Name: amplification, next-generation sequencing, and genomic dna mapping of retroviral integration sites
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites at JoVE.com

Biz Engelman laboratuarında retroviral entegrasyon sitesi sıralama için NGS protokolünü kurmak için kritik meslektaşlarımızla Stephen Hughes ve tavsiye için Henry Levin minnettarız. Bu çalışma AI039394 ve (ANE kadar) AI052014 ve AI060354 (AIDS Araştırma Harvard Üniversitesi Merkezi) ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.

The authors have nothing to disclose.

Genomik dağılım örnekleri eşleme yoluyla başlangıç ​​virüs enfeksiyonu aşama retroviral entegrasyonu sitelerinin analizi için bir protokol, tarif edilmektedir. Bu protokol, bir retrovirüs ve bir infectable hücre tipine uygulanabilir. Bundan başka, deney boru hattı 6.4 x 10 -5 MOI ile başlatılmış bir enfeksiyon edilene Genomik DNA, eşdeğer seri seyreltmeleri benzersiz entegrasyon sitelerinden tatmin edici bir dizi geri potansiyeline sahip, çok hassastır. hücrelerin sadece küçük bir bölümü, entegre provirüsünü barındıran bir viral yükü düşük içerebilir enfekte hastalardan alınan numuneler uygulandığında bu duyarlılık protokolü özellikle yararlı hale getirir. Bu alanda 36,38,41-43 önceden metodoloji kağıtları ile uyumlu olarak, bu protokolün biyoinformatik kısmında birden fazla adımlar dizi verilerinin büyük dosyaları işlemek için özelleştirilmiş yazısı geliştirme yararlanacaktır. Blat 58 ma daBu protokol açıklanan programı pping, kullanıcıların uygun bir alternatif olarak Bowtie 67 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) bulabilirsiniz. Alternatif bir biyoinformatik boru hattı en son, Moloney kemirgen lösemi virüsü (MoMLV) entegrasyon sitelerinden 19 belirlenmesi için rapor edilmiştir. o kamuya açık olduğunu ve aslında benzersiz MoMLV entegrasyon sitelerinden yüzbinlerce eşleştirmek için kullanılan olduğu oldukça güçlü bağımsız yazılım haline geldi ki bu boru hattı yararlıdır. Son zamanlarda adeno-ilişkili virüs ve Tol2 kapsayacak şekilde genişletildi Ancak, mevcut yazılım aslında özel rapor MoMLV veri kümesi yeniden analiz etmek için tasarlanmıştır ve bu nedenle deneysel tasarımlar (aracın işlevselliğini alternatif boru hattı özelleştirmek için gerekli olacaktır yeniden programlama ve ac / Ds transpozon) 68 vektörleri. Bundan başka, bu protokol, ön entegrasyon sahasında üretilmesini tarif .YataktaDosya, ancak genomik açıklamaları formüller verilmiştir harita siteleri için gerekli belirli adımlar ortaya koymamıştı. Okuyucular burada açıklanan protokolü kullanılarak oluşturulan NGS dizileri analiz etmek yararlı akım yazının incelenmesi sırasında serbest bırakıldı &quot;Vektör Entegrasyon Sitesi Analizi&quot; sunucusunu 69, bulabilirsiniz. retroviral entegrasyonu sitesi veri setlerini analiz etmek için herhangi bir protokolü kullanarak belirli noktalar vurgulanmalıdır. tandem çoklu kütüphaneler hazırlarken, önemli bir potansiyel örnek çapraz kirlenme vardır. Hatta örnek karışma çok küçük bir düzeyde kullanılamaz bir NGS çalıştırmak render seviyesine sonuçlarını belirsiz olabilir. Bu nedenle, tüm ıslak-tezgah çalışma sterilize adanmış laminer akış kaputun ya da PCR iş istasyonunda tamamlanmalıdır. pipetler ve nükleaz içermeyen su gibi reaktif bir dizi entegrasyonu, zemin büyütmesi için sadece adanmış olmalıdır. Her kütüphane hazırlanması için benzersiz bağlayıcıların kullanılması potansiyeli sınırlayabilirAyrıca geçit tanımlanması için izin çapraz amplifikasyonu için ve ham FASTA dosyaları her kütüphane içinde okur. Genomik DNA parçalamak restriksiyon endonükleaz sindirimi karşı sonikasyon kullanılarak artılarını ve eksilerini göz önünde bulundurulması önemlidir. Bir yandan, sonikasyon kesme noktalarının görece rastgele dağılımı sağlar, fakat daha sonra gerekli DNA onarımı ve A-atık adımları sürekli olarak sınırlama enzimi tarafından üretilen yapışkan uçları ile gerçekleştirilen ligasyonu ile karşılaştırıldığında bağlayıcı bağlı ürünün verimini azaltır. Öte yandan, sınır enzimi sindirimi her zaman geri veri bazı önyargı olacak kesme noktaları, bir daha az tahsis edilen popülasyonu sağlar. Her iki durumda da yukarı LTR dizileri atmak için bir restriksiyon endonükleaz olacak kullanarak (Şekil 1) genomunda bu sitenin yukarı yalan bütünleşme sitelerinin küçük bir kısmını kaybına neden. reklam olabilir neden olabilir herhangi bir veri önyargıkütüphane hazırlanması sırasında protokol enzimatik sindirim atlayarak ve sıralama verilerinden yukarı LTR dizileri sonuçlanan çokluğu filtreleyerek giymiş. Mevcut protokolü oldukça duyarlıdır ve tüm entegrasyon sadece üçte biri entegre olarak sitelerinin 21,40 milyonlarca üretme kapasitesine sahip olsa da kütüphane preparatları (ref iyi bir deneyde amplifiye edilecek olan beklenebilir. 70 ve yayınlanmamış gözlemler). Düşük viral yük liman düşük İçişleri Bakanlığı enfeksiyonları ya da hasta örnekleri analiz ederken bu komplikasyonlara neden olabilir. Bu sınırlama, sürekli olarak aynı kitaplığı hazırlanmasını dizilenmesi ve / veya paralel olarak aynı DNA örneğinden elde edilen çoklu kütüphaneler dizilenmesi kısmen aşılabilir. Tahlil duyarlılık Gelecek artışlar buna göre retroviral entegrasyon sitesi sıralama ilerletilmesi öteleme uygulamaları çok yararlı olacaktır.

konakçı hücre genomuna viral DNA (vDNA) Entegrasyon retroviral yaşam döngüsünde önemli bir adımdır. Entegrasyon stabil eklenen Provirüsün 1 kurulmasına yol açan iki ayrı katalitik işlemlerini yürütür viral enzim integraz (IN) tarafından gerçekleştirilir. Alt birimlerin bir in multimer 2-4 tarafından bir arada tutulan uçları vDNA ile üst düzey intasome oluşturan, ters transkripsiyon yoluyla üretilen doğrusal vDNA uçlarını meşgul. Yararak İÇİNDE 3&#39;-işleme olarak bilinen bir süreçte dizilerin 3 &#39;aşağı değişmez 5&#39;-CA-3 den vDNA uçları&#39;, &#39;3 girintili bırakarak her vDNA terminalinde 5-8 reaktif hidroksil grupları ile sona erer. Intasome sonradan ev sahibi büyük bir montaj parçası ve preintegration kompleksi (PIC) 9-11 olarak bilinen viral proteinler gibi çekirdek içine alınır. hücresel hedef DNA (T-DNA) rastladığında, 3&#39;-hidroksil gro vDNA kullanırUPS zikzaklı bir şekilde T-DNA üst ve alt şeritlerin ayrılması ve eş zamanlı olarak şerit aktarma 12,13 sürecinde T-DNA 5 &#39;fosfat gruplarına vDNA katılır için. yerel ve küresel ölçeklerde retrovirüsler sergi entegrasyon sitesi tercihleri. Yerel olarak, uzlaşma entegrasyon siteleri yaklaşık beş vDNA ekleme sitelerinden 14,15 den yukarı bp ve aşağı on dan yayılan zayıf korunmuş palindromic T-DNA dizilerinin oluşmaktadır. Küresel olarak, retrovirüsler özel kromatin açıklamaları 16 hedef. epsilon, Lenti ve spuma yoluyla alfa - yedi farklı retroviral cins vardır. Gammaretroviruses tercihen transkripsiyon başlangıç ​​siteleri (TSSler) ve aktif artırıcı bölgelerine 18-20 entegre ederken HIV-1 içeren lentiviruses, aktif transkripsiyonu genler 17 bünyelerinde entegrasyonu lehine. tam tersine, spumavirus kuvvetle heterochrom karşı önyargılı olduğunuBu tür gen kötü lamina-ilişkili alanlar 21 olarak problemlerle bölgeler. Yerel T-DNA baz tercihleri ​​IN ve T-DNA 13,22,23 arasındaki nukleoprotein temasların özel ağlar tarafından dikte büyük ölçüde vardır. Lentiviruses ve gammaretroviruses için genomik ek açıklamalar entegrasyon göreli IN ve soydaş hücresel faktörlerin 24-27 arasındaki etkileşimler tarafından yönetilen büyük bir kısmı yer almaktadır. Faktör etkileşimleri 25-27,29-32, sırasıyla yerel ve küresel düzeylerde entegrasyonu yeniden hedefleme stratejileri kanıtlanmış IN-host IN-T-DNA etkileşimi ağının 13,22,23,28 özelliklerini değiştiren ve bozan veya yeniden mühendislik. retroviral entegrasyon siteleri katalog için kullanılan DNA dizi prosedürlerinin gücü geçmiş yıllarda son derece artmıştır. Entegrasyon siteleri Çalışma 33,34 başına benzersiz sitelerin sadece bir avuç elde etmek zahmetli arınma ve manuel klonlama teknikleri kullanılarak öncü çalışmalar ele alındı.Binlerce 17 birkaç yüz artan eksojen doku kültürü hücre enfeksiyonları elde sitelerin sayısı ile, alan dönüştürülmüş insan ve fare taslak genomları bireysel entegrasyon siteleri harita yeteneği ile LTR-konakçı DNA kavşaklarından LM-PCR amplifikasyonu kombinasyonu 18. NGS metodolojisi ile LM-PCR daha yeni kombinasyon kütüphane derinlik fırlayan gönderdi. Kütüphaneler eşsiz dizilerin 19-21,39 milyonlarca verebilir DNA kümeleme kullanımı yoluyla sıralı ise Özellikle, piro, onlarca benzersiz entegrasyon sitelerinden 30,35-38 binlerce sırasına vermiştir. Burada yükselterek ve DNA kümeleme NGS kullanarak retroviral entegrasyon siteleri sıralanması için optimize edilmiş LM-PCR protokol açıklar. yöntem, ve böylece sequen önce ek bir bağdaştırıcı bağlama adımı ihtiyacını engelleyen, büyütülmüş DNA moleküllerine dolayısıyla doğrudan PCR primerleri içine adaptörü dizileri gerekli birleştirir40 dans ediyorum. biyoinformatik analizi boru hattı, genomik özellikleri formüller verilmiştir özgü entegrasyon sitelerinden eşleme LTR-konakçı DNA birleşme için ham dizileme veri çözümlenmesinden, ayrıca genel olarak tarif edilmektedir. Bu alanda 36,38,41-43 önceki metodolojik protokollerden kurulan öncelik doğrultusunda, özel komut biyoinformatik boru hattı belirli adımların tamamlanmasına yardımcı olmak amacıyla geliştirilebilir. yardımcı ve protokol duyarlılığı enfeksiyonun yaklaşık çokluğu 1.0 (İB), hem de bu DNA&#39;nın bir titrasyon serisi enfekte doku kültürü hücreleri, HIV-1 entegrasyon sitesi, yükseltme dizilemesi ve eşleyerek Örnek verilerle gösterilmektedir 6.4 x 10 -5 yaklaşık eşdeğer İçişleri Bakanlığı vermek üzere 15.625: enfekte olmamış hücresel DNA ile seyreltilmiş 1 maksimum seyreltme adımları 5 kat.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibiotics to be added to DMEM</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered saline</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Used to wash cells</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Used to detach adherent cells from tissue culture plates</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>DNA transfection reagent</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m Filters</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Used to filter virus particle-containing cell culture media</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Used to quantify yield of virus production</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Used to purify genomic DNA from cells</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec</td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Used to purify DNA during library construction</td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3&#039;-5&#039; exo&amp;ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Deoxyadenosine triphosphate</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends</td></tr><tr><td>DNA Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs &amp;lt;30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Advantage 2 Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Commercial mix containing DNA polymerase for PCR</td></tr><tr><td>dNTPs (100 mM solutions)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Spectrophotometer for determination of DNA concentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorimeter</td><td>Life Technologies</td><td>Qubit&amp;reg; 3.0</td><td>Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration</td></tr><tr><td>2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Used for NGS</td></tr></tbody></table>

amplification, next-generation sequencing, and genomic dna mapping of retroviral integration sites

hem yerel hem de küresel ölçeklerde retrovirüsler sergi imza entegrasyonu tercihleri. Burada, ligasyon aracılı PCR (LM-PCR) amplifikasyonu ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanılarak retroviral entegrasyon sitelerin çeşitli kütüphanelerin (1) nesil için ayrıntılı bir protokol, (2) Her virüs- genomik konumunu haritalama sunuyoruz kavşak BEDTools kullanarak ve (3) İstatistiksel alaka için verileri analiz ev sahipliği yapmaktadır. enfekte olmuş hücrelerden özütlendi genomik DNA sınırlama enzimleri ile ya da sonikasyon ile sindirme ile parçalanır. uygun bir DNA son tamir sonra çift şeritli bir DNA bağlayıcılar uçlarına bağlanır ve yarı iç içe PCR virüsü uzun terminal tekrar (LTR) sonu ile bağlanmış bağlayıcı DNA hem de tamamlayıcı primerler kullanılarak gerçekleştirilir. PCR primerleri ayrı adaptör ligasyonu ihtiyacını inkâr NGS sırasında DNA kümeleme için gereken dizileri taşırlar. Kalite kontrol (KK) DNA fragmanı boyutu dağılımına değerlendirmek ve uyum için yapılırNGS önce bir DNA dahil edilmesini er. Dizi çıkış dosyaları LTR içeren okur için filtre edilir ve LTR ve bağlayıcı tanımlayan diziler uzakta kırpılır. Ayıklanmış konakçı hücre dizileri blat kullanarak bir referans genom eşlenir ve referans genom içinde benzersiz bir noktaya minimum% 97 kimlik filtrelenir. Benzersiz entegrasyon siteleri çeşitli genomik özelliklere bitişik nükleotid (nt) sekansı ve dağıtım akrabası için irdelenmektedir. Bu protokol kullanılarak, yüksek bir karmaşıklık entegre edilen kütüphaneler üç günde genomik DNA&#39;dan yapılabilir. entegre edilen analiz duyarlı doku kültürü hücreleri eksojen viral enfeksiyon kapsamına almaktadır, tüm protokol, bu nedenle, yaklaşık bir ila iki hafta içinde yapılabilir. Bu teknolojinin son uygulamalar, HIV ile enfekte olmuş hastalardan alınan entegrasyon sitelerinden uzunlamasına analizi ile ilgilidir.

Tablo 4, bir temsili örneğin sonuçları tarafından enfekte olmuş hücrelerin bir kültüründen entegrasyon sitesi geri kazanılması için NGS duyarlılığını göstermek için. Enfekte olmamış hücresel DNA seri ortalama her bir hücre, bir entegrasyon 40 ihtiva eden bir enfeksiyon genomik DNA seyreltmek için kullanıldı. 15.625: Seyreltiler 1 bir maksimum seyreltme beş adımda hazırlanmıştır. titrasyon serisinin Genomik DNA daha sonra sonikasyon ile parçalanmış ya da kısıtlama ile sindirme ile LM-PCR ile takip MseI ve BglII, endonükleazlar oldu. benzersiz entegrasyon siteleri numaraları, yanı sıra seçilen genomik ek açıklamalar siteler haritalama proksimal sayısı yukarıdaki protokole göre hesaplanmıştır. Veri analizi teorisi sadece bir 15.625 enfekte edilmiş hücrelerden hazırlanan kütüphanelerden elde benzersiz entegrasyon siteleri (miktarın% 1-2 düzgün genomik DNA kurtarıldı) onlarca saptandı. </p&gt; Entegrasyon sitesi veri setlerini analiz yaparken, bir eşleştirilmiş rasgele kontrol veya MRC denir rasgele genomik siteleri eşleşen kümesi için verileri karşılaştırmak için kritik öneme sahiptir. Örnek sonuçlar sınır enzimi sindirimi ile ya da sonikasyon ile, genomik DNA kesilmiş olarak, iki farklı MRC veri kümeleri yapılmıştır. MRC rastgele barındıran 10,000 siteleri ayarlamak genomik belirteçleri mesafe için normalizasyonsuz oluşturulan ise MRC Enz rastgele Msel ve BglII kısıtlama enzimi sindirimi siteleri yakınına hg19 siteleri seçerek elde 50,000 özel genomik sitesi içeriyordu. benzersiz bir genomik konumuna geri eşlenebilir Sadece siteleri MRC veri kümelerinde kullanılmalıdır. Dizi önyargı esasen serbest sonication makaslar genomik DNA olarak, MRC rastgele sonikasyon ile DNA&#39;nın parçalanması ile üretilen veri setleri daha uygulanabilir olarak görülebilir. Kontrol entegrasyonu alternatif bir stilAlanı veri kümesi, protein rekombinant reaksiyona sokulmasıyla in vitro intasome nükleoprotein 21 kompleksi ya da proteinden genomik DNA ile akut olarak enfekte olan hücrelerden 17 elde resimleri, ve LM-PCR, aşağıdaki ve NGS 21 protokolleri oluşturulabilir. Entegrasyon sitelerinden dağılımı geri Sınırlama sindirimi (karşılaştırma saf örnekleri arasındadır), hem de rasgele MRC enz ve MRC karşılaştırma için, Şekil 2&#39;de gösterilir. Karşısında sonikasyon ile geri entegrasyon sitelerinden dağılımı karşılaştırma için p değerleri aşağıdaki sonication CpG adalarının yakınlığı açısından belirgin büyük varyans ile, enzim incelenen tüm ek açıklamaları için sindirmek kısıtlama tarafından kurtarıldı benzer oldu. Beklenen 18,65 Her iki veri setleri RefSeq genler ve gen d içinde entegrasyonları açısından MRCs anlamlı farklılık olarakHer iki veri setleri CpG adaları ve TSSlerin dağıtım göreli açısından MRCs benzer iken ensity, ortalama entegrasyon sitesini çevreleyen. Nispeten daha az HIV-1 entegrasyon siteleri siteleri sayısı kurtarıldı artan bir CpG ada veya TSS 2.5 kb içinde map beri veri setleri (Tablo 4 ve Şekil 2) arasında ortaya çıkabilecek değişkenliği azaltmak olasıdır. Sıra logolar entegrasyon sitesi verilerin doğruluğunu onaylamak için Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Konsensüs HIV-1 entegrasyon sitesi 14,22 (-3) TDG (G / V) TWA (C / B) CHA (7) ( Uluslararası Birliği Biyokimya baz kodları kullanılarak yazılmış; eğik çizgi vDNA konumunu gösterir artı-kordonlu birleştirme ve alt çizgi 5-bp sekansı, HIV-1 entegrasyon ve DNA onarımı) hem parçalanma teknikleri ile hazırlanan kütüphaneler için açıktır takip çoğaltılmış gösterir, kesinlik derecesi enfekte hücrenin artan seyreltme azalır, ancakDNA. aksine MRC veri setinden uyumlu rastgele siteleri baz tercihleri ​​kayda değer seviyelerini oluşturmak için başarısız oldu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53840/53840fig1.jpg" /> Şekil 1:. Entegrasyon Sitesi Kütüphanesi Hazırlıkları Akış Şeması İllüstrasyon (A), 48 saat sonra HEK293T hücreleri, hasat ve filtreleme süpernatant transfecting Ultrasantrifügasyon ile konsantre ve virüsün uygun konsantrasyonu ile hedef hücrelerini enfekte virüs stokları oluşturun. enfeksiyondan sonra en az beş gün, genomik DNA ayıklayın. Bölüm 1 bakınız ve ek Deney detayları için ana metin 2. (B ve C) fragmanı restriksiyon enzimleri ile ya da sonikasyon ile sindirme ile genomik DNA saflaştırılmıştır. Restriksiyon enzim kokteyl aşağı yukarı viral LTR gelen parçalayarak karşı seçim o bir enzimi (örn BglII) LM-P içermelidirİç vDNA dizilerinin CR amplifikasyonu. Yeşil yıldız ve (C) dallı ok BglII bağlayıcı bağlanmasından sonra uygulanması gerektiğini belirtir. siyah golleri hücresel dizisi ev sahipliği yaparken kırmızı golleri viral dizisi. İması DNA kırılma noktaları (ölçeğine göre olmayan) &quot;X&quot; ile işaretlenmiştir HIV-1 sayıda Msel ve BglII bölgeleri içerir; sadece protokole uygun olanlar gösterilmektedir. harita üzerinde parantez tercihen LM-PCR ile amplifiye U5-hücresel DNA bölgeleri gösterir. (D) parçalanmış DNA arındırın (o-end onarım sonication durumunda ve A-kuyruk) ve (mavi renkli) (E) uyumlu asimetrik bağlayıcı molekülleri Arter. (D) &#39;de Magenta çevreler amplifiye edilecek entegrasyon bölgesini göstermektedir. Bağlayıcı kısa şeritlerin 3 &#39;ucunda yıldızlarla amino engelleme değişiklikleri belirtir. İlk tur LTR primer (kırmızı) ve bağlayıcı astar (mavi) kullanılarak yarı iç içe PCR (F) Davranış ilk turda. tLTR astar gibi dizileri yoksun ise, onun PCR yuvarlak, bağlayıcı astar, DNA kümeleme ve (mavi bağlayıcı astar yeşil apendiks olarak gruplandırılmış) dizileri bağlayıcı NGS astar için kodlar. (G) ilk turda PCR ürünü arındırmak ve yarı iç içe PCR ikinci turda yürütmek. PCR bu turda, bir araya DNA kümeleme ve NGS primer bağlanma dizileri taşıyan ikinci turda LTR primer (kırmızı) yanı sıra çoklama için bir barkod ile (ilk turda (mavi + yeşil apendiks) aynı bağlayıcı astar kullanın kırmızı LTR astar yeşil apendiks) olarak gruplandırılmış. (H) (eflatun daire ile işaretlenmiş entegrasyon site, Eflatun kutulu) Nihai entegrasyon sitesi kütüphanesi olarak ikinci turda PCR ürünü arındırın. QC ve NGS için sıralama tesisine kısım gönderin. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53840 / 53840fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2:. P Değerler Bulunduğu MRCs karşı Enzim Sindirim sonikleştirme ile veya Kısıtlanması DNA Parçalanma ardından Entegrasyon Siteler Amplified Karşılaştırma için RefSeq genler ve yakındaki CpG adaları ve trafik ayırım şeritleri içinde entegrasyon siteleri yanı sıra bölgesel gen yoğunluğu profilleri Sayılar, listelenen . kalın ve italik metin vurgulanır ≥0.05 Tablo 4 p değerleri Wilcoxon rank sum testi ile hesaplanan Fisher&#39;in kesin testi b P değerlerine göre hesaplanan bir P değerleri c MRC enz.:.. rastgele kontrol eşleşti; 50.000 benzersiz entegrasyon sitelerinin bir dizi rastgele hg oluşturmaya Msel / BglII kısıtlama siteleri yakınlığı pozisyon seçerek üretildi 19. d MRC rasgele: rastgele selecti tarafından üretilen 10.000 benzersiz entegrasyon siteleri içeren rastgele kontrol eşleştisınırlama sitesi yakınlığı normalleşme olmadan hg19 içinde ng pozisyonları. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53840/53840fig3.jpg" /> Şekil 3: Örnek Deney Kütüphanelerden sekans logolar Simgelendiği HIV-1 Baz Tercihler WebLogo yazılımı kullanılarak hizalanmıştır kısıtlama enzimleri ile (A), sindirim ya da (B), sonikasyonla hazırlanmıştır kütüphanelerden entegrasyon siteleri.. alt 15,625: titrasyon serisinin her bir sulandırma 1 maksimum seyreltme şeklin üst kısmında düzgün DNA&#39;dan, tasvir edilmiştir. 50.000 benzersiz genomik siteleri MRC için (C) Sıra logosu. Hata çubukları, esas olarak herhangi bir konumda taban dahil standart sapmasını temsil eder. Daha özel olarak ise, tHer hata çubuğunun otal yüksekliği nispeten küçük veri kümelerinde bulunan entropi küçümsenmesi için kontrol kez küçük bir örnek düzeltme 66, eşdeğerdir. X ekseni noktasında sıfır entegrasyon sitesine göre konak hücre genomik DNA nt pozisyonları temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53840/53840table1.jpg" /> . Tablo 1: Bağlayıcı İnşaat ve PCR amplifikasyonu için oligonükleotid dizileri Bağlayıcı-spesifik ve ikincil LTR primerleri renk kodlu aşağıda olan DNA kümeleme adaptör dizileri kodlayan: siyah, bağlayıcıya veya HIV-1 LTR tamamlayıcı bazlar; kırmızı, benzersiz dizin veya barkod; yeşil, bağlanma yerleri sıralama astar; DNA kümeleme için mavi, adaptör dizileri. Tek uç (SE) dizi reapaired-end (PE) reaksiyonları (read1 ve read2) sıralama primerler hem kullanımı ise seksiyonlar, ikinci turda LTR primer read1 (yeşil) dizisine tavlarıdır sıralama astar kullanacak. bir Bağlayıcı kısa koluyla değişiklik engelleme 3 &#39;amino içerirler. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53840/53840table1large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına eklemek için </td></tr><tr><td> Birinci Tur LTR astar (15 uM): </td><td> 2.5 ul </td></tr><tr><td> Bağlayıcı-spesifik primer (15 uM): </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 10x PCR tamponu: </td><td> 2.5 ul </td></tr><tr><td> dNTP (her biri 2.5 mM) </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> DNA polimeraz karışımı: </td><td> 0.5 ul</td></tr><tr><td> Ligasyon reaksiyonu: </td><td> 100 ng </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su: </td><td> kadar 25 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 2:. İlk PCR Tarif belirtilen her reaktif miktarı, her bir PCR tüpü belirtilir eklenecek. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına eklemek için </td></tr><tr><td> İkinci Tur LTR astar (15 uM): </td><td> 2.5 ul </td></tr><tr><td> Bağlayıcı-spesifik primer (15 uM): </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 10x PCR tamponu: </td><td> 2.5 ul </td></tr><tr><td> dNTP (her biri 2.5 mM) </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> DNA polimeraz karışımı: </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> İlk tur PCR: </td&gt; <td> 100 ng </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su: </td><td> kadar 25 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 3:. İkinci PCR dönüşü tarifi her reaktif maddenin miktarı, her bir PCR tüpüne eklenmesi gösterilir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> kütüphane </td><td> #Unique Siteler </td><td> % RefSeq bir </td><td> % CpG +/- 2.5 kb b </td><td> % TSS +/- 2.5 kb c </td><td> Ort. Gen yoğunluk +/- 500 kb d </td></tr><tr><td> Sonication, temiz </td><td> 3169 </td><td> 71.2 </td><td> 5.1 </td><td> 3.7 </td><td> 15.8 </td></tr><tr><td> Sonikasyon, 1: 5 </td><td> 366 </td><td> 75.1 </td><td> 2.7 </td><td> 3 </td><td> 16.3 </td></tr><tr><td&gt; Sonikasyon, 01:25 </td><td> 254 </td><td> 74 </td><td> 7.1 </td><td> 5.1 </td><td> 16.7 </td></tr><tr><td> Sonikasyon, 1: 125 </td><td> 430 </td><td> 69.8 </td><td> 6.9 </td><td> 6 </td><td> 14.6 </td></tr><tr><td> Sonikasyon, 1: 625 </td><td> 314 </td><td> 65.6 </td><td> 5.6 </td><td> 6.7 </td><td> 13.5 </td></tr><tr><td> Sonikasyon, 1: 3.125 </td><td> 116 </td><td> 73.6 </td><td> 3.5 </td><td> 2.5 </td><td> 13.1 </td></tr><tr><td> Sonikasyon, 1: 15.625 </td><td> 72 </td><td> 62.5 </td><td> 0 </td><td> 1.4 </td><td> 14.7 </td></tr><tr><td> Digest temiz </td><td> 7428 </td><td> 69.8 </td><td> 3.6 </td><td> 2.9 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> Özet, 1: 5 </td><td> 1.460 </td><td> 71.4 </td><td> 4.4 </td><td> 3.4 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> Digest 01:25 </td><td> 394 </td><td> 68.8 </td><td> 4.3 </td><td> 3.3 </td><td> 15.8 </td></tr><tr> &lt;td&gt; Digest, 1: 125 </td><td> 172 </td><td> 71 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 14 </td></tr><tr><td> Digest, 1: 625 </td><td> 134 </td><td> 73.9 </td><td> 3.7 </td><td> 3.7 </td><td> 14.1 </td></tr><tr><td> Özet: 1, 3.125 </td><td> 100 </td><td> 83.1 </td><td> 6.4 </td><td> 5.2 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> Özet, 1: 15.625 </td><td> 73 </td><td> 74 </td><td> 4.1 </td><td> 1.4 </td><td> 9.7 </td></tr><tr><td> MRC enz e </td><td> 50.000 </td><td> 44.7 </td><td> 4.2 </td><td> 4 </td><td> 8.7 </td></tr><tr><td> MRC rasgele f </td><td> 10.000 </td><td> 41.3 </td><td> 5.3 </td><td> 4.2 </td><td> 8.6 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Temsilci Titrasyon Serisi Entegrasyon Siteleri Genomik Dağılımı inci toplam entegrasyon sitelerin yüzdesi.TSSlerin 2.5 kb içinde CpG adalarının 2.5 kb içinde b RefSeq genler içinde sonbaharda, ve c d ortalama entegrasyon alanını çevreleyen 1 Mb içinde gen yoğunluğu e MRC enz.:. rastgele kontrol eşleşti; 50.000 benzersiz entegrasyon siteleri bir dizi rastgele hg19 içinde Msel / BglII kısıtlama siteleri yakınlığı pozisyon seçerek üretilen MRC rasgele f:. rastgele sabit pozisyonlara normalleşme olmadan hg19 pozisyon seçerek üretilen 10.000 benzersiz entegrasyon siteleri içeren eşleştirilmiş rastgele kontrol.

Watch this Scientific Journal Video about Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites at JoVE.com

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

amplification-next-generation-sequencing-genomic-dna-mapping

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K Görüntüleme.  Dana-Farber Cancer Institute. We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Video: Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Genetik

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

So this is a 10 day old mouse pup and I'm going to be taking a tail biopsy and then I'm going to extract genomic DNA from its tail. So what I'm gonna do is snip a little bit of its tail off, roughly about three millimeters, and then I'll place the piece of tail in an einor tube and I'll place the einor tube on dry ice. Now, to avoid contamination from one mouse to another, I usually mark the razor blade at the part in which I made the last cut.That way for the next mouse, I'll be sure to use a clean piece of razor blade for taking the next tail biopsy. In order to distinguish between the different mice in your litter, you're gonna need a way to identify the mice. One way to do that is by punching a hole in their ears using an ear hole puncher that's shown here.Gently take the mouse by the scruff of its neck like so turn it over and pinch its tail between your fingers. Take the ear hole puncture in the other hand and make a quick snip in the mouse's ear there. See how painless that was?Okay, so now you can see I've got some pieces of tail in these einor tubes and now I'm gonna add the solutions that will help them to digest. First I'm going to add 720 microliters of STE solution, and then I'm going to add 30 microliters of protein. Ace K.So here's a look at the piece of tail that we've cut prior to digestion.Now I'm gonna place the tail pieces on a 55 degree heating block. Many protocols call for continuous motion rocking at 55 degrees, but for my purposes this won't be necessary because I'll be vortexing the tail pieces. Now I'm gonna vortex the piece of tail for two seconds.One, two. So after vortexing, here's a look at what's left inside the einor tube here, and you could see that the piece of tail has been completely dissolved and activate the proteinase K at 70 degrees Celsius for five minutes. Quench on ice for five minutes.Spin down tail pieces in a micro centrifuge for 10 minutes at full speed. In this micro centrifuge, full speed is 13, 000 RPMs. While the digestive tails are spinning down, label some einor tubes fill the einor tubes with 750 microliters of isopropanol.After spinning down the digested tails, the hair and undigested material will form a pellet at the bottom of the tube decant. The solution containing the digested material, STE and proteinase K into the einor tube containing the isopropanol DNA will begin to come out of solution, will appear ghostlike and feather like, and right there swimming around that bubble is genomic DNA that's been isolated from the mouse's tail. After mixing the isopropanol and STE solution, the genomic DNA will come out of solution and it is appear as this little ball right here, spin down the precipitated genomic DNA for five minutes at full speed in a micro centrifuge.There at the bottom of the tube is a look at our pelleted genomic DNA. Now I'm going to aspirate out the solution inside the tube, leaving only the pellet of genomic DNA behind. Each time I aspirate another tube, I'll change the pipe.Pet tip on the tip of this aspirator. After aspirating away the STE and isopropanol, I'll add one milliliter of 70%ethanol to wash the genomic DNA pellet. Because the pellet of genomic DNA usually adheres to the side of a micro fuge tube and is difficult to get off to thoroughly wash it in the 70%ethanol, you'll need to rake it across the micro fuge tube rack I have here.You can do that like so. So here's a look at the genomic DNA after it's been pelleted and washed in 70%ethanol. I'm gonna spin this down again at full speed for five minutes and then aspirate away the 70%ethanol spin down the genomic DNA pellets after they've been washed.Their 70%ethanol five minutes at full speed, going to aspirate the 70%ethanol and let the DNA dry for five minutes. There's a look at the genomic DNA pellet at the bottom of the tube, and that's about as dry as you want to get it. So I've dried out the pellets of genomic DNA from the mouse tails, and now I'm gonna add a hundred microliters of 40 millimolar triss at pH eight.So I've got the genomic DNA at 50 degrees Celsius, where it will go into solution more rapidly than add room temperature. After about an hour or so at 50 degrees, I'll either freeze it or put it at four degrees until I want to run my PCR reactions to actually figure out which mice are positive for my transgene.

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Biyoloji

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

MR Genomik - Sıra Desenler Genomik DNA içinde incelenmesi için Kamu Kaynak

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

Doğrusal Amplifikasyon Dolayımlı PCR - Bilinmeyen Yollardan DNA Genetik Elemanları ve Karakterizasyonu lokalizasyonu

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...