Name: multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos
Uploaded: 2016-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors' work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).

In vitro transkripsiyon RNA probların 1. Etiketleme <ol><li> RNaz içermeyen koşullar altında 1.5 ml&#39;lik bir mikrotüp in vitro transkripsiyon reaksiyonu birleştirin: 10,5 ul DEPC ile muamele edilmiş, H 2, O, 4,0 ul 5x transkripsiyon tamponu, 1.0 ul DEPC işlenmiş, H2O içinde (1 ug) linearize saflaştırılmış kalıp DNA, 1,3 ul NTP karışımı, 0.7 ul hapten ile etiketlenmiş UTP, 0.5 ul RiboLock RNA inhibitörü, 2,0 ul RNA polimeraz. Not: Nihai reaksiyon hacmi 20 ul olduğunu. </li><li> Şablonun promotör sekansı kullanımı T7 bağlı olarak, in vitro transkripsiyon için T3 veya SP6 RNA polimeraz (17 referans bakınız). </li><li> RNA probu için etiket olarak digoxigenin-11-UTP biyotin-16-UTP veya floresan 12-UTP seçin. Daha fazla ayrıntı için, Tartışma Hapten-etiket ve prob konsantrasyonları tartışma bakın. </li><li> Transkripsiyon reaksiyonu karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün. </li><li> Uyarlamak edelim37 ° C de 3 saat karıştırıldı. </li><li> Şablon DNA uzaklaştırılması için transkripsiyon reaksiyonu 1 ul Rnaz içermeyen Dnaz I ekleyin, iyice karıştırılmakta ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. </li><li> DEPC arıtılmış H2O 200 ul örnek hacmi ile ayarlayın. </li><li> Etiketli RNA prob çökeltilmesi için 100 ul (0.5 hacim) 7.5 M amonyum asetat ve 600 ul (3 hacim) etanol ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. <ol><li> Bu adi nükleotidlerin istenmeyen yağış neden olabilir, buz gibi soğuk etanol kullanmayın. </li></ol></li><li> 20 ° C&#39;de 30 dakika maksimum hızda (20,800 xg) bir sıcaklığı kontrol edilen santrifüj transkribe RNA dönerler. Dikkatle süpernatant aspire. </li><li> 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20.800 x g&#39;de 70%, oda sıcaklığında etanol ve santrifüj ile elde edilen pelet yıkayın. </li><li> Süpernatantı ve yanlışlıkla gevşek pelet aspire için dikkatli olun. RT&#39;de bir kaç dakika için açılan kapaklı mikrotüp pelet hava kurumasını bekleyin. </li><li> DisDEPC ile muamele edilmiş H2O 100 ul &#39;de elde edilen pelet çözme </li><li> -20 ° C&#39;de 300 ul ön hibridizasyon tamponu ekleyin (% 50 hacim / hacim deiyonize formamid, 5x SSC, 50 ug / ml heparin sodyum tuzu,% 0.1 hac / hac Tween-20, 5 mg / ml Torula RNA) ve mağaza . Problar -20 ° C&#39;de saklandı uzun süreli olabilir. Not: 100 ul hibridizasyon tamponu içinde yeni transkribe prob seyreltik 3 ul hapten-işaretli RNA probu bir birinci test için DİLERİZ deney için nihai konsantrasyon elde edildi. </li></ol> Uçlar kullanılması Embriyo Örneklerinin 2. işlenmesi Not: farklı inkübasyon adımları embriyolar işlenmesi için mikrotüpler veya çok oyuklu plakaları kullanılarak yanlışlıkla çözeltilerin değişimi sırasında onları aspire embriyoların önemli miktarlarda kaybetme riskini taşımaktadır. Bu kaybı önlemek için, prosedür yoluyla embriyo örnekleri taşıyan (örneğin Netwell ekler gibi) sepet kullanmak yararlı olabilir. Bu polistiren olanEmbriyolar işlem sırasında dinlenme hangi alt (Şekil 2A) bir polyester mesh ile SERT. <ol><li> DİLERİZ prosedürü embriyolar işlem, bir 12 oyuklu plaka (Şekil 2B) uçlar bir araya getirmek ve her bir oyuğa, uygun 2 ml solüsyon ilave edin. </li><li> Mavi ucunu kullanarak ekler içine embriyolar pipetle. Tüm embriyolar sıvı batık emin olun. </li><li> Kuluçka süresi yerde bir sonraki aşama için çözeltisi ile doldurulmuş bir başka 12-çukurlu plaka içinde embriyo ihtiva eden ekler olduğunda. <ol><li> (Şekil 2C) birbirinden (Şekil 2D), bir solüsyonuna bir kerede 12 numuneye kadar transfer taşıyıcıları ve tutamaçları kullanın. Not: gerekli hacmini azaltmak boyama reaksiyonları (Basamak 6.2) ön-hibridizasyon / hibridizasyon adımları (Basamak 4.1) ve 24-kuyucuklu levhalar için 2,0 mi mikrotüpler kullanın. Melezleme ve boyama reaksiyonları 100 hacimlerinde yapılır1, l, sırasıyla 400 ul. </li></ol></li></ol> Hibridizasyon için Embriyolar 3. hazırlanması <ol><li> , Dechorionate, toplayın düzeltmek ve standart prosedürler 14,18 ile embriyolar devitellinize. Hazırlanan embriyolar rutin -20 ° C&#39;de metanol içinde depolanır. </li><li> Embriyolar transfer oda sıcaklığına in situ melezleme için kullanılmaktadır ve oyuk başına 2 ml metanol ile dolu bir 12-yuvalı plakanın ekler halinde dağıtmak için. </li><li> RT&#39;de azalan metanol dizi embriyolar rehidrate. (I) 1 x PBS içinde 1 x PBS, (ii)% 50 metanol içinde% 75 metanol, Tween-20, (iii) 1 x PBS içinde% 25 metanol,% 0.1 Tween-20 (iv% 0.1: 3 dakika içinde için embriyolar her inkübe ) 1x PBS,% 0.1 Tween-20 (v) PBS 1x,% 0.1 Tween-20. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 x PBS&#39;de% 4 paraformaldehid içinde embriyolar ön sabitleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 x PBS&#39;de 3 dakika,% 0.1 Tween-20 için 4 kez yıkanmasından Fiksatif çıkarın. Bu arada Çözülme ve proteinaz K ve glisin çalışma çözümler hazırlar. </li><li&gt; Taze proteinaz K Permeabilize embriyolar 1x PBS içinde, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 için 3 dakika boyunca (50 ug / ml ila 10 ug / ml). Not: proteinaz K tedavisi embriyo tespitin gücüne dengelenir. Ön sabitleme adımı (3,4) mevcut değildir, örneğin, yumuşak bir proteinaz K tedavisi uygulanabilir. </li><li> % 0.1 Tween-20, oda sıcaklığında 2 mg / 1 x PBS içinde mi, glisin, iki 1 dakika durulama ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 x PBS&#39;de% 4 paraformaldehid içinde embriyolar sonrası sabitleyin. </li><li> Daha sonra, oda sıcaklığında 1 X PBS içinde 3 dakika,% 0.1 Tween-20 için yıkama dört kez paraformaldehit fiksatif çıkarın. </li><li> Aktarım sonrası sabit embriyolar ön hibridizasyon tampon. Ön-hibritleme hibritleme tamponu içinde mağazası embriyolar -20 ° C&#39;de ya da doğrudan amacı ile sondaların hibritleşmesi devam edin. </li></ol> Sondalar 4. Melezleme <ol><li> Embriyolar transfer oda sıcaklığına ön hibridizasyon tamponu içinde -20 ° C&#39;de saklandı. 2,0 ml microtub içine önceden hibridizasyon tamponu içinde embriyolar dağıtınes. </li><li> En az 30 dakika için ön-hibritleme hibritleme tamponu içinde 65 ° C &#39;de embriyo örnekleri önceden hibridize. Not: Ön melezleştirme ve melezleştirme için, bir su banyosu kullanılmıştır adımları tekrarlayın. Ön melezleme sırasında üç antisens RNA probları, her biri farklı bir gen transkriptinin için özel ve farklı bir haptenle işaretlenmiş kombine etmek üzere prob karışımı hazırlamak için zaman vardır. </li><li> Prob bir karışım elde etmek için, 100 ul hibridizasyon tamponu (% 50 hacim / hacim deiyonize formamid, 5x SSC, 50 ug / ml her biri istenen, özgün hapten-etiketli antisens RNA probu (genellikle 1 ul ul 6 arasındaki) ile birlikte uygun miktarlarda ilave heparin, sodyum tuzu,% 0.1 hac / hac Tween-20, 5 mg / ml Torula RNA,% 5 ağırlık / hacim, dekstran sülfat). Not: dekstran sülfat ilavesi tercihe bağlıdır. </li><li> 5 dakika boyunca 80 ° C&#39;de bir ısı blokunda antisens RNA probu karışımı denatüre. Daha sonra 65 ° C&#39;ye kadar, doğrudan denatüre prob karışımı aktarın. </li><li> Ön-hibritleme en kaldırEmbriyo örneklerinden tampon ve denatüre prob karışımı ekleyin. </li><li> Embriyo örnekleri 65 ° C &#39;de karışım O / N prob hibridize olsun. Not: 55 ° C ve 65 ° C arasında değişen sıcaklıklar rutin melezleştirme öncesi ve sonrası hibridizasyon adımları için kullanılır. 65 ° C&#39;de hibridizasyon, en sıkı koşullar sağlar ve daha düşük sıcaklıklar kullanılarak, arka plan sorunlar durumunda önerilir. Herhangi bir arka plan sorunları geliştirilmiş sinyal kuvveti ve iyileştirilmiş embriyo bütünlüğü avantajını sağlar, 55 ° C&#39;de melezleştirme tavsiye edilir, varsa. </li><li> Sonraki sabah ilk emin zaman içinde doğru sıcaklığa ısıtılır olduğundan emin olmak için, 65 ° C&#39;ye kadar bir sertlik yıkamayı çözüm aktarın. </li><li> 2 ml önceden ısıtılmış hibridizasyon yıkama tamponu ihtiva eden bir 12-yuvalı plakanın uçlar halinde 2,0 ml mikrotüpler embriyolarında aktarma melezleştirme prob karışımı (2 x SSC içinde% 50 formamid,% 0.1 Tween-20). Onları içeren 12-plaka koyunbir fırın içinde bryo örnekler ve 65 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 2 mi, yeni hibridizasyon yıkama tamponu transfer embriyo örnekler ve 65 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. Bir kez daha bu adımı yineleyin. </li><li> 2 x SSC içinde, bir kez 65 ° C&#39;de 20 dakika yıkama yapılmıştır aşırı prob çıkarın,% 0.1 Tween-20 ve 0.2 x SSC içinde üç kez,% 0.1 Tween-20. </li><li> PBS, Tween-20 oda sıcaklığında% 0.1 1x embriyo örnekleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında en az 30 dakika blokaj tamponunda (1x PBS,% 0.1 Tween-20 içinde% 8 serumu) embriyolar inkübe edin. </li></ol> Hapten etiketli Sondalar 5. Antikor tespiti Not: Tüm üç farklı işaretli prob eşzamanlı hibridizasyon aksine, her bir prob bir antikor inkübasyon ve lekeleme ayrı mermi birbiri ardına tespit edilir. Bu nedenle, her bir algılama tur tek antikoru kullanıldığında (anti-digoksijenin-AP ya da anti-floresin-AP ya da anti-biyotin-AP) oluşur. <ol><li> STEP arasında seçim5.1.1 5.1.3 ve tespit edilecek olan hapten-etiketi göre uygun bir antikor seyreltme hazırlanması ile devam etmek. Not: farklı etiketli problar sıralı saptanması için, bir anti-hapten antikor her bir algılama döngüsü uygulanır. <ol><li> Bloke edici tampon içinde 4000:, floresein-işaretli prob algılama seyreltik için anti-floresan AP 1 konjugatlar. </li><li> Bloke edici tampon içinde 4000: a digoksigenin-etiketli prob tespiti seyreltik için, anti-digoksijenin-AP 1 konjugatlar. </li><li> Bloke edici tampon içinde 4000 seyreltme: bir biyotin-etiketli prob saptanması için, bir 1 de bir anti-biyotin-AP konjugat solüsyon hazırlanır. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 3 saat 4 için, seçilmiş anti-hapten-AP çözeltisi embriyolar inkübe edin. Seçenek olarak ise, O / N 4 ° C&#39;de inkübe edin. Aynı anda üç antikorları sürmeyin. </li><li> Bağlanmamış antikorların çıkarılması için 1 x PBS, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 kat 4, 15 dakika ile embriyolar yıkayın. </li><li> Tampon sistemlerini değiştirmek olduTNT oda sıcaklığında H iki kez 15 dakika (8,0 0.1 M Tris-HCI pH 0.1 M NaCl,% 0.1 Tween-20). </li></ol> 6. Alkalin Fosfataz Kromojenik Boyama <ol><li> Antikor bulgulama takiben (bakınız Tablo 1) 6.1.4 STEP 6.1.1 arasında seçim ve istenilen renk sinyali elde etmek için alkalin fosfataz kromojenik boyama reaksiyonlar bir ile devam eder. Tespit, her tur için farklı bir kromojenik alt tabaka reaksiyon, başka bir renk, her transkript örneğini vurgulamak için uygulanır. <ol><li> Hızlı Kırmızı Boyama <ol><li> TT8.2 15 dakika boyunca (0.1 M Tris-HCI pH 8.2,% 0.1 Tween-20) için embriyolar, iki kez yıkayın. </li><li> Embriyoların yıkarken, Fast Red TR / NAMP Alkalen Fosfataz Yüzey Tablet Set Hızlı Kırmızı boyama solüsyon hazırlanır. </li><li> Damıtılmış su, 1 ml ayarlanır tabletin bir tampon tableti çözülür ve 0.1 M Tris-HCl, pH 8,2 elde edilir vorteks karıştırın. </li><li> Hazırlanan T içine Fast Red TR / NAMP tablet Bırakris tampon ve Hızlı Kırmızı boyama çözüm elde etmek için vorteks çözülür. </li><li> 0.2 um&#39;lik bir şırınga filtreden geçirilmiştir olmayan çözülmüş parçacıklarından açık Hızlı Kırmızı boyama çözeltisi. </li></ol></li><li> Hızlı Mavi Boyama <ol><li> Taze SB8.2 lekeleme tampon maddesi içinde 15 dakika için embriyolar, iki kez yıkayın (0.1 M Tris-HCI pH 8.2, 0.1 M NaCI, 0.05 M MgCI2,% 0.1 Tween-20). </li><li> Embriyoların yıkarken 50 mg / DMF () mi Fast Blue BB ve (DMSO içinde) 50 mg / ml naftol fosfat stok çözeltilerinden hızlı mavi ile boyanmamış solüsyon hazırlanır. </li><li> Taze SB8.2 içinde 0.5 mg / ml&#39;lik bir Fast Blue BB solüsyon hazırlanır. </li><li> Taze SB8.2 içinde 0.5 mg / ml&#39;de ayrı naftol fosfat solüsyon hazırlanır. </li><li> Bir girdap ile sabit karıştırma altında Fast Blue BB çözeltisi içine hazırlanmış naftol fosfat çözeltisi ilave ilave edildi. Ortaya çıkan son çalışma konsantrasyonu, hem alt tabaka bileşenleri için ml 0.25 mg / olduğunu. Not: Farklı Hızlı Mavi / naftol fosfonathate kombinasyonları, değişik renk tonları (Tablo 1 e bakınız) ile sonuçlanır. </li></ol></li><li> BCIP / NBT Boyama <ol><li> Taze SB9.5 lekeleme tampon maddesi içinde 15 dakika için embriyolar, iki kez yıkayın (0.1 M Tris-HCI pH 9.5, 0.1 M NaCI, 0.05 M MgCI2,% 0.1 Tween-20). </li><li> Bir purpleblue kromojenik sinyal için, taze 1 ul levamizol, 3,5 ul BCIP ve SB9.5 lekeleme tampon maddesi ml&#39;si başına 4.5 ul NBT ekleyerek BCIP / NBT boyama solüsyonu hazırlamak ve iyice karıştırın. </li></ol></li><li> INT Boyama <ol><li> Taze SB9.5 lekeleme tampon maddesi içinde 15 dakika için embriyolar, iki kez yıkayın. </li><li> Bir yellowbrown kromojenik sinyal için, taze 1 ul levamizol, 5 ul Kırmızı-Fos ve SB9.5 lekeleme tampon maddesi ml&#39;si başına 5 ul INT ekleyerek INT boyama solüsyonu hazırlamak ve iyice karıştırın. Not: Alternatif olarak 7,5 ul / ml BCIP / INT hazır kullanım boyama çözeltisi kullanılır. </li></ol></li></ol></li><li> Boyama reaksiyon transferi embriyo örnekleri içinBir 24-yuvalı plaka. Karanlıkta seçilen boyama çözeltisi 400 ul her bir örnek inkübe edin. </li><li> Bir stereomikroskop altında gelişimini sinyal bazen izleyin. Istenen sinyal gücü elde edilmiş ve önemli bir arka plan sinyali gözlenir önce zaman boyama reaksiyonu durdurun. </li><li> Kromojenik reaksiyonu durdurmak oyuk başına 2 ml&#39;lik TNT ihtiva eden bir 12-çukurlu plaka içinde uçlar lekeli embriyolar aktarın. TNT lekeli embriyolar iki kez durulayın. </li><li> 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca iki kez yıkanır embriyolar, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 bakiye substratı temizlemek için. </li></ol> 7. Antikor Temizleme / Alkalen Fosfataz İnaktivasyonu <ol><li> Antikorunu çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika için düşük pH, durdurma çözeltisi (0.1 M glisin-HCI pH 2.2,% 0.1 Tween-20) 2 ml kuluçkalama ile alkalin fosfataz etkisiz hale getirirler. </li><li> Oda sıcaklığında 1 x 2 ml PBS,% 0.1 Tween-20 ile 1 dakika için durulayın. </li><li> 1 x PBS içinde 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın,% 0.1 Tween-20 ilave edilir. </li></ol> 8. İkinci Algılama Yuvarlak <ol><li> İkinci kopyanın dağılımını saptamak için ikinci hapten-etiket karşı hedeflenen antikor AP eşleniklerini kullanarak hapten-etiketli problar (STEP 5.4 5.1) antikor tespiti ile devam edin. </li><li> Alkalin fosfataz kromojenik boyama (STEP 6.5 6.1) (mevcut renkler Tablo 1&#39;e bakınız için) ilk saptama turunda kullanılan birine zıt renk üreten bir alt tabaka kombinasyonu uygulayarak gerçekleştirin. </li><li> 7.3 ADIM 7,1 de tarif edildiği gibi ikinci antikor-AP konjugatı çıkarın. </li></ol> 9. Üçüncü Algılama Yuvarlak <ol><li> Üçüncü bir transkriptin dağılımını tespit etmek için, antikor-AP 3 hapten-etiket için belirli bir konjugatlar kullanılarak hapten-işaretli prob antikor tespiti (Basamak 5.4 5.1) devam edin. </li><li> Alkalin fosfataz kromojenik boyama (STEP 6.5 6.1) ap olmayan bir alt tabaka kombinasyonu uygulayarak gerçekleştirinBir önceki algılama turlarında uğraşıyorlardı. Bir renk önceki iki algılama mermi olanlardan ayırt etmek kolay çöktürmek üreten kromojenik reaksiyonu seçiniz (renk seçimi için bakınız Tablo 1). </li></ol> 10. Montaj ve Görüntüleme <ol><li> PBS içinde% 30 gliserol düzgün lekeli embriyoların transferi ve embriyoların tam gliserol çözeltisi batırılmış kadar kuluçkaya yatmaktadır. Onlar dibe batar Onlar iyi dengelenir. </li><li> H 2 O% 70 gliserol embriyo transferi ve oda sıcaklığında dengeye izin. Lekeli embriyolar 4 ° C&#39;de% 70 gliserol içinde saklanabilir. </li><li> Montaj için pipet bir nesne slayt üzerine ve slayt (Şekil 3) yapıştırılmış aralayıcıları dokunmadan% 70 gliserol damlacık embriyolar boyandı. Kapak kayma uygulayın. </li><li> Görünüm bir mikroskop altında embriyolar monte edilmiş. Embriyolar istenilen açıda döndürmek, böylece uygulanan kapak kayma taşıyın. </li><li> Düzgün gözlemleyinDiferansiyel Girişim Kontrast optik ile bileşik mikroskop altında yüksek çözünürlüklü (20X, 40X hedefleri) yönlendirilmiş embriyolar. </li><li> Bir dijital renkli kamera ile görüntüler yakalayın ve dijital depolama aygıtında kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Situ Hybridization Methods. , (2015).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846 (2004).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization:+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules.">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).</li><li>Speel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robert+Feulgen+Prize+Lecture+1999.+Detection+and+amplification+systems+for+sensitive,+multiple-target+DNA+and+RNA+in+situ+hybridization:+looking+inside+cells+with+a+spectrum+of+colors.">Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors.</a> Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Hartmann, C., J&#228;ckle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+relationships+between+a+novel+Drosophila+stripe+expressing+gene+and+known+segmentation+genes+by+simultaneous+visualization+of+transcript+patterns.">Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns.</a> Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).</li><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+detection+of+mRNA+transcript+localizations+in+fish+and+fly+embryos+using+alkaline+phosphatase+and+beta-galactosidase+conjugated+antibodies.">Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies.</a> Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).</li><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-,+two-,+and+three-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos.">One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Methods. 23 (4), 359-372 (2001).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+vertebrate+and+Drosophila+embryos.">Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos.</a> Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolour+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos.">Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).</li><li>O'Neill, J. W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-label+in+situ+hybridization+using+biotin+and+digoxigenin-tagged+RNA+probes.">Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes.</a> Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).</li><li>S&#246;ll, I., Hauptmann, G., G, H. a. u. p. t. m. a. n. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolored+visualization+of+transcript+distributions+in+Drosophila+embryos.">Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).</li><li>Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzed+reporter+deposition,+a+novel+method+of+signal+amplification.+Application+to+immunoassays.">Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays.</a> J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+whole-mount+in+situ+hybridization.">Multicolor whole-mount in situ hybridization.</a> Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).</li><li>S&#246;ll, I., Hauptmann, G., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+and+automated+whole-mount+in+situ+hybridization+for+systematic+gene+expression+analysis+in+embryonic+zebrafish+forebrain.">Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).</li><li>Bergalet, J., et al., Hauptmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcript+localization+in+Drosophila+embryos+and+tissues+visualized+by+multiplex+FISH.">Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).</li><li>Walldorf, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empty+spiracles,+a+gap+gene+containing+a+homeobox+involved+in+Drosophila+head+development.">Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development.</a> Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).</li><li>Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+transcripts+from+the+segmentation+gene+fushi+tarazu+during+Drosophila+embryonic+development.">Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development.</a> Cell. 37 (3), 833-841 (1984).</li><li>Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+sloppy+paired+locus+encodes+two+proteins+involved+in+segmentation+that+show+homology+to+mammalian+transcription+factors.">The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors.</a> Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+gene+expression+patterns+reveal+transverse+and+longitudinal+subdivisions+of+the+embryonic+zebrafish+forebrain.">Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).</li><li>Long, S., Rebagliati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+two-color+whole-mount+in+situ+hybridizations+using+digoxygenin-+and+dinitrophenol-labeled+RNA+probes.">Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes.</a> Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+using+enhanced+tyramide+signal+amplification.">Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification.</a> Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).</li><li>Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-labeling+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+analysis+of+overlapping+gene+expression+in+brain+tissue+with+high+level+of+autofluorescence.">Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence.</a> J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).</li><li>Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase-fast+red,+a+new+fluorescent+label.+Application+in+double+labelling+for+cell+cycle+analysis.">Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis.</a> J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alkaline+phosphatase-mediated+azo+dye+staining+for+dual+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish.">Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Radyoaktif olarak etiketlenmiş nükleik asit probları ile in situ hibridizasyon (ISH) sık sık doku kesitlerinde RNA lokalizasyonu tespit etmek için kullanılır. Radyoaktif ISH yöntemi, ancak daha az duyarlı zaman tüketen, ve tam bağlar tam transkript dağıtım desen takdir izin vermez. Bunun aksine, bu tarifnamede anlatılan MC-DİLERİZ yöntemi sağlam embriyolar içindeki renk kontrast çoklu gen sentezleme etki doğrudan bir karşılaştırmaya izin. MC-DİLERİZ histolojik bağlam hemen belli ve standart aydınlık mikroskobu ile kolayca görüntülendi avantaja sahiptir. Bu olasılık yüksek hassasiyetle birbirine topografik gen ifadesi etki ilgilidir ve hızlı ve güvenilir bir şekilde benzersiz ve üst üste ifade siteleri tanımlamak sağlar. Öte yandan, çok katlı flüoresan ISH (FISH) hassasiyet ve çözünürlük ile ilgili olarak daha güçlü ve tercihen ise selüler ya da alt-hücresel yeniden kullanılır,mRNA tespiti çözümü gereklidir. MC-WISH haritalanmıştır transkript geniş spektrumlu hemen hemen herhangi bir transkript embriyonik değil, aynı zamanda larva ve yetişkin dokularda ve Drosophila başka türlerde de sadece analiz edilebilir olduğunu göstermektedir. Nitekim, Drosophila için burada ayrıntılı açıklanan prosedür, Zebra balığı embriyolarının 11,16,22 ile benzer verimli çalışır. Ayrıca, MC-DİLERİZ yöntemi serisinden, omurgasız ve omurgalı embriyoları ve doku numunesinin çeşitli adapte edilebilir. Hapten-etiket ve prob konsantrasyonları Rutin olarak RNA probların hapten etiket olarak floresein, digoksigenin ve biyotin kullanın. Ayrıca, dinitrofenol işaretli problar tatbik edilebilir, zebra balığı DİLERİZ deneylerde 23-25&#39;te ortaya konan. Fluoresein iyi f kullanılır, böylece, floresein-işaretli problar ve diğer hapten-etiket ile karşılaştırıldığında daha düşük bir hassasiyet gösterdikleri içinbol transkriptlerin ya da tespiti. Her yeni transkripsiyon prob birinci performans alt-tabaka olarak BCIP / NBT ya da Hızlı Kırmızı kullanılarak değerlendirilmişlerdir tek bir DİLERİZ deneyde, test edilir. Arka plan geliştirme olmadan güçlü bir sinyal birkaç saat için dakika içinde elde edildiğinde bir prob konsantrasyonu optimum olarak kabul edilir. Ilgi alanları ifade MC-WISH tam ölçüde tespit edilmiştir emin olmak için, en hassas alt tabaka kombinasyonu, BCIP / NBT kullanarak tek etiketli DİLERİZ deneyleri ile her transkript desen görselleştirmek için esastır. Bu zayıf ifade alanları çoklu hedef deneyinde ardı edilmemesini sağlar. Diğer alt tabaka kombinasyonlarının az hassasiyet telafi etmek için standart BCIP / NBT boyanması ile karşılaştırıldığında prob konsantrasyonları (üçe kadar) iki katına kullanmak esastır. Düşük pH inaktivasyonu Düşük pH inaktivasyon adımı yol açabilirİkinci ve üçüncü boyama turlarında azalmış sinyal tespiti ile sonuçlanan antisens hapten etiketli RNA prob / sense mRNA melezleri kısmi dağılması. Hassasiyet kaybı en aza indirmek için, etkisiz hale getirilmesi adımları mümkün olduğu kadar kısadır. Bu düşük pH değerinde 10 dakika kuluçkalama süresi AP aktivitesi ortadan kaldırılması için yeterli olduğu yaşadı. Geniş hacimli sonraki hızlı yıkar bağlanmamış antikor-AP konjügatların hızlı seyreltme sağlamak ve haptenized problar yeniden bağlayıcı engeller. Alternatif prosedürler paraformaldehit fiksasyon ve ısı inaktivasyonu yer almaktadır. Buna rağmen, renk çökeltilerinin bir ısıya kararlı değildir ve paraformaldehit sabitleme AP tam deaktivasyonu için yeterli olmayabilir. İlk uygulanan antikor AP çiftinden Eksik inaktivasyonu aşağıdaki algılama yuvarlak tespit edilecek olan ikinci bir mRNA türleri ile ifade yanlış pozitif örtüşme yol mRNA Desenin-görselleştirme yeniden yol açabilir. Bu nedenle, bir kontrol deneyinde the embriyolar uygulanan antikor AP çiftinden biri inaktive sonra iki bölüme ayrılır. Ikinci antikor-AP konjugat kontrol fraksiyondan ihmal edilir ve ikinci renk reaksiyonunda bir sinyal üretmek gerekir. İkinci renk reaksiyon, ilk önce bir tekabül eden bir sinyal dağıtım deseni oluşturur, ancak, o zaman etkisizleştirme prosedürü etkili oldu. Bu durumda, düşük pH durdurma çözeltisi içinde inkübasyon süresi bir sonraki deney için devam edilmelidir. AP alt-tabaka uygulamanın siparişleri Duyarlılığı tespit sonraki her yuvarlak damla yana, önceden daha bol transkriptlerin az bol mRNA&#39;ların tespit etmek için tavsiye edilir. Hızlı boyalar tercihen güçlü bir ifade transkript tespiti için ilk boyama tur uygulanır ve böylece ek olarak, hızlı kırmızı ve Fast Blue substrat kombinasyonu, anlamlı purpleblue BCIP / NBT leke daha az duyarlıdır. Bu aynı zamanda, hsonraki BCIP / NBT boyama izlenir ve purpleblue sinyali hafif Hızlı boyalara göre çok kararmadan zamanında durdurulabilir avantaj olarak. Böylece standart iki renk deneyde, ilk güçlü ifade mRNA Hızlı Kırmızı tarafından tespit edilir ve ikinci zayıf BCIP / NBT tarafından. Bununla birlikte bir süre sonra yaygın hale çökelekler üretebilecek san INT substrat kombinasyonu tatbik edilebilir hızlı boyalar alternatif olarak. Bu nedenle, BCIP / INT sadece son boyama turunda uygulanır. Dolayısıyla üç renkli deneyde biz genellikle ilk Fast Red, ikinci BCIP / NBT (veya Hızlı Mavi) ve üçüncü bir INT substrat kombinasyonunu kullanabilirsiniz. O INT uygularken mümkün olan en kısa sürede lekeli embriyolar fotoğraflamak için tavsiye olduğunu unutmayın. Azo boyalarının Floresan algılama Bu koyu renk çökelti hafif bir gölge zaman örtüşen ifade şekilleri tanımak bazen zor olabilir. Fveya örneğin, bir güçlü bir şekilde gelişmiş BCIP / NBT çökelti hafif Hızlı boya sinyallerini maskeleyebilir. Bu sorunu aşmanın bir yolu, her boyamadan hemen sonra görüntülerini yakalamak ve sonraki algılama turdan önce uygulanan renk çökelti kaldırmaktır. Bu durumda, alkol çözülebilir bir azo boya (Fast Red) ve INT çökeltiler, sırasıyla birinci ve ikinci algılama turundan sonra etanol yıkaması ile çıkarılır ve BCIP / NBT boyama geçen AP-alt-tabaka 26 uygulanır. Diğer bir olasılık, azo boyalarının, floresan özelliklerinin avantajlarından almaktır. Fast Blue uzak-kırmızı filtre ile 28,29 gözlemlenebilirken Fast Red, 27 setleri rodamin filtresi kullanılarak görüntülenebilir. Çok yoğun olmak ve azo boya floresan sinyal gidermek kalmaması Karşılaştırılması veya kromogenik ve floresan görüntülerin bindirme, zamanında durdurulması için olan co-distribution.Using bu yaklaşımı, BCIP / NBT sinyal geliştirme siteyi ortaya çıkarabilir Reaksiyon ürünü.

Situ hibridizasyon (ISH) hücreler, dokular ve organizma 1 içinde morfolojik bağlamda tespiti ve RNA transkript lokalizasyonu, standart bir yöntemdir. ISH prosedürü ile üretilen sinyaller genellikle radyoaktif floresan ve kromojenik algılama sistemleri tarafından görüntülenmiştir. Son yıllarda floresan ISH önemli teknolojik gelişmeler (FISH) 2 tek moleküllerin 3,4 görüntü albüm kadar tek hücre ve alt hücre düzeyine ve RNA görselleştirme de algılama ve RNA ifade kantitatif izin önemli ölçüde geliştirilmiş hassasiyet ve çözünürlük sonuçlandı Sofistike tek-molekül FISH yöntemleri daha özelleşmiş uygulamalar için kullanılır, kromojenik ISH araştırma ve klinik teşhis yerinde tespit yönteminde rutin RNA gibi yaygındır. Kromojenik olarak saptanması için, enzim çökeltme reaksiyonları sitelerinde zıt renklerin görünür ürünler üretmek kullanılır, ve bunlarmelezleme 5. Bu RNA görselleştirme rutin histolojik lekeleri ve morfolojik bağlamda ile kombine edilebilir avantaj standart aydınlık mikroskobu ile hemen belirgindir vardır. Ayrıca, uygulanan renk alt-tabakaların çok sayıda kalıcı numune preparatlar 5 elde edilebilir, böylece bir organik ve / veya sulu bir ortam içinde, montaj kararlı olan çökelti, üretir. Drosophila, ilk ISH protokolleri kesitli malzeme 6 transkript tespiti için radyoizotop işaretli problar uyguladı. Bu doku kesitlerinde, tüm embriyolar veya organ sistemlerinin tam transkript kalıpları yeniden zor olsa da, sigara radyoaktif olarak etiketlenmiş problar ile kromojenik ISH prosedürlerinin uygulanması sayesinde tam bağlar 7 RNA dağılımlarını tespit global olarak kolaylaştırır. Kromojenik ISH birçok varyasyonu bulunmasına rağmen, tipik olarak in situ hibridizasyon (DİLERİZ) protokollerini hyb bütün montajridized hapten-etiketli problar anti-hapten antikor bir raportör enzime konjüge edilmiş ve mRNA transkriptlerinin bir çökeltici kromojen tarafından görüntülenmiştir ile tespit edilir. Raportör tarafından üretilen farklı renkli çökelti paleti alkalin fosfataz (AP), yaban turpu peroksidazı (POD) ve beta-galaktosidaz (GAL) birinde birden fazla hedefin ayırt edici tespiti ve aynı örnek 8-14 sağlar enzimleri. Ancak, POD enzim aktivitesi sadece sınırlı bir süre sürer ve ek (tiramid) sinyal amplifikasyon 15 daha az bol transkript tespiti, bu enzimler ile zor olabilir olmadan, böylece GAL kolorimetrik reaksiyon, biraz daha az duyarlıdır. Bunun aksine, AP aktivitesi kalıcı, uzun ömürlü alt-tabaka dönme ve yüksek sinyal-gürültü oranı sağlar. Bu nedenle, farklı renkli yüzeylerde AP muhabiri enzimi kullanılarak sıralı algılama etkili başarılı olduğu kanıtlanmıştır veTek embriyoların 10-12,16 kadar üç farklı transkript ayırt edici algılama. Bu çoklu hedef kromojenik VVISH (MC-DİLERİZ) metodu (Şekil 1) 14, işaretlenmiş antisens RNA probları in vitro transkripsiyonu ile üretildi ve uygun hapten-etiket biri ile işaretlenir. Embriyolar formaldehid sabit ve metanol tedavisi ve proteinaz K sindirimi ile geçirgenleştirildi bulunmaktadır. Embriyoların Hibridizasyon aynı anda üç farklı etiketli antisens RNA probları farklı bir genden her özel ile gerçekleştirilir. Titizlikte yıkama yapılmıştır bir bağlanmamış sondanın ayrılmasından sonra, her hapten-etiket, tarayıcı ayrı tur görüntülenmiştir. Tek bir belirleme turu lokalize sabit renk çökelti üreten bir AP-alt-tabakanın uygulanmasıyla AP ve RNA görselleştirme bağlanmış bir anti-hapten antikoruyla embriyoların inkübasyondan oluşur. Antikor tespiti ve boyanması, uygulanan antikor-AP konjugat sonraKapı, bir düşük pH yıkama ile çıkarılır. Renkli deneylerde, algılama her turda farklı hapten-etiketine karşı hedeflenen bir antikoru kullanan ve her transkript desen farklı bir renk alt-tabaka (Tablo 1) ile görüntülenir. Embriyolar gliserol monte ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) optikler kullanılarak yüksek çözünürlüklü bileşik mikroskop altında görüntülenmiş.

<table><tbody><tr><td>Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-free&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTP Set</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-12-UTP</td><td>Roche</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolute&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium citrate</td><td>Scharlau</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>deionized formamide</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>RNA type VI from torula yeast</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-biotin-AP Fab fragments&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody</td><td>Vector laboratories</td><td>MB-3100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Scharlau</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Applichem</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red tablet set</td><td>Sigma</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>Fast Blue BB salt</td><td>Sigma</td><td>F3378</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-MX-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N5000</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-GR-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N3625</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-BI-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N2250</td><td></td></tr><tr><td>Magenta-Phos</td><td>Biosynth</td><td>B7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>INT/BCIP solution</td><td>Roche</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 86-88%</td><td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>Universal incubator</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Grant</td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&amp;nbsp; inserts 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Netwell carrier kit 15 mm</td><td>Corning</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos

Embriyonik gelişim ve hassas farklı genlerin yerinde birbirlerine mekansal ilişki ifade edilir nasıl tanımlamak için esastır organogenezis sırasında aktif gen düzenleyici ağları analiz etmek. Çoklu hedef kromojenik tüm montaj situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) aynı numune numune renkleri zıt farklı mRNA türlerinin ayırt edici görselleştirme izin verdiği ölçüde, gen ekspresyonu anında karşılaştırılmasını kolaylaştırır içinde. Bu olasılık yüksek hassasiyetle birbirine topografik gen ifadesi etki ilişkilendirmek ve benzersiz ve örtüşen ifade siteleri tanımlamak sağlar. Sunulan protokol, Drosophila embriyolar farklı genin mRNA ekspresyonu karşılaştırılması için bir MC-DİLERİZ prosedürü açıklar. Üç RNA probları, her bir gen için spesifik ve farklı bir hapten etiketli kadar, embriyo örnekleri aynı zamanda hibritlenmiş ve daha sonra alkali ile algılanırne kolorimetrik immunhistokimya fosfataz tabanlı. Açıklanan prosedür burada Drosophila için ayrıntılı ama Zebra balığı embriyolarının ile eşit derecede iyi çalışıyor.

Açıklanan protokol, farklı renklerde desen çok sayıda transkript eşzamanlı olarak gösterebilir. MC-DİLERİZ doğrudan aynı embriyo farklı genlerin ekspresyonu karşılaştırmak için avantaj sağlar. Bir örnek olarak, boş spiracles ekspresyon modelleri (EMS) 19, Fushi tarazu (STB) 20 ve özensiz eşleştirilmiş 1 (slp1) 21 ile doğrudan Drosophila melanogaster blastoderm aşamasında embriyoların karşılaştırıldı ve renk tonları çeşitli görselleştirildiği (Şekil 4) . Farklı AP alt-tabaka kombinasyonları renkli çökelti (Tablo 1) zıt bir panel elde etmek için kullanılabilir. Hızlı Kırmızı ve BCIP / NBT tarafından üretilen mor çökelti tarafından üretilen kırmızı renk çökelti kolaylıkla ayırt edilebilir ve bu nedenle en yaygın kullanılanİki renkli deneylerinde ly (Şekil 4A). Hızlı Kırmızı renk transkript kısmi eş dağılımı durumunda gizlenmiş böylece Ancak, BCIP / NBT leke hızla oldukça koyu bir renk dönüşebilir. Bu nedenle, hızlı mavi uygulama NAMP, NAGP ve NABP olmuştur (Tablo 1) ile kombinasyon halinde mavi, yeşil ve mor ürünleri ortaya avantajı olabilir. NAMP Hızlı Mavi kombinasyonu ems sırasıyla kırmızı ve mavi görüntülenmiştir slp1 ifade siteleri (Şekil 4B) için burada gösterildiği gibi komşu veya üst üste ifade alanlarında Hızlı Kırmızı üründen kolayca ayırt edilir bir açık mavi renk verir. Yeşil ems etki açıkça kırmızı slp1 ifade sitesi (Şekil 4C) den farklıdır, böylece Hızlı Mavi NAGP kombinasyonu, Hızlı Kırmızı leke benzer güçlü bir kontrast sağlar. Ancak, ems ve slp1 ifade siteleri de eğerFast Blue NABP ve de Hızlı Kırmızı ile korunan, sırasıyla elde edilen mor ve kırmızı renk tortular (Şekil 4D) daha az fark bulunmaktadır. Yukarıda belirtildiği gibi, kırmızı ve yeşil, sırasıyla, (Şekil 4D) &#39;de slp1 ve FTZ ifadesi ile gösterildiği gibi, hızlı kırmızı ve Fast Blue NAGP ayırt etmek kolaydır. INT ile kombinasyon halinde MagentaPhos FTZ segmental ekspresyonu (Şekil 4C, D) ortaya çıkarmak için kullanılan, sarı renkte bir çökelti oluşturur. Sarı renkli çökelti Hızlı Mavi NAMP sırasıyla (Şekil 4E) MAG / INT ile slp1 ve FTZ tespiti ile örneklendiği gibi mavi renkli yüzeylerde iyi bir kontrast oluşturur. Ancak, sarı çökelti Hızlı Kırmızı üründen daha kolay fark edilebilir. Ems sarı lekeli ifade alanı pek distribütörün olabilir<html> kırmızı (Şekil 4F) &#39;de gösterilen slp1 rostral ifadesinden nguished. Bu yüzden, renk alt-tabakaların kombine dikkatle her bir deney için seçilmelidir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> Şekil MC-Wish 1. Akış Şeması. Üç benzersiz transkript kalıplarının çok renkli görselleştirme için, her algılama döngüsünde farklı antikor-AP konjugatlarında ve renk kombinasyonları substrat arasında seçim. Kısaltmalar: AP, alkalin fosfataz; BIO, biyotin; DIG, digoxigenin; FLUO, floresein. Diğer kısaltmalar efsaneleri 4 ve Tablo 1 Şekil bakın. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> s / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; Embriyo taşıyıcıları olarak Şekil 2. ekler. (A) 15 mm çapında ve 74 um ağ gözü büyüklüğü poliester membranları ile altına takılı Uçlar Drosophila embriyo taşıyıcı olarak kullanılır. (B) ekler çeşitli çözeltiler için rezervuar tepsiler olarak işlev 12-yuvalı plakalar içinde bir araya getirilir. (C) Mevcut taşıyıcılar ve kolları 12 ekler / embriyo örnekleri aynı anda. (D) işleme izin <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> Lekeli embriyoların Şekil 3. montajı. Embriyolar ayırıcılar olarak işlev lamelleri, iki yığınlarının arasında% 70 gliserol bir damla monte edilmiştir. Uygulamanın Nazik hareketliyalan, büyük lamel gözlem ve fotoğraf için istenen yönelim içine monte edilmiş embriyolar döndürmek için yardımcı olur. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> Şekil 4. Drosophila embriyolar mRNA transkript renkli görselleştirme. Drosophila embriyolar MC-DİLERİZ deneyleri örnekleri yanal görüşlerinden gösterilmiştir. Boş spiracles mRNA ifadesi kalıpları (ems), Fushi tarazu (FTZ) ve özensiz eşleştirilmiş 1 (slp1) her panelde belirtilmiştir farklı AP renk kombinasyonları substrat, tarafından görüntülenmiştir. Tutanaklar (A) FTZ Fluo ve ems DIG (saptandı <strong&gt; B) Fluo, ems BIO ve FTZ DIG, (C) ems BIO, FLUO slp1 ve FTZ DIG, (D) FTZ BIO, FLUO slp1 ve ems DIG, (E) slp1 FLUO, ems DIG slp1 ve FTZ BIO, (F) FTZ BIO, Fluo slp1 ve ems DIG sondaları etiketli. Hapten etiketli problar immünhistokimyasal listelenen siparişler birbiri ardına tespit edildi. Kısaltmalar: FB Hızlı Mavi; FR, Hızlı Kırmızı tablet. Diğer kısaltmalar efsaneleri 1 ve Tablo 1 Şekil bakın. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Yüzey kombinasyonu </td><td> 1 ml AP tamponu ekle </td><td> Concentration [ug / ml] </td><td> AP tamponu </td><td> Renk </td><td> Sinyal hassasiyeti </td></tr><tr><td> BCIP NBT </td><td> 3.5 ul 4.5 ul </td><td> 175 337,5 </td><td> SB9.5 </td><td> mor </td><td> +++ </td></tr><tr><td> MAG INT </td><td> 5 ul 5 ul </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> sarı </td><td> + </td></tr><tr><td> BCIP / INT stok solüsyonu </td><td> 7,5 ul </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> sarı </td><td> + </td></tr><tr><td> Fast Blue NAMP </td><td> 5 ul 5 ul </td><td> 250 250 </td><td> SB8.2 </td><td> mavi </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Fast Blue NABP </td><td> 20 ul 10 ul </td><td> 1000 500 </td><td> SB8.2 </td><td> menekşe </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Fast Blue NAGP </td><td> 10 ul 10 ul </td><td> 500 500 </td><td> TT8.2 </td><td> yeşil </td><td> + </td></tr><tr><td> Hızlı Kırmızı NAMP </td><td> 1 Tablet </td><td> 1000 400 </td><td> TT8.2 </td><td> kırmızı </td><td> ++ </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Yüzey kombinasyonları Kısaltmalar: +++, kuvvetli;. ++, Ortam; + Zayıf NBT, 4-nitro-blue-tetrazolyum klorür; BCIP 5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat; INT, 2- (4-iyodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-tetrazolyum klorür; MAG, Macenta-Fos, 5-bromo-6-kloro-3-indolil-fosfat, NAMP, naftol-AS-MX-fosfat; NABP, Naphthol-AS-BI-fosfat; NAGP, Naftol AS--GR-fosfat; SB9.5, pH 9.5&#39;te boyama tamponu; SB8.2, pH 8.2 de boyama tamponu; TT8.2, pH 8.2 Tris-Tween tampon.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

multi-target-chromogenic-whole-mount-situ-hybridization-for-comparing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

11.4K Görüntüleme.  Stockholm University.  Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar. 

Video: Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Genetik

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Gelişim Biyolojisi

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Uygulamalarda Kantitatif Karşılaştırılması Cis</emTransgenik>-Regulatory Element (CRE) Etkinlikler Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler