Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent sinirlerin hücre gövdeleri arka kök, trigeminal veya nodoz gangliyon olarak, duyusal ganglia yer almaktadır. Her duyu ganglion vücudun belirli bölgeleri innervates ve o bölgedeki ayrı organ ve dokuları innerve hücreler içerir. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve trigeminal ganglion kafatası yer alırken hava yolları 1 üst yüz, gözler, meninksler veya innerve nöron içeren, gövde ve uzuvların boyunca süreçleri uzatmak, 2. Vagus sinirinin boğumlu ganglion alt solunum yolları ve akciğerleri 3 kafatası altındaki boyunda bulunan ve gastrointestinal sistem, kalp boyunca sinir liflerini uzatmak hücre gövdeleri içerir ve. İnsanlarda boğumlu ganglion, ancak fare birleştirildiği, tek başına duruyorAyrıca akciğerleri 4 innervates juguler gangliyon ile. Bu erimiş ganglion genellikle / juguler boğumlu karmaşık, vagus ganglion denilen, ya da sadece boğumlu ganglion 5 edilir. Burada, boğumlu gangliyon olarak adlandırılır. boğumlu afferent lifler beyin sapındaki yalnız yolu (NTS) çekirdeğine iç organlardan gelen bilgi aktarmak. Bu eşsiz ganglion duyusal girdi böyle gut hareketindeki 6, kalp hızı 7, solunum 8,9 ve tahriş aktive solunum tepkiler 10,11 gibi işlevleri, çeşitli bir dizi kontrol eder. fonksiyonları ve innerve organların bu çeşitliliği sayesinde, hedef ve bireysel nöronal yolları araştırmak için boğumlu ganglion organ spesifik alt popülasyonlar ayırmak için kritik öneme sahiptir. Ancak, boğumlu küçük boyutu ve bu önemsiz bir görev değildir içeren nöronların sınırlı sayıda verilen. Ganglion nodoz Her fare yaklaşık 5.000 nöronlar 12 içerirUydu hücreleri destekleyici geniş bir nüfusa ek olarak. % 5 innervate solunum yollarında - 5000 boğumlu nöronlar, sadece 3. Dolayısıyla, solunum uyarılması veya patolojilere havayolu-innerve nöronların içinde herhangi bir fonksiyonel morfolojik veya moleküler değişiklikler, yoğun dolu boğumlu ganglion kaybolur. Bu sorunu çözmek için, bir yöntem belirlemek ve hava yollarını innerve nöronlar izole etmek için geliştirilmiştir. üst solunum yolları takip eden innerve nodoz nöronların tespit etmek, bir floresanlı işaretleyici boya maruz bırakılmıştır. Hızlı Mavi nöronlar tarafından yakalandı ve en fazla sekiz hafta 13 korunur hücre gövdeleri hızla yolculuk oldu - 15. Bir kez nazik, henüz etkili, ayrışma protokol floresan aktif hücre (FAC) sıralamak için boya etiketleme ve hücre canlılığını korumak için kullanılan belirlendi. Kriteri hücrelerinin gen ekspresyonunu veya f belirlemek için, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) elde etmek için kullanılırveya diğer alt moleküler analizi. Bu protokol, ilgi konusu bir dokuda innerve duyusal nöronlar izole etmek için kullanışlı ve güçlü bir teknik sağlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Fast Blue</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17740-2</td><td>stock 2 mg/ml in water</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutamine (Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (no vitamin A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>stock 50 &amp;micro;g/ml in PBS/10% FBS</td></tr><tr><td>digestion enzyme, Liberase DH Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>stock 2.5 mg/ml in water</td></tr><tr><td>particle solution (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Heating block</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>RNase free water</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>RNase decontamination reagent, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>DNase kit, RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>stock 10 &amp;micro;g/ml in PBS</td></tr><tr><td>Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice

Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent nöronların hücre gövdeleri duyusal ganglionlar içinde yer almaktadır. Duyu ganglion vücudun belirli bir organ veya bir kısmını innerve. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve vücutta ve bacaklarda boyunca süreçleri uzatmak. trigeminal ganglion kafatası bulunan ve yüz innerve ve üst solunum yolları vardır. boğumlu ganglionlar vagal afferentler bağırsak, kalp, akciğerler ve boyunca uzanır. solunum hızı, solunum yolu tahrişi ve öksürük reflekslerinin: boğumlu nöronlar gibi fonksiyonların çeşitli bir dizi kontrol eder. Bu durumda, anlaşılması ve işlevini değiştirmek için, hava yolu spesifik nöronal alt popülasyonlarının belirlenmesi ve izole edilmesi için çok önemlidir. Fare, hava yolları havayolu özgü boğumlu nöronun retrograd takibi için bir floresan tracer boya, Hızlı Mavi, maruzs. nodoz gangliyon parçalanır ve flöresanla aktive edilen hücre (FAC) ayırma boyası pozitif hücrelerin toplanması için kullanılır. Daha sonra, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) yeni nesil dizileme için boya pozitif hücreler elde edilir. spesifik nöronal gen ifadesi belirlenir bu yöntem havayolunu kullanarak.

Bu yöntem kullanılarak, hava yolu innerve nöronlar intranazal Fast Blue (Şekil 1A) aşılamak ile etiketlenir. İki gün sonra, Fast Blue etiketli hücreler nodoz gangliyon (Şekil 1C) görünür. boğumlu ganglionlar toplam nöronal nüfusun% 5&#39;i - Bu hücreler 3 oluşturuyor. Bu amaç için kullanılan diğer retrograd boyalar DII (1,1&#39;-dioktadesil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat) ve Fluorogold bulunmaktadır. nöronlar boğumlu DII etiketlere Akciğer maruz kalma. Ancak, DII ganglion ulaşması uzun sürer, 7-14 gün damlatılması 18,19 sonra, bu nedenle aktif taşınan boya kullanılmıştır. Fluorogold aynı zamanda havayolu nöronlar 14,20 etiketlemek için kullanılan bir aktif taşınan boyadır. Bizim tecrübelerimize göre, ancak, bir kez bu boya (veriler gösterilmemiştir) hızla uydu hücreleri ve nöronlar tarafından tutuklanmıştı boğumlu ganglion hücre gövdeleri ulaştı. HızlıMavi alternatif aktif başarılı ve hızlı bir şekilde, sıçanlarda 21 ve havayolu-innerve boğumlu nöronlar 13,14 DRG etiketler floresan boya taşınan olduğunu. Hızlı Mavi bir yaklaşım, bu nedenle, daha sağlam ve tekrarlanabilir görünür. Boğumlu ganglion diseksiyonu önce 16 tarif edilmiştir ve konumu kısaca Şekil 1B gösterilmiştir. Sindirim boğumlu ganglion eksize edilmiştir hemen sonra başlar. topaklanma nöronlar birlikte önlemek ve daha temiz bir tür için izin hafif bir sindirim enzimi kullanmak için, herhangi bir enkaz temizlemek ve çözüm sıralama ganglionlar RNaz ekleyin. Birden fazla sindirim enzim karışımları için test edilmiştir. Hafif sindirim enzim karışımı 22 ancak yetişkin ganglion sindirim için zamanında hücreleri bozmaya yeterince güçlü değildi, denendi. Alternatif olarak, önceden papain 23 kombinasyonu kullanılan proteazVe kolajenaz enzim karışımı, (veriler gösterilmemiştir) çok agresif olduğu kanıtlanmıştır ve istenmeyen hücre ölümüne neden olmuştur. Belirtilen enzim karışımı ile belirtilen sindirim protokolü, yüksek hücre canlılığı ile zamanında sindirim için doğru olduğu bulunmuştur. Önceki yöntemler etiketsiz hücrelerden 24 etiketli hücreleri ayırmak için bir cam pipet ile toplama manuel hücre kullandık. Bu teknik, bir hücre az sayıda tek hücre analizi için daha uygundur. yüzlerce ya da binlerce hücrenin tamamı popülasyonu elde edilmesi gereken, ancak 48 hücre / sa.&#39;lik bir maksimum oranı ile bu teknik pratik değildir. amaç, yüksek kaliteli RNA izole etmek, zaman önemli bir değişkendir olur. Bozulmasını önlemek için mümkün olduğunca çabuk RNA çıkarma başlamak önemlidir. FAC sıralama ~ 45 dakika tüm etiketli nüfusun toplanmasını sağlar ve RNA ekstraksiyon hemen sonra başlatılır. o: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; nöronları sıralama yaparken kırık nöronal süreçlerden kadar enkaz temizlemek için önemlidir. Bir yoğunluk gradyan ayrışmış örneklerinden enkaz temizlemek için kullanılmıştır. Küçük bir yarıçapına sahip C-lif nöronlar, ~ um 24 5, degrade geçmeye zorlanır sağlamak için yeterince yüksek bir kuvvette santrifüj önemlidir. Şekil 2A ve B sıralama kapıları ayarlamak için kullanılır negatif ve pozitif kontroller göstermektedir. Şekil 2C&#39;de görüldüğü gibi, ayrışmış Fast Blue sıralama iki popülasyon boğumlu hücreleri etiketli. Bu örnekten toplanan hücre sayıları Şekil 2D&#39;de verilmiştir. % 85 - Bu yöntem için verimlilik sıralama 73 olduğunu. nöronlar sıralarken ileri dağılım ve yan dağılım parametreleri özgüllük eklemek vermedi. nöronlar küresel olmadıklarından bu parametreler güvenilir hücre boyutunun bildirmek için koyamadık. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; KBB kaliteli RNA verimi için 1 &quot;&gt; hücreler lizis tamponu doğrudan sıralanması gerekiyor ve RNA bir mikroakışkan elektroforez sistemi test etmek için kullanılan sıralama hemen sonra çıkarılan olmalıdır. RNA (Şekil 3) kalitesi. 18S ve 28S tepe bir RNA bütünlüğü numarası (RIN) hesaplamak için kullanılan jel elektroforez ile tespit edilir. örnek dizilenmesi RNA, RIN Bu RNA numunesi sekanslanacak hazır artık 7. daha büyük olmalıdır . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53917/53917fig1.jpg" /> Şekil 1. Vagus Sinir boğumlu Ganglia Havayolu innerve Nöronlar Hızlı Mavi Etiketleme. A) ciğerlerine Hızlı Mavi burun damlatılması bir temsili. Işık sevofluran, pipet fare sıvısında aspire edilir emin bir fare burun delikleri içine% 1 DMSO ile PBS içinde Fast Blue 40 ul altında. <strong&gt; B) boğumlu ganglion nerede gösteren bir şemadır. It) karotid arter. C boyunca uzanan vagus siniri, bir kalınlaşma olarak görünür, en az 2 gün sonra, Fast Blue hava yolu nöronlar işaretleme nodoz ganglia görünür. boğumlu tüm nöronlar lekeleri kırmızı floresan Nissle leke, ile karşıt edilir. Ölçek çubuğu 100 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53917/53917fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53917/53917fig2.jpg" /> Hızlı Mavi Pozitif Hücreleri için Gates&#39;i Sıralama Şekil 2. Floresan Aktif Hücre (FAC). Kapılar negatif (A) ve pozitif (B) kullanan sıralama kurmak için Hızlı Mavi pozitif nüfusu kurmak kontrol eder. Negatif kontrol (A) inci DRG hücreleri ayrışmışEn akciğerleri innerve yok. Pozitif kontrol (b) parçalara edildikten sonra in vitro olarak hızlı mavi ile inkübe edilir DRG hücreleri ayrıştırılır. Nedeniyle ayrışmış nöronlar olmayan küresel şekli, ileri dağılım ve yan dağılım parametreleri hücre popülasyonu. C) solunum yolları Mavi. D Hızlı maruz kalmış farelerin ganglion hücrelerinin boğumlu ayrışmış bir temsilci sıralama) tanımlanmasına yardımcı olmaz (C) hücre sayısı. 1.000 &#39;den fazla Hızlı Mavi (FB) hücreleri toplanmıştır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53917/53917fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53917/53917fig3.jpg" /> Şekil 3. Bir seçecek kullanarak RNA Kalite ve RNA Bütünlük sayısı (RIN) Görevlendirilmesine mikroakışkan Elektroforez Sistemi Kullanımının Değerlendirilmesi.rophoresis sistemi RNA kalitesi betimlenen jel resmin üzerine 18S ve 28S zirveleri hesaplanır. Düşük zirve bozulmuş RNA temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53917/53917fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice at JoVE.com

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Görüntüleme.  Yale University. Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Video: A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Havayolu Direnci Ölçümleri ve Fare Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı Örnekleme için, geri dönüşümlü, Non-invaziv Yöntemi

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biyoloji

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Farelerde Yüz Sinir Aksotomi: Sakatlık Motonöron Yanıtı Eğitim için Bir Model

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Tıp

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

İşitsel Yolu ve optogenetic Stimülasyon için Murin Dorsal Koklear Çekirdek Doğrudan Görselleştirme

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Nörobilim

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Ventral Kök Stimulation için eğik Omurilik Dilimleri hazırlanması

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Fare Sempatik Nöronlarının Hedeflenmesi: Lomber Sempatektomi Yaklaşımı

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays many critical roles in maintaining bodily homeostasis, but it has rarely been studied in the context of peripheral nerve injury. The extent of postganglionic sympathetic neuronal functions in distal targets in the periphery is currently unclear. To better explore the role of sympathetic innervation of peripheral targets, a surgical &#34;knock-out&#34; model provides an alternative approach. Although this can be achieved chemically, chemical destruction of postganglionic sympathetic neurons can be nonspecific and dose-dependent. The use of a surgical lumbar sympathectomy in mice, once thought to be &#34;virtually not practicable&#34; in small animals, allows for specific targeting of postganglionic sympathetic neurons that innervate the hind limbs. This manuscript describes how to surgically remove the L2-L5 lumbar sympathetic ganglia from a mouse as a survival surgery, which reliably decreases the hind paw sweat response and the number of sympathetic axons in the sciatic nerve.

Yazar Spotlight: Sempatik Nöronların Plastisitesini Keşfetmek

This manuscript presents a protocol for surgically removing the postganglionic lumbar sympathetic neurons from a mouse. This procedure will facilitate a multitude of studies aimed at investigating the role of sympathetic innervation in distal tissue targets.

Farelerde Cerrahi Lomber Sempatektomi

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays ...

Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Havayolu Direnci Ölçümleri ve Fare Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı Örnekleme için, geri dönüşümlü, Non-invaziv Yöntemi

Farelerde Yüz Sinir Aksotomi: Sakatlık Motonöron Yanıtı Eğitim için Bir Model

İşitsel Yolu ve optogenetic Stimülasyon için Murin Dorsal Koklear Çekirdek Doğrudan Görselleştirme

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Ventral Kök Stimulation için eğik Omurilik Dilimleri hazırlanması

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Farelerde Cerrahi Lomber Sempatektomi

Farelerde Cerrahi Lomber Sempatektomi

Farelerde Cerrahi Lomber Sempatektomi