Name: multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos
Uploaded: 2016-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors' work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).

1. A marcação de sondas de ARN por transcrição in vitro <ol><li> Montar reacção de transcrição in vitro num microtubo de 1,5 mL sob RNase condições: 10,5 ul tratada com DEPC H2O, 4,0 mL de 5x tampão de transcrição, 1,0 ul (1 ug) linearizado, ADN molde purificada tratada com DEPC H2O, 1,3 ul de mistura de NTP, 0,7 ul marcado com hapteno UTP, 0,5 ul de inibidor de RNA RiboLock, 2,0 ul de ARN-polimerase. Nota: O volume final da reacção é de 20 uL. </li><li> Dependendo da sequência de promotor de T7 a utilização do modelo, T3 ou SP6 RNA polimerase para a transcrição in vitro (ver referência 17). </li><li> Escolha digoxigenina-11-UTP, biotina-16-UTP, ou fluoresceína-12-UTP como etiqueta para a sonda de ARN. Para mais detalhes, veja a discussão do hapteno- rótulos e concentrações de sonda na discussão. </li><li> Misture reação de transcrição e girar para baixo em breve. </li><li> Vamos transcreverdurante 3 h a 37 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de ARNase isenta de ADNase I à reacção de transcrição para a remoção de ADN molde, misturar bem e incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Ajustar com tratada com DEPC H2O para o volume de amostra de 200 uL. </li><li> Adiciona-se 100 ul (0,5 vol) de acetato de amónio 7,5 M e 600 ul (3 vol) de etanol para precipitar sonda de RNA etiquetada. Incubar durante 30 min à TA. <ol><li> Não use etanol gelado, pois isso pode levar à precipitação indesejada de nucleótidos não incorporados. </li></ol></li><li> Girar o ARN transcrito numa centrífuga de temperatura controlada a velocidade máxima (20.800 x g) durante 30 min a 20 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Lava-se a pelete resultante com etanol a 70% à TA e centrifugar a 20.800 xg durante 10 min a 20 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ter cuidado para não aspirar acidentalmente o sedimento solto. Vamos ar sedimento seco no microtubo com a tampa aberta por alguns minutos à temperatura ambiente. </li><li> Disresolver o sedimento obtido em 100 ul de tratada com DEPC H2O </li><li> Adicionar 300 ul de tampão de pré-hibridação (50% vol / vol de formamida desionizada, 5x SSC, 50 ug / ml de heparina de sódio de sal, 0,1% v / v de Tween-20, 5 mg / ml torula ARN) e armazenar a -20 ° C . As sondas podem ser armazenadas a longo prazo a -20 ° C. Nota: Para um primeiro teste do diluído sonda 3 ul sonda de RNA marcado com hapteno recentemente transcrito em tampão de hibridação ul 100 para obter a concentração final para o experimento DESEJO. </li></ol> 2. Processamento das Amostras Embrião Usando inserções Nota: A utilização microtubos ou placas multi-bem para o processamento de embriões através das diferentes etapas de incubação assume o risco de perder quantidades significativas de embriões por aspiração-los acidentalmente durante a troca de soluções. Para evitar esta perda, pode ser útil utilizar cestos (tais como inserções NetWell) para o transporte de amostras através do procedimento do embrião. Estes são em poliestirenoserts com uma malha de poliéster na parte inferior (figura 2A), em que os embriões descansar durante o processamento. <ol><li> Para o processamento de embriões no procedimento desejar, montar as inserções em uma placa de 12 poços (Figura 2B) e adicionar 2 ml da solução apropriada a cada poço. </li><li> Pipetar os embriões para as inserções usando uma ponta azul. Certifique-se que todos os embriões são imersos em líquido. </li><li> Quando o tempo de incubação é superior a colocação das inserções contendo embriões noutro placa de 12 poços, a qual é preenchida com a solução para o passo seguinte. <ol><li> Use transportadoras e alças (Figura 2C) para transferir até 12 amostras de cada vez de uma solução para outra (Figura 2D). Nota: Para reduzir os volumes necessários, use 2,0 ml microtubos para as etapas de pré-hibridação / hibridação (veja o passo 4.1) e placas de 24 poços para as reacções de coloração (Passo 6.2). As reacções de hibridação e de coloração são realizadas em volumes de 1001; L e 400 ul, respectivamente. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de embriões para Hibridização <ol><li> Recolha, dechorionate, corrigir e devitellinize embriões utilizando procedimentos padrão 14,18. Os embriões são preparados rotineiramente armazenados em metanol a -20 ° C. </li><li> Embriões de transferência a ser utilizado para a hibridação in situ para a TA e distribuir o meio das inserções de uma placa de 12 poços preenchidos com 2 ml de metanol por poço. </li><li> Rehidratar embriões através de uma série decrescente de metanol à RT. Incubar embriões de cada vez durante 3 min em: (i) 75% de metanol em 1x PBS (ii) 50% de metanol em 1x PBS, 0,1% de Tween-20 (iii) 25% de metanol em 1x PBS, 0,1% de Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% de Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% de Tween-20. </li><li> Pré-corrigir os embriões em 4% de paraformaldeído em PBS 1x durante 20 min à TA. </li><li> Remover o fixador por 4 lavagens durante 3 min em PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à TA. Enquanto isso descongelar e preparar proteinase K e soluções de glicina trabalhando. </li><li&gt; Embriões permeabilizar em proteinase K fresca (10 ug / ml a 50 ug / ml) em PBS 1X, 0,1% de Tween-20 durante 3 min à TA. Nota: O tratamento com proteinase K é equilibrado com a força de fixação do embrião. Por exemplo, se o passo de pré-fixação (3.4) é omitido, o tratamento mais suave proteinase K pode ser aplicada. </li><li> Parar a reacção por duas lavagens de 1 min em 2 mg / ml de glicina em PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à TA. </li><li> Pós-corrigir os embriões em 4% de paraformaldeído em PBS 1x durante 20 min à TA. </li><li> Subsequentemente, remover paraformaldeído fixador por lavagem quatro vezes durante 3 min em PBS 1X, 0,1% de Tween-20 à TA. </li><li> Transferência de embriões pós-fixadas de pré-hibridação buffer. Armazenar embriões em tampão de pré-hibridação a 20 ° C ou directamente efectuar a hibridação de sondas. </li></ol> 4. A hibridação de sondas <ol><li> Transferência de embriões armazenados a -20 ° C em tampão de pré-hibridação para a TA. Distribuir embriões em tampão de pré-hibridação em 2,0 ml microtubes. </li><li> Durante 30 min, no mínimo, amostras de pré-embrião hibridar a 65 ° C em tampão de pré-hibridação. Nota: Para pré-hibridação e hibridação passos banho de água é usado. Durante a pré-hibridação que haja tempo para se preparar a mistura de sonda através da combinação de até três sondas de ARN anti-sentido, cada um específico para um transcrito do gene diferentes e marcadas com um hapteno diferente. </li><li> Para se obter a mistura de sonda, adicionar quantidades em conjunto apropriadas (usualmente entre 1 ul a 6 ul) de cada anti-sentido sonda de ARN desejado original é marcado com hapteno em tampão de hibridação de 100 uL (50% vol / vol de formamida desionizada, 5x SSC, 50 ug / ml sal de sódio de heparina, 0,1% v / v de Tween-20, 5 mg / ml de ARN torula, 5% p / v de sulfato de dextrano). Nota: A adição de sulfato de dextrano é opcional. </li><li> Desnaturar a sonda de ARN anti-sentido mistura num bloco de calor a 80 ° C durante 5 min. Subsequentemente transferir a mistura de sonda desnaturada directamente a 65 ° C. </li><li> Remover a maior parte da pré-hibridaçãotampão das amostras de embriões e adicione a mistura de sonda desnaturada. </li><li> Deixe as amostras de embrião de hibridizar para sondar mistura O / N a 65 ° C. Nota: As temperaturas variam entre 55 ° C e 65 ° C são rotineiramente usadas para hibridação, pré e pós-hibridação passos. Hibridação a 65 ° C proporciona as condições mais severas e é recomendado no caso de problemas de fundo quando se utiliza temperaturas mais baixas. Se não há problemas de fundo, hibridação a 55 ° C é recomendável, o qual proporciona a vantagem da potência do sinal aumentada e melhorada a integridade do embrião. </li><li> Na manhã seguinte, primeiro transferir as soluções de lavagem de severidade a 65 ° C, para assegurar que eles são aquecidos até à temperatura correcta no tempo. </li><li> Transferência de mistura de sondas de hibridação a partir de embriões com os microtubos de 2,0 ml em inserções de uma placa de 12 poços contendo 2 ml de tampão de lavagem de hibridação pré-aquecida (50% de formamida em 2 x SSC, 0,1% de Tween-20). Colocar a placa de 12 poços contendo o inbryo amostras em um forno e incubar durante 20 min a 65 ° C. </li><li> Embryo Transfer amostras a 2 ml de tampão de lavagem nova hibridação e incubar durante 20 min a 65 ° C. Repita este passo mais uma vez. </li><li> Remover o excesso de sonda por lavagens de 20 min a 65 ° C, uma vez em 2 x SSC, 0,1% três vezes em 0,2 × SSC Tween-20 e 0,1% de Tween-20. </li><li> Transferir as amostras de embrião de 1x PBS, 0,1% de Tween-20 à TA. </li><li> Incubar os embriões em tampão de bloqueio (8% de soro de carneiro em PBS 1X, 0,1% de Tween-20) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. </li></ol> 5. Detecção de Anticorpos As sondas de hapteno-rotulados Nota: Em contraste com a hibridação simultânea de todas as três sondas marcadas de forma diferente, cada uma das sondas é detectada uma após a outra em rodadas separadas de incubação do anticorpo e de coloração. Portanto, em cada ciclo de detecção é apenas um anticorpo utilizado (tanto anti-digoxigenina-AP ou anti-fluoresceína-AP ou anti-biotina-AP). <ol><li> Escolha entre STEP5.1.1 a 5.1.3 e prosseguir com a preparação da diluição do anticorpo apropriado de acordo com o rótulo hapteno que está a ser detectado. Nota: Para a detecção sequencial das sondas marcadas de forma diferente, outro anti-hapteno-anticorpo é aplicada em cada ciclo de detecção. <ol><li> Para a detecção de uma sonda marcada com fluoresceína diluir anti-fluoresceína-AP conjuga 1: 4.000 em tampão de bloqueio. </li><li> Para a detecção de uma sonda marcada com digoxigenina diluir anti-digoxigenina-AP conjuga 1: 4.000 em tampão de bloqueio. </li><li> Para a detecção de uma sonda marcada com biotina preparar uma solução de conjugado de anti-biotina-AP a uma diluição de 1: 4.000 em tampão de bloqueio. </li></ol></li><li> Incubar em embriões a solução anti-hapteno-AP seleccionado durante 3 a 4 horas à temperatura ambiente. Alternativamente, incubar O / N a 4 ° C. Não aplique os três anticorpos simultaneamente. </li><li> A fim de remover anticorpo não ligado lavar os embriões com 1x PBS, 0,1% de Tween-20 por 4 vezes 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Para alterar sistemas tampão erah duas vezes 15 min à temperatura ambiente em TNT (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 0,1 M, 0,1% de Tween-20). </li></ol> 6. fosfatase alcalina Chromogenic Coloração <ol><li> Posteriormente a detecção de anticorpos escolher entre PASSO 6.1.1 a 6.1.4 e prosseguir com um dos fosfatase alcalina reações de coloração cromogénicos para obter o sinal de cor desejada (ver Tabela 1). Para cada ronda de detecção de uma reacção de substrato cromogénico diferente é aplicada para realçar cada padrão de transcrição em outra cor. <ol><li> Fast Red Coloração <ol><li> Lavar os embriões duas vezes durante 15 min em TT8.2 (0,1 M de Tris-HCl pH 8,2, 0,1% de Tween-20). </li><li> Enquanto lavava embriões, preparar a solução de coloração vermelho rápido do Fast Red TR / NAMP fosfatase alcalina Substrato Tablets Set. </li><li> Dissolver um comprimido tampão a partir do comprimido definida em 1 ml de água destilada e misturar em vortex para obter 0,1 M Tris-HCl pH 8,2. </li><li> Largar um Fast Red TR / NAMP tablet no preparado Tris tampão e dissolver em vortex para obter a solução de coloração vermelho rápido. </li><li> Limpar solução de coloração vermelho rápido de partículas não-dissolvido através de um filtro de seringa de 0,2 um. </li></ol></li><li> A coloração azul rápido <ol><li> Lavar duas vezes embriões durante 15 min em tampão de coloração SB8.2 fresco (0,1 M de Tris-HCl pH 8,2, 0,1 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2, 0,1% de Tween-20). </li><li> Enquanto lavar os embriões, preparar a solução de coloração azul rápido de 50 mg / ml de Fast Blue BB (em DMF) e 50 mg / ml de fosfato de naftol (em DMSO) soluções de estoque. </li><li> Recentemente preparar uma solução de azul rápido em BB 0,5 mg / ml em SB8.2. </li><li> Recentemente preparar uma solução de fosfato de naftol separado a 0,5 mg / ml em SB8.2. </li><li> Adicionar gota a gota, a solução preparada de fosfato de naftol na solução azul BB rápido sob agitação constante, com um vórtice. A concentração final resultante de trabalho é de 0,25 mg / ml para ambos os componentes do substrato. Nota: Diferentes azul rápido phosp / naftolcombinações de ódio resultar em diferentes tons de cor (ver Tabela 1). </li></ol></li><li> BCIP / NBT Coloração <ol><li> Lavar duas vezes embriões durante 15 min em tampão de coloração SB9.5 fresco (0,1 M de Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2, 0,1% de Tween-20). </li><li> Para um sinal cromogénico purpleblue, preparar a solução de coloração recém-BCIP / NBT por adição de 1 ul de levamisol, 3,5 uL e 4,5 uL BCIP NBT por ml de tampão de coloração SB9.5 e misturar bem. </li></ol></li><li> INT Coloração <ol><li> Lavar os embriões duas vezes durante 15 min em tampão de coloração SB9.5 fresco. </li><li> Para um sinal cromogénico yellowbrown, preparar a solução de coloração recém-INT pela adição de 1 ul de levamisol, 5 ul Magenta-Phos e 5 INT ul por ml de tampão de coloração SB9.5 e misturar bem. Nota: Como alternativa, use 7,5 ul / ml BCIP / INT solução de coloração ready-to-use. </li></ol></li></ol></li><li> Para as amostras de reacção de transferência de embriões coloraçãopara uma placa de 24 poços. Incubar em cada amostra de 400 ul da solução de coloração escolhidos no escuro. </li><li> Monitorar ocasionalmente sinalizar desenvolvimento sob um microscópio estereoscópico. Parar a reacção de coloração, quando a intensidade do sinal desejado é obtido e antes do sinal de fundo significativo é observado. </li><li> Para parar a reacção cromogénica, transferir embriões corados em inserções de uma placa de 12 poços contendo 2 ml por poço TNT. Lavar os embriões corados duas vezes em TNT. </li><li> Lavar os embriões duas vezes durante 10 minutos em 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 à TA para remover substrato residual. </li></ol> 7. Remoção de fosfatase alcalina / anticorpo Inactivação <ol><li> Remover o anticorpo e inactivar a fosfatase alcalina por incubação em 2 ml de solução de paragem de baixo pH (glicina 0,1 M-HCl a pH 2,2, 0,1% de Tween-20) durante 10 min à TA. </li><li> Lavar durante 1 minuto com 2 ml de 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 à TA. </li><li> Lavar 3 vezes durante 3 minutos em 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 à TA. </li></ol> 8. Segunda Rodada de Detecção <ol><li> Para detectar o padrão de distribuição de um segundo transcrito efectuar a detecção de sondas marcadas anticorpo-hapteno (PASSO 5.1 a 5.4), utilizando conjugados de anticorpo-AP dirigidas contra a segunda etiqueta hapteno. </li><li> Realizar fosfatase alcalina cromogénico coloração (PASSO 6.1 a 6.5) que aplica uma combinação de substrato que produz uma cor contrastante com o utilizado na primeira fase de detecção (por cores disponíveis ver Tabela 1). </li><li> Remover segundo conjugado anticorpo-AP como descrito no passo 7.1 a 7,3. </li></ol> 9. Terceira Rodada de Detecção <ol><li> A fim de detectar o padrão de distribuição de um terceiro transcrição, prosseguir com a detecção de sondas marcadas anticorpo-hapteno (PASSO 5.1 a 5.4), utilizando anticorpo-AP os conjugados específicos para o hapteno terceira etiqueta. </li><li> Realizar fosfatase alcalina cromogénico coloração (PASSO 6.1 para 6.5) aplicação de uma combinação de substrato que não foi apdobraram nas rodadas anteriores de detecção. Escolha uma reacção cromogénica que produz uma cor precipitar fácil distinguir dos das duas rondas de detecção anteriores (para escolha de cor ver Tabela 1). </li></ol> 10. Montagem e imagem <ol><li> Transferir embriões corados adequadamente a 30% de glicerol em PBS e incubar até embriões são totalmente embebido na solução de glicerol. Eles são bem equilibrado quando eles vão para o fundo. </li><li> Embriões de transferência a 70% de glicerol em H2O e deixar equilibrar à RT. Os embriões corados podem ser armazenados em glicerol a 70% a 4 ° C. </li><li> Para a montagem, pipeta embriões em uma gota de glicerol 70% corado sobre um objecto corrediça e sem tocar nos separadores colados à corrediça (Figura 3). Aplique a lamela. </li><li> Ver embriões montado sob um microscópio de dissecação. Mover a lâmina de cobertura aplicada, de modo que os embriões rodar para a orientação desejada. </li><li> Observe corretamenteembriões orientados em alta resolução (20x, 40x objetivos) sob um microscópio composto com interferência diferencial Contrast óptica. </li><li> Capturar imagens com uma câmera digital a cores e economizar no dispositivo de armazenamento digital. </li></ol>

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J., Johnson, G. D., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase-fast+red,+a+new+fluorescent+label.+Application+in+double+labelling+for+cell+cycle+analysis.">Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis.</a> J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alkaline+phosphatase-mediated+azo+dye+staining+for+dual+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish.">Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A hibridação in situ (ISH) marcados radioactivamente com sondas de ácidos nucleicos é frequentemente utilizado para detectar a localização do RNA em secções de tecido. O método ISH radioactivos, no entanto, é demorado, menos sensíveis, e não permite a apreciação dos padrões de distribuição transcrição completa em montagens inteiras. Em contraste, o método de MC-Wish aqui descrito permite a comparação directa dos vários domínios de expressão de gene em cores contrastantes dentro de embriões intactos. MC-Wish tem a vantagem de contexto histológico é imediatamente evidente e visualizadas por microscopia de campo claro simplesmente padrão. Isto proporciona a possibilidade de relacionar domínios de expressão de genes topograficamente uns aos outros com grande precisão e definir locais de expressão única e que se sobrepõem, de uma forma rápida e fiável. Por outro lado, a ISH multiplexado fluorescente (FISH) é mais poderoso no que diz respeito à sensibilidade e resolução e é, de preferência utilizado, se celular ou até mesmo re sub-celularé necessária uma solução de detecção de ARNm. O largo espectro de transcritos que foi mapeado por MC-Wish sugere que virtualmente qualquer transcrição podem ser analisados ​​não só em embriões, mas também em tecidos larvais e adultas e em outras espécies de Drosophila. Na verdade, o procedimento descrito detalhados aqui para Drosophila, funciona da mesma forma eficiente com embriões de peixe-zebra 11,16,22. Além disso, o método de MC-desejarem podem ser adaptadas a uma ampla variedade de vertebrados e invertebrados e embriões espécime de tecido. Hapteno- rótulos e concentrações de sonda Nós usam rotineiramente fluoresceína, digoxigenina, biotina e como etiquetas hapteno de sondas de RNA. Além disso, as sondas marcadas com dinitrofenol pode ser aplicada, que foram introduzidas em experiências de peixe-zebra DESEJO 23-25. Sondas marcadas com fluoresceína exibir uma sensibilidade menor em comparação com os outros rótulos hapteno, de modo a que a fluoresceína é melhor usado fou detecção de transcritos abundantes. Cada sonda recentemente transcrito é testado pela primeira vez em um único experimento DESEJO, onde seu desempenho é avaliado, utilizando BCIP / NBT ou Fast Red como substrato. A concentração da sonda é considerado como ideal quando um sinal forte sem fundo de desenvolvimento é alcançado dentro de alguns minutos a horas. Para certificar-se que os domínios de interesse de expressão foram detectados em toda a sua extensão pelo MC-Wish, é essencial para visualizar cada padrão de transcrição por experimentos DESEJO de rótulo único, usando a combinação de substrato mais sensível, BCIP / NBT. Isso garante que os domínios de expressão fracos não são negligenciados na experiência multi-alvo. Para compensar a menor sensibilidade das outras combinações de substrato é essencial utilizar duplicou (a) as concentrações triplicadas de sondas, em comparação com BCIP / NBT coloração convencional. Baixa inativação pH A etapa de inactivação de pH baixo pode levar adesintegração parcial dos híbridos sonda de ARNm ARN / sentido anti-sentido marcada com hapteno, resultando em reduzida a detecção do sinal na segunda e terceira rondas de coloração. Para minimizar a perda de sensibilidade, os passos de inactivação são tão curto quanto possível. Nós experimentado que um tempo de incubação de 10 min a pH baixo é suficiente para a eliminação da actividade do AP-. As lavagens rápidas subsequentes em grandes volumes de diluição rápida de assegurar não ligados conjugados anticorpo-AP e evitar a re-ligação às sondas haptenizada. Procedimentos alternativos incluem fixação paraformaldeído e inactivação pelo calor. No entanto, alguns dos precipitados de cor não são estáveis ​​ao calor e paraformaldeído fixação pode não ser suficiente para a inactivação completa de AP. Inactivação incompleta do primeiro aplicada conjugado anticorpo-AP pode levar a re-visualização do padrão de ARNm no seguimento da detecção levando rodada para sobreposição de falsos positivos na expressão com a segunda espécie de ARNm a ser detectado. Portanto, numa experiência de controlo the os embriões são divididos em duas fracções após inactivação do primeiro aplicada conjugado anticorpo-AP. O segundo conjugado anticorpo-AP é omitida a partir da fracção de controlo e não deve produzir um sinal na segunda reacção de cor. No entanto, se a segunda reacção de cor gera um padrão de distribuição de sinal correspondente para o primeiro, em seguida, o procedimento de inactivação não foi eficaz. Neste caso, o tempo de incubação em solução de paragem baixo pH deve ser prolongada para a experiência seguinte. Pedidos de aplicação substrato AP Uma vez que a sensibilidade diminui com cada ciclo subsequente de detecção, é aconselhável para detectar ARNm menos abundantes antes transcritos mais abundante. Além disso, as combinações de substrato Fast Blue Fast Red e são significativamente menos sensível do que o purpleblue BCIP / NBT mancha, de modo que os corantes são preferivelmente aplicados rápida na primeira fase de coloração para a detecção do transcrito expresso mais forte. Isto também hcomo a vantagem de que subsequente BCIP / NBT coloração pode ser monitorado e parado no tempo antes do sinal purpleblue fica muito escuro em relação aos corantes rápidos leves. Assim, em um experimento de duas cores padrão, primeiro o mRNA expressa mais forte é detectado pelo Fast Red e segundo o mais fraco por BCIP / NBT. Como uma alternativa para os corantes amarelos rápidos as combinações dos substratos INT podem ser aplicados, que, contudo, produzir precipitados que se tornam difundem depois de algum tempo. Portanto BCIP / INT é aplicado exclusivamente na última rodada coloração. Consequentemente, em um experimento de três cores muitas vezes usamos primeiro Fast Red, segundo BCIP / NBT (azul ou rápido) e uma terceira combinação substrato INT. Note-se que é aconselhável para fotografar embriões corados tão rapidamente quanto possível quando se aplica a INT. Detecção fluorescente de corantes azo Pode ser, por vezes, difícil de reconhecer padrões de expressão que se sobrepõem quando um precipitado cor mais escura é sombreamento um mais leve. Fou exemplo, um precipitado BCIP / NBT fortemente desenvolvido pode mascarar sinais de corante rápidos leves. Uma forma de contornar este problema é para capturar imagens imediatamente após cada mancha e remover o precipitado cor aplicada antes da próxima ronda de detecção. Neste caso, corante azo solúvel em álcool (Fast Red) e INT precipitados são removidos por lavagens de etanol após o primeiro e segundo ciclos de detecção, respectivamente, coloração e BCIP / NBT como é aplicado o último substrato AP-26. Outra possibilidade é a de tirar partido das propriedades fluorescentes dos corantes azo. Fast Red pode ser visualizada usando rodamina filtro 27 define, enquanto Fast Blue pode ser observada tanto com filtros vermelhos-28,29. Comparação ou sobreposição de imagens fluorescentes cromogénicos e pode revelar o local de co-distribution.Using esta abordagem, BCIP / NBT de desenvolvimento de sinal tem de ser parado no tempo, de modo que ela não se torne demasiado densa e extinguir o sinal de fluorescência do corante azo produto da reacção.

A hibridação in situ (ISH) é o método padrão para a detecção e localização de transcritos de ARN em um contexto morfológica, dentro das células, tecidos e organismos 1. Os sinais produzidos pelo procedimento ISH são normalmente visualizados por sistemas de detecção radioactivos, fluorescentes e cromogénicos. Nos últimos anos os avanços tecnológicos significativos na ISH fluorescente (FISH) 2 conduziu a uma melhoria dramática sensibilidade e resolução, permitindo a detecção e quantificação da expressão de RNA em células individuais e níveis sub-celulares e visualização ARN até moléculas individuais 3,4 .Enquanto métodos sofisticados FISH de molécula única são utilizadas para aplicações mais especializadas, ISH cromogénico é difundido como um ARN de rotina no método de detecção in situ em pesquisa e diagnóstico clínico. Para a detecção cromogénica reacções de precipitação enzima são utilizados, o que gera produtos visíveis em cores contrastantes nos locais5 de hibridação. Isto tem a vantagem de que a visualização de ARN pode ser combinado com manchas histológico de rotina e contexto morfológica é imediatamente evidente por microscopia de campo claro padrão. Além disso, numerosos dos substratos de cor aplicadas produzir precipitados, que são estáveis ​​em meios de montagem orgânicos e / ou aquosos, de modo que as preparações de amostra permanentes podem ser obtidos 5. Em Drosophila, os protocolos ISH iniciais aplicadas sondas marcadas com radioisótopos para a detecção de transcrição em material seccionado 6. Embora seja difícil de reconstituir a partir de secções de tecido padrões de transcrição completa de embriões inteiros ou sistemas de órgãos, a aplicação de procedimentos ISH cromogénicos com sondas marcadas não-radioactivamente torna possível detectar globalmente distribuições de ARN em montagens inteiras-7. Embora existam muitas variações de ISH cromogénico, em todo típico de montagem de hibridização in situ (desejo) protocolos hybsondas marcadas com hapteno ridized são detectados por anticorpos anti-hapteno conjugado com uma enzima repórter transcritos de ARNm e são visualizados por um cromogénio precipitante. A paleta de cores diferentes de precipitados produzidos pela repórter enzimas de fosfatase alcalina (AP), a peroxidase de rábano (POD), e beta-galactosidase (GAL) permite a detecção de alvos múltiplos distintiva em uma e a mesma amostra de 8-14. No entanto, a actividade enzimática POD dura apenas durante um período de tempo limitado e a reacção colorimétrica GAL é um pouco menos sensíveis, de modo que sem amplificação adicional (tiramida) de sinal 15 a detecção de transcritos menos abundantes pode ser um desafio com estas enzimas. Em contraste, a atividade de resistência da AP permite o volume de negócios substrato de longa duração e alta relação sinal-ruído. Portanto, a detecção sequencial utilizando enzima repórter da AP com substratos de cores diferentes tem sido bem sucedida na eficaz edetecção distintivo de até três transcritos diferentes em embriões únicos 10-12,16. Para este multi-alvo DESEJOS cromogénico (MC-Wish) método (Figura 1) 14, sondas de ARN anti-sentido marcadas são geradas por transcrição in vitro e marcados com uma das etiquetas de hapteno-disponíveis. Os embriões são formaldeído e permeabilizadas por fixo metanol e o tratamento com proteinase K de digestão. A hibridação de embriões é realizado simultaneamente com até três sondas de ARN marcadas de forma diferente anti-sentido específicos para cada um gene diferente. Após a remoção da sonda não ligada por lavagens de rigor cada rótulo hapteno é visualizado em uma rodada separada de detecção. Um único ciclo de detecção é constituído por incubação de embriões com um anticorpo anti-hapteno acoplado a AP e visualização de ARN por aplicação de um AP-substrato que produz um precipitado de cor localizada estável. Após a detecção de anticorpos e de coloração, o conju aplicado anticorpo-APgate é removido por uma lavagem a baixas pH. Em experiências multicolor, cada ciclo de detecção utiliza um anticorpo dirigido contra um hapteno rótulo diferente e cada padrão de transcrição é visualizado por um substrato de cor diferente (Tabela 1). Os embriões são montadas em glicerol e fotografadas com um microscópio composto de alta resolução utilizando contraste de interferência diferencial (DIC) óptica.

<table><tbody><tr><td>Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-free&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTP Set</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-12-UTP</td><td>Roche</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolute&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium citrate</td><td>Scharlau</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>deionized formamide</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>RNA type VI from torula yeast</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-biotin-AP Fab fragments&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody</td><td>Vector laboratories</td><td>MB-3100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Scharlau</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Applichem</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red tablet set</td><td>Sigma</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>Fast Blue BB salt</td><td>Sigma</td><td>F3378</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-MX-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N5000</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-GR-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N3625</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-BI-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N2250</td><td></td></tr><tr><td>Magenta-Phos</td><td>Biosynth</td><td>B7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>INT/BCIP solution</td><td>Roche</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 86-88%</td><td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>Universal incubator</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Grant</td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&amp;nbsp; inserts 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Netwell carrier kit 15 mm</td><td>Corning</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos

Para analisar as redes activas reguladoras de genes durante o desenvolvimento embrionário e organogénese é essencial para definir com precisão a forma como os diferentes genes são expressos em relação espacial um para o outro in situ. Multi-alvo cromogï¿½ico todo-mount hibridização in situ (MC-DESEJO) facilita muito a comparação instantânea de padrões de expressão gênica, uma vez que permite a visualização distintivo da espécie de ARNm diferentes em cores contrastantes no mesmo espécime de amostra. Isso proporciona a possibilidade de se relacionar domínios de expressão gênica topograficamente uns aos outros com alta precisão e definir locais de expressão únicos e sobrepostos. No protocolo apresentado, descrevemos um procedimento MC-Wish para comparar os padrões de expressão de mRNA de diferentes genes em embriões de Drosophila. Até três sondas de ARN, cada um específico para um outro gene e marcado por um hapteno diferente, são simultaneamente hibridados com as amostras de embriões e subsequentemente detectado por alcaliNE fosfatase baseada em imuno-histoquímica colorimétrico. O procedimento descrito é detalhado aqui para Drosophila, mas funciona igualmente bem com embriões de peixe-zebra.

O protocolo descrito permite a visualização simultânea de vários padrões de transcritos em diferentes cores. MC-Wish proporciona a vantagem de comparar directamente os padrões de expressão de genes diferentes no mesmo embrião. Como exemplo, os padrões de expressão de spiracles vazias (EMS) 19, fushi Tarazu (FTZ) 20 e desleixado emparelhado 1 (slp1) 21 estão diretamente comparados em Drosophila melanogaster blastoderme embriões em estágio e visualizados em uma variedade de tons de cor (Figura 4) . Diferentes combinações de substrato de AP estão disponíveis para obter um painel de cor contrastante precipitados (Tabela 1). O precipitado cor vermelha produzida por Fast Red e o precipitado roxo produzido por BCIP / NBT pode ser facilmente distinguidos e, portanto, são utilizados mais comumLY em experiências de duas cores (Figura 4A). No entanto, a mancha BCIP / NBT pode rapidamente se transformar em uma cor bastante escura, para que a cor vermelha rápido é disfarçado em caso de co-distribuição parcial das transcrições. Por conseguinte, a aplicação de Fast Blue pode ser vantajoso, que gera produtos verdes, azuis e violetas em combinação com NAMP, NAGP e NABP, respectivamente (Tabela 1). A combinação de azul rápido com NAMP dá uma cor azul clara que é facilmente perceptível a partir do produto Red rápido em domínios de expressão adjacentes ou sobrepostos como mostrado aqui para ems e locais de expressão slp1 visualizadas em vermelho e azul, respectivamente (Figura 4B). A combinação azul rápido NAGP proporciona um forte contraste semelhante ao rápido mancha vermelha, de modo que o domínio EMS verde é claramente distinto do local de expressão slp1 vermelho (Figura 4C). No entanto, se ems e locais de expressão é DE slp1gidos por azul rápido NABP e Fast Red, respectivamente, o violeta resultante e precipitados de cor vermelha são menos perceptíveis (Figura 4D). Como mencionado acima, Fast Red e azul rápido NAGP são fáceis de distinguir, como mostrado por slp1 e FTZ expressão em vermelho e verde, respectivamente (Figura 4D). MagentaPhos em combinação com INT produz um precipitado amarelo, o qual é usado para revelar a expressão de segmentar FTZ (Figura 4C, E). O precipitado de cor amarela gera um bom contraste para os substratos de cor azul tal como exemplificado pela detecção de slp1 e FTZ com azul rápido NAMP e MAG / INT, respectivamente (Figura 4E). No entanto, o precipitado amarelo é menos fácil discernível a partir do produto vermelho rápido. O domínio expressão manchado amarelo do ems pode ser mal disti<html> nguished da expressão rostral de slp1 mostrado em vermelho (Figura 4F). Portanto, a combinação dos substratos de cor tem de ser cuidadosamente escolhidos para cada experimento. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma do MC-Wish. Para visualização multicolorida de três padrões de transcrição exclusivos, escolher entre diferentes conjugados anticorpo-AP e combinações de substrato de cor em cada ciclo de detecção. Abreviaturas: AP, da fosfatase alcalina; BIO, biotina; DIG, digoxigenina; FLUO, fluoresceína. Para outras abreviaturas ver lendas a Figura 4 e Tabela 1. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> s / ftp_upload / 53.830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Inserções como transportadores embrião. (A) insere montados na parte inferior com membranas de poliéster de 15 mm de diâmetro e 74 uM de tamanho de malha são utilizados como veículos de embriões de Drosophila. (B) As pastilhas são montadas em placas de 12 poços, os quais funcionam como reservatórios para os tabuleiros de várias soluções. (C) As transportadoras disponíveis e alças permitir o processamento de (D) 12 inserções / amostras de embriões simultaneamente. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> Figura 3. Montagem de embriões corados. Os embriões são montados em uma gota de glicerol 70% entre duas pilhas de lamelas, que funcionam como espaçadores. Movimento suave do appmentiu lamela grande ajuda para girar os embriões montados na orientação desejada para observação e fotografia. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> Figura 4. Visualização Multicolor de transcritos de ARNm em embriões de Drosophila. Exemplos de experiências MC-Wish em embriões de Drosophila são mostrados a partir de vistas laterais. Os padrões de expressão de mRNA de spiracles vazias (EMS), fushi Tarazu (ZLC) e desleixado emparelhado 1 (slp1) são visualizados por diferentes combinações de substratos de cor AP, que são indicados em cada painel. Transcrições foram detectados por (A) FLUO ftz e ems DIG, ( <strong&gt; B) slp1 FLUO, ems BIO, e DIG ftz, (C) ems BIO, slp1 FLUO, e DIG ftz, (D) BIO ftz, slp1 FLUO, e ems DIG, (E) slp1 FLUO, ems DIG, e ftz BIO, (F) BIO ftz, slp1 FLUO, e ems DIG sondas marcadas. As sondas marcadas com hapteno foram immunohistochemically detectado um após o outro nas ordens listados. Abreviaturas: FB azuis rápido; FR, Fast tablet Vermelho. Para outras abreviaturas ver lendas a Figura 1 e Tabela 1. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Combinação de substrato </td><td> Adicionar 1 mL de tampão de AP </td><td> Concentração [ig / ml] </td><td> Tampão AP </td><td> Cor </td><td> Sensibilidade de sinal </td></tr><tr><td> BCIP NBT </td><td> 3,5 l 4,5 l </td><td> 175 337,5 </td><td> SB9.5 </td><td> roxo </td><td> +++ </td></tr><tr><td> MAG INT </td><td> 5 ul de 5 ul </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> amarelo </td><td> + </td></tr><tr><td> Solução estoque BCIP / INT </td><td> 7,5 ul </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> amarelo </td><td> + </td></tr><tr><td> Azul Rápido NAMP </td><td> 5 ul de 5 ul </td><td> 250 250 </td><td> SB8.2 </td><td> azul </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Azul Rápido NABP </td><td> 20 ul 10 ul </td><td> 1000 500 </td><td> SB8.2 </td><td> violeta </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Azul Rápido NAGP </td><td> 10 ul 10 ul </td><td> 500 500 </td><td> TT8.2 </td><td> verde </td><td> + </td></tr><tr><td> Fast Red NAMP </td><td> 1 comprimido </td><td> 1000 400 </td><td> TT8.2 </td><td> vermelho </td><td> ++ </td></tr></tbody></table> Tabela 1. combinações de substrato Abreviaturas: +++, forte;. ++, Médio; +, Fraco NBT, cloreto de 4-nitro-azul-tetrazólio; BCIP, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato; INT, 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-tetrazólio; MAG, Magenta-Phos, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-fosfato, NAMP, Naftol-AS-MX-fosfato; NABP, Naphthol-AS-BI-fosfato; NAGP, Naftol-AS-GR-fosfato; SB9.5, tampão de coloração, a pH 9,5; SB8.2, tampão de coloração, a pH 8,2; TT8.2, Tween-tampão Tris a pH 8,2.

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Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

11.4K visualizações.  Stockholm University.  Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor. 

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Genética

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Biologia do Desenvolvimento

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP), utilizando Drosophila Tecido

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount

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