Name: tissue characterization after a new disaggregation method for skin micro-grafts generation
Uploaded: 2016-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation at JoVE.com

Yazarlar flow sitometri analizi gerçekleştirmek çalışmaya katkıda bulunmak için teşekkürler Dr. Federica Zanzottera istiyoruz.

Etik deyimi: protokolün klinik uygulama hastanın deri otolog doku kullanımını gerektirir çünkü, in vitro karakterizasyonu hasadı, işlenmesi Milli Kuralları yönergeleri izleyerek Emilia Romagna Bölge Cilt Bankası homolog deri dokusu üzerinde klinik kullanımdan önce gerçekleştirildi ve nakli için dokular (2013 CNT) dağıtılması. Klinik Uygulama için 1. Bio-kompleks Yapı NOT: Bu protokol, klinik Rigeneracons (doku Topu) ve RiGenera Machine (doku Topu sistemi) (Şekil 1A) kullanımına dayanmaktadır. Doku Topu yaklaşık 50 mikronluk bir kesme altıgen bıçaklar ve filtreleme hücreleri ve hücre dışı matris bileşenleri tarafından sunulan bir ızgara ile dokuların küçük parçalar bozmak için mümkün insan dokularının biyolojik, tıbbi bozan bir. <ol><li> Bir bi aracılığıyla hastanın skinsamples toplayınOPSY delme (Şekil 1B) ve otolog mikro greft 6,7,9 elde etmek için her bir parça için tuzlu su çözeltisi 1 ml ilave parçalamak (veya adım 2.1). </li><li> Kollajen sünger mikro greft 1 ml koyun (Şekil 1C) toform biyo-kompleksleri klinik uygulama için kullanılacak. </li><li> Kültür, bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş atmosfer içinde 37 ° C &#39;de% 10 fetal inek serumu ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi içinde 6 ml mevcudiyetinde kolajen süngeri üzerine mikro greft bir 1 mi. </li><li> Kültür, 3 gün sonra, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile% 0.3 paraformaldehid ile biyo-kompleksleri düzeltin. numune üzerine doğrudan belirli bir dağıtıcı ile parafin dökün. 5 um kalınlığında bir mikrotom ile dilimleri elde edilir ve cam slayt doğrudan koydu. </li><li> 20 mi ksilen (ticari olarak temin - - m-ksilen (40 karışımı -% 65), p-ksilen (% 20), o-ksilen (20% 15 ihtiva eden, histolojik analizler için bir cam içinde 5 um&#39;lik parafin dilim daldırın ) ve ETHil benzen (6-20%) ve 3 dakika her biri için, tolüen, trimetil benzen, fenol, tiyofen, piridin ve hidrojen sülfid) izleri. </li><li> de-paraffinizing ve daha sonra deiyonize su (1 saat, 1 saat için% 80 etanol,% 70 etanol, 1 saat boyunca için 1 saat için% 100 etanol,% 95 etanol), etanol azalan sınıflarda dilimleri (% 100 ila% 70) daldırın ve bölümleri rehidrasyon. </li><li> 1 1 g / L Ematoxylin 2 ml - 1 - ile bölümleri Leke 2 dakika ve daha sonra herhangi bir Ematoxylin fazlası çıkarmak için su ile durulayın. </li><li> etanol% 70 ile karıştırılmış konsantrasyonunun% 1 Eosin Y alkolik çözelti, 5 dakika karıştırıldı ve su içinde seyreltildi - 4 bölümler Leke. </li><li> Her slayt bölümü için Eosin Y 2 ml ve akan musluk suyu altında durulayın - 1 kullanın. </li><li> Etanol sınıflarda artan bölümleri daldırın dayalı bir montaj mediumand 100X büyütme (Şekil 1D) bir ışık mikroskobu altında gözlemlemek bir 1 saat süreyle Ksilen içinde geçit, lamel sonra, nihayet ve (adım 1.6 bakınız). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Toplama, Ayrıştırma ve Doku Vitro Analizinde <ol><li> Bir dermatom kullanarak, sırasıyla 0,6 mm, 1 mm ya da 4 farklı çoklu organ ve / veya çok bagaj alanından kalınlığı 2 mm bağımsız cilt dokusu, papiller de-epidermized dermis (Ded) ya da retiküler dermis (dermis) almak hasat, işleme ve nakli için doku dağıtımını Milli Kuralları (CNT 2013) takip eden 40 ile 55 yıl arasında değişen bir aralıkta doku bağış. <ol><li> Yavaşça 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde bir çanak koyarak% 0.9 NaCI çözeltisi tüm örnekleri yıkayın. </li><li> 5 mm biyopsi yumruk kullanarak, deri dokusunun, Ded ve Dermisinde çapı muntazam ve ayrıştırma önce tüm doku örneklerinin tartmak örnekleri oluşturmak. </li><li> ayrıştırma için tuzlu su çözeltisi, 1.5 ml ilave doku bozucu deri dokusu, DED sırasında veya dermiş sekiz, üç ya da dört tip numuneler, yerleştirin. </li><li> farklı gerçekleştirinTüm doku örnekleri için ayrıştırma kat, Tablo 1 &#39;de gösterilen. </li><li> kontrol olarak bozulmamış doku örneklerinden elde edilen punch biyopsi bir muhabir numarasını kullanın. </li><li> Mekanik ayrıştırma sonra ayrı ayrı 12 plaka tek bir kuyuda her numune mikro greft ve yeri ihtiva eden tuz çözeltisi aspire. bozulmamış kontrol punch biyopsi için aynı protokolü gerçekleştirin. </li><li> Her bir örnek için,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde 1 ml ekleyin. </li><li> hemen hücre canlılığı değerlendirmek. her bir (sırasıyla deri dokusu, DED veya dermişi sekiz, üç ya da dört tek tip numuneler aynı anda ayrıştırma ile elde edilir), bir mikro-greft ihtiva eden 0.5 mg / MTT ml (3- [ihtiva eden ortam 1 ml ilave 4,5- dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolyum bromür) çözeltisi ve CO2 / hava% 5 bir atmosferde 37 ° C de 3 saat inkübe edilir. sağlam kontrolü için aynı protokol gerçekleştirmebiyopsi yumruk. </li><li> İnkübasyondan sonra, her MTT ihtiva eden ortam çıkarın ve 10 dakika süre ile, her bir numune, 1 ml dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin. </li><li> bir küvet içinde her bir örnek ve DMSO aktarın ve bir spektrofotometre kullanılarak 570 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) okunmuştur. 570 nm&#39;de absorbans oranı ve ayrıştırma daha önce kullanılan doku gram (gr) ağırlık hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması. bozulmamış kontrol punch biyopsi için aynı protokolü gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Mekanik ayrıştırma sonra, deri dokusu, tek bir vericinin aşınmıştır ve dermis örneklerinden türetilmiş mikro greft ihtiva eden tuzlu su çözeltisi aspire. <ol><li> 12 oyuklu bir plaka, tek bir oyuk ya da sırasıyla, hücre canlılığı testi ve morfolojik analiz için bir kültür şişesi içinde ayrı ayrı örnek yerleştirin. </li><li> % 5 CO2 / AI bir atmosferde 37 ° C &#39;de, 1 ml (12 çukurlu plaka) ya da 5 ml 1640 ortamında% 10 FCS ile takviye edilmiş RPMI (kültür şişesi) ile antibiyotik ilave kültür mikro greft24 saat ya da 7 gün süre ile R. </li><li> 24 saat ya da 7 gün (tekrar 2.1.8-2.1.10 adımlar) sonra hücre canlılığı değerlendirmek. </li><li> 24 saat ve şişe içindeki kültür 7 gün sonra ışık mikroskobu ile hücre süspansiyonu varlığını değerlendiren morfolojik analizi yapın. </li><li> FACS analizi 6 ile CD146, CD34 ve CD45 antijenleri de dahil olmak üzere mezenşimal ve hematopoetik hücre belirteçleri, için pozitiflik için Dermisinde örneklerini analiz edin. </li><li> Laminer akış kapağı tohum altında ve tamamen ayrıştırılmış olup, her doku numunesinde bir muhabir küçük bir parçası (deri dokusu sırasıyla Ded veya dermişi sekiz, üç ya da dört tek tip numuneler aynı anda ayrıştırma ile elde edilir), her mikro-grefti (&gt; büyüklüğü 50 mikron % 5 koyun kanlı Broth 100 ul içeren Columbia agar plaka üzerine parçalanma sürecine sonra). </li><li> Üç gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası ve kısırlık değerlendirmek için Columbia agar plakası üzerinde mikrobiyolojik analizler gerçekleştirmek 11. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).</li><li>Ellis, E., Sinn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+homologous+bone+grafts+in+maxillofacial+surgery.">Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery.</a> J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).</li><li>Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+survival+of+autologous+adipose+tissue+taken+and+transplanted+by+different+techniques.">Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques.</a> Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).</li><li>Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+Autologous+Fat+Transplantation+With+Platelet+Rich+Plasma.">Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma.</a> AJCS. 18 (2), 59-70 (2001).</li><li>Trovato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Medical+Device+Rigeneracons+Allows+to+Obtain+Viable+Micro-Grafts+from+Mechanical+Disaggregation+of+Human+Tissues.">A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues.</a> J Cell Physiol. , (2015).</li><li>Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Derived+Stem+Cells+and+Growth+Factors+Applied+on+Hair+Transplantation+Follow-Up+of+Clinical+Outcome.">Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome.</a> JCDSA. 4 (4), 268-274 (2014).</li><li>Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Medical+Device,+Based+on+Rigenera+Protocol+in+the+Management+of+Complex+Wounds.">A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds.</a> J Stem Cells Res, Rev &amp; Rep. 1 (3), 3 (2014).</li><li>Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+dental+pulp+stem+cells+in+periodontal+regeneration:+a+case+report.">Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 34 (3), s27-s33 (2014).</li><li>Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontal+tissue+generation+using+autologous+dental+ligament+micro-grafts:+case+report+with+6+months+follow-up.">Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up.</a> AOMS. 1 (2), 20 (2013).</li><li>Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinus+lift+tissue+engineering+using+autologous+pulp+micro-grafts:+A+case+report+of+bone+density+evaluation.">Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation.</a> J Indian Soc Periodontol. 17 (5), 644-647 (2013).</li><li>Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+culture+medium+for+medical+bacteriology.">A new culture medium for medical bacteriology.</a> Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).</li></ol>

Yazar Antonio Graziano üretir ve RiGenera sistemini pazarlayan İnsan Beyin Dalga srl ​​Bilimsel Direktörü. Yazar Letizia Trovato İnsan Beyin Dalga srl ​​Bilimsel Bölümü işbirlikçisi olduğu

Bu ön çalışma. Zaten mikro greftler implantların 9 etkinliğini, 10 optimize etmek için, diğer klinik uygulamalarda bildirilen Bu protokol ile elde edilen mikro greftler, kollajen sünger ile kombine edilebilir olduğunu gösterdi Özellikle, bu çalışma bio kapasitesini bildirdi komplekslerdeki klinik uygulamadan 30 gün sonra, bir bacak lezyon yara iyileşmesi adjuvan, mikro-greft ve kolajen süngeri oluşmuştur. Ayrıca, in vitro sonuçlar hemen mekanik ayrıştırma sonra da 24 saat ve kültür 7 gün sonra her ikisi de kayda değer bir hücre canlılığı sürdürmek, üç farklı deri dokuları ayrıştırmak için bu protokolün etkinliği hakkında kanıtlar sunmaktadır. homojenizasyon bu tür sonra hücre canlılığı bakım geniş manipülasyon kaçınarak, sadece bir adım steril otolog mikro greft halinde elde etmesini sağlar. Bu kanıt uyum içindedirDiğer yeni kağıtları ile hangi in vitro bu protokolün etkinliği periost, kalp atriyum ve göz küresinin 5 lateral rektus kasının biyopsi de dahil olmak üzere dokuların diğer tip, içinde de test edilmiştir. Özellikle, muhtemelen% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş bir ortam kullanılması ile, 7 günlük bir kültürden sonra, aşınmıştır ve dermiş örneklerde artmış hücre canlılığı gözlendi. hücre canlılığı bakım ek olarak, bu sistem, güvenli ve kullanımı kolay ve birkaç dakika içinde örneğin enzimatik hücre izolasyonu için geleneksel yöntemler ile ilgili olarak, mekanik hücre yapılarının bozulmasını önlemek dokuların farklı parçalamak edebilmektedir yürütme daha uzun zamana ihtiyacı sindirim. Ayrıca, bu sistem 50 mikronluk bir cut-off ile hücreleri seçmek mümkün ve bu aralığı içerir çünkü bu yönü, enjektabl mikro greft başarısı dikkate alınarak çok önemlidirBirçok hücre tiplerinde farklılaştırmak ve daha sonra lezyon onarım iyileştirmek mümkün progenitör hücreler. Bu protokol donör konusu da bu mikro-greft alıcı olduğu göz önüne alındığında, bize canlı değil, aynı zamanda otolog mikro greft elde etmek için değil sadece izin verir. otolog mikro greft elde etmek için bu sistemin kapasitesi özellikle olmayan bir otolog Diş Pulp Kök Hücrelerin bu nakli (DPSCs) gösterilmiştir diş hekimliği alanında bildirildi kemik içi defekt periodontal tamir ve atrofik yenilenmesine katkıda bulunan 5,6 maksilla. Yara iyileşmesi sürecini iyileştirmek için bu mikro-greft yeteneği de daha önce cerrahi müdahaleler veya komplikasyonlar 4 sonra karmaşık yaraların tedavisinde bildirildi. otolog ve mikro greft kullanıma hazır kullanımı ile ilgili diğer bir avantaj, deri lezyonları üzerindeki sonraki implant görünümünde, steril koşullar tutmaktadır. Sonuç olarak, bu yazıda anlatılan protokol böyle bu çalışmada belirtilen gibi akut / kronik deri yaraların iyileşmesini geliştirmek için klinik müdahale kullanmak insan mikro greft doku hazır oluşturmak için kapasitesini gösterdi. In vitro sonuçları için olasılığı üzerinde oluşturmak canlı mikro greftler de rapor edilmiştir ve bu parametre doku onarımında başarı yüzdesini arttırmak için kesinlikle önemli olduğunu var. Birlikte ele alındığında, veriler, bu yeni sistem deri yaralarının tedavisi hızlı ve güvenli bir alet ihtiyacı olan klinisyenler için gelecek vaat eden bir araç olarak kabul edilebilir olduğunu göstermiştir. Şu anda, bu özel uygulamada protokolü için özel modifikasyonlar veya sınırlamalara cilt kullanımı kolay bir doku temsil verilen ve diğer çalışmalarda farklı deri lezyonları 6,7 aynı protokolün etkinliğini rapor, yok </&gt; Sup. Biz (kemik rejenerasyonu için veya ülserler tedavi için damar tıp örneğin ortopedi), diğer klinik alanlarda klinik kullanımını doğrulamak için bir konu çok sayıda bu sistemi kullanmak için gelecekte umut.

Son yıllarda, birçok yeni yöntemler akut ve kronik deri lezyonlarında tek adım tedaviler sağlamak amacıyla ameliyat sırasında otolog hücre süspansiyonları elde etmek için biyoteknoloji alanında geliştirilmiştir. Ayrıca, travma, diyabet, enfeksiyonlar ve diğer nedenlere bağlı akut ama esas kronik yaraların yönetimi, zorlu kalır. Kronik yaralar sağlık sistemleri, dünya çapında 1 üzerinde çok büyük bir mali yük neden ciddi bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir montaj kanıtlar vardır. deri lezyonlarının tedavisi başarı oranını artırmak için, (hücre geliştirme dahil) geniş bir manipülasyon olmaması ve steril koşullar bakımı hemen hasarlı alan üzerinde uygulanabilen bir hücresel süspansiyon oluşturmak için, gerekli olan Hastalar, böylece bu tür hücre fabrikalarında olarak temiz oda daha uzun bir işlem önler. Stküçük bir deri biyopsisi, öğütme, santrifüjleme ve diğer ayırma yöntemlerinin (örneğin, enzimatik veya mekanik) arasında Arting, sık sık bir büyüme ortamında kültürlenebilir bir hücresel süspansiyon elde etmek için kullanılır. Tüm bu yöntemler, genellikle hücre yapıları vurgulayarak ve hücre canlılığının bir azalmaya yol açan, uygulama, uzun bir süre gerektirir. Bir diğer önemli bir yönü zarar görmüş alanların onarmak, örneğin, klinisyenler tarafından kullanılmak üzere hazır bir otolog hücre süspansiyonu elde etmektir. Ayrıca, iyi otolog doku greftleri sonunda indüksiyon ve iletim 2, 3 ilkeleri ile alıcı sitesine hayatta transfer prosedürleri hayatta olduğu saptanmıştır. İdeal greft dokusu hazır olması ve düşük antigenesiti ve donör saha morbiditesi 4 olmalıdır. Bu delillerden, bu çalışmanın ilk amacı için uygun otolog biyo-kompleksleri oluşturmak oldudoku onarımında klinik uygulama. Bu amaçla, bu protokol ile ayrıştırılmış edildi deri dokulardan başlayarak otolog mikro greft elde etmek için bir yeni bir yöntem tarif. Bir olgu sunumu da burada kollajen sünger ile birlikte bu protokolü tarafından elde edilen otolog mikro greftler bir klinik uygulama olarak tarif edilir. Bu yaklaşım, daha önce insan dokularıyla 5 mekanik ayrıştırma etkili olduğu rapor edilmiştir ve greft ve dermal dokularda 6,7 rejenerasyonu için hem de oral çene cerrahisi 8-10 bağlantı dokularının rejeneratif terapisi için klinik olarak kullanılmaktadır . Buna ek olarak, bu çalışmanın ikinci amacı da bu protokol tarafından kendi ayrıştırma sonrası deri dokuların biyolojik karakterizasyonu oldu. Bu amaçla, cilt dokusuna farklı homolog numuneler farklı çoklu organ gövde alanından türetilmişve / veya çoklu doku bağış Emilia Romagna Bölge Cilt Bankası nakli için dokular (CNT 2013) hasat, işleme Ulusal Kuralları takip eden ve dağıtan işlenmiştir. Olgu Sunumu: Trafik kazası nedeniyle karmaşık bir travma gösteren 35 yaşındaki kadın hasta Ancona Hastanesi Yoğun Bakım Ünitesi&#39;ne yatırıldı. Hastada bir açık yara ve eksternal fiksatör ile stabilize bir bileşik kırık bacak bir enfeksiyon gösterdi. Iki radikal debridman ve yara negatif basınç terapisi (VAC tedavisi) sonra temiz oldu ve periost sağlıklı göründü, biz kurtarma iki ay sonra protokol uygulandı. Bu sistem ile ayrıştırma sonra, elde edilen mikro-greftler, daha sonra lezyon tamir üzerindeki etkinliğini araştırmak için implante edildi kollajen sünger ile biyo-kompleksleri oluşturmak için kullanıldı.

<table><tbody><tr><td>Rigenera Machine</td><td>Human Brain Wave</td><td>79210R</td><td></td></tr><tr><td>Rigeneracons</td><td>Human Brain Wave</td><td>79450S</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Roche Diagnostic GmbH</td><td>11465007001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>PBI International</td><td>733-2292</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>PBI International</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Biological Industries PBI</td><td>03-038-1 &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies for FACS Analysis</td><td>eBiosciences</td><td>code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349&amp;nbsp; for CD34-APC&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Columbia agar</td><td>BioMerieux Company</td><td>43041</td><td></td></tr><tr><td>Condress&amp;reg;</td><td>Abiogen Pharma</td><td></td><td>collagen sponge used for bio-complexes</td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl solution</td><td>Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene&amp;nbsp;</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tissue characterization after a new disaggregation method for skin micro-grafts generation

Birkaç yeni yöntemler akut ve kronik deri lezyonları için bir adım tedaviler sağlamak amacıyla, ameliyat sırasında otolog hücre süspansiyonları elde etmek için biyoteknoloji alanında geliştirilmiştir. Ayrıca, travma, diyabet, enfeksiyon ve diğer nedenlere bağlı kronik fakat akut yaraların yönetimi, zorlu kalır. Bu çalışmada, tek bir hastanın cilt dokusuna ve klinik uygulama otolog mikro greft oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, deri, de-epidermized dermis (DED) ve çok-organ ve / veya çok doku donörlerin dermis türetilen cilt dokusuna in vitro biyolojik karakterizasyonu de yapıldı. Bütün dokular bize canlı mikro greft elde etmek için izin, bu yeni protokolün göre ayrıştırılmış bulundu. Özellikle, bu yenilikçi protokol deri lezyonları uygulanacak hazır otolog mikro greftler ve kollajen sünger tarafından bestelenen biyo-kompleksleri oluşturmak mümkün olduğunu bildirdi. CliniBir bacak lezyon otolog biyo-komplekslerinin cal uygulaması da yeniden epitalization süreci ve lezyonun yumuşaklık hem de bir gelişme göstererek, bildirildi. Buna ek olarak, in vitro bir model bu sistem ile, mekanik ayrıştırma sonra hücre canlılığı, kültür kadar yedi (7) gün süre ile uzun süre devam eder gösterdi. Ayrıca ayrıştırma elde edilen hücre havuzu yüksek rejeneratif potansiyeli, doku yenilenmesi ve onarım süreçlerinde önemli bir rol meydana mezenkimal kök hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin, oluştuğunu, akış sitometri analizi ile saptanmıştır. Son olarak, Ağar levhalarına kültüre Bu prosedür mikro greft kısırlığı tutar in vitro olarak gösterilmiştir. Özet olarak, klinisyen, uygun bir steril ve en sık görülen biyolojik scaffo tek başına ya da kombinasyon halinde uygulanabilir mikro greft kullanıma hazır tek bir adımda elde etmek için yeni bir reaktif yaklaşım, umut verici bir araç olabilir sonucunalds.

Bu ön çalışmada, ilk hedefimiz kullanıma hazır biyo-kompleksleri üretmek için kolajen gibi bir biyolojik destekle birlikte insan otolog mikro greftler, yeteneğini, araştırmaktır. Bu biyo-kompleksleri, bir hastada yerleştirildi Bir araba kazası (Şekil 2A) yol açtığı bir bacak lezyon ve 30 gün (Şekil 2B) sonra doku onarımı ile ilgili tam bir reepitelizasyon gözlenmiştir. Ayrıca, klinik takip, klinik uygulamaya paralel olarak. 5 aydır (Şekil 2C) sonra hasarlı alanın iyi bir doku ve yumuşaklık gösterdi, in vitro çalışmalar aynı zamanda cilt dokusu gibi farklı deri dokularının hücre canlılığı değerlendirmek için yapılmıştır , Ded ve dermis önce ve bu sistem ile ayrıştırma sonra. Özel olarak, doku, her tür dikkate farklı kalınlık alarak, sekiz eşiğideri dokusu, DED ve derma için tek bir aşamada işlenebilir dört ve üç biyopsiler sırasıyla oluşturulmuştur. Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi biyopsi kurulan sayı daha sonra iyi bir hücre canlılığını korumak için ayrıştırma en iyi durumda belirlemek için biyolojik özelliklerine göre, dört farklı zamanlarda ayrıştırılmış edildi. Doku işlenmesini kaçınılmaz sağlam doku ile karşılaştırıldığında hücre canlılığının bir bozulma neden olmakla birlikte, bu sistem ile yapılan mekanik parçalanma deri, DED ve dermis tüm örneklerde% 30 hücre canlılığının bir ortalama değerini korumak için görünmektedir 22 OD / gr ila 7 OD / gram FO, sağlam doku (Şekil 3B) ile ilgili olarak farklı zamanlarda (Şekil 3A), değerlendirildi (bozulmamış deri dokusunun 92 OD / gr ve 29 OD / gram ayrıştırma sonrası ortalamar bozulmamış ayrıştırma ve nihayet ayrıştırma açısından sağlam dermis) 2.7 OD / gr 16 OD / gr dan saygı ile ded. Bu nedenle, bu ilk sonuçlar, bu sistem, acil ayrıştırma sonra hücre canlılığı kayda değer seviyesini korumak mümkün olduğunu göstermektedir. hücre canlılığı üzerindeki ayrıştırma etkisi de gözlenmiştir 24 saat ya da 7 gün ve değişken sonuçlar için kültürlendi doku örnekleri üzerinde araştırıldı. Özel olarak, cilt dokusu örneklerinde hücre canlılığının esaslı bir değişiklik başlangıç ​​zamanı (T 0) (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında homojenizasyon ve kültür zaman bağımsız olarak gözlenmiştir. Öte yandan, Ded örnekleri azaltılmış canlılığı kültür 24 saat gözlendi ama şaşırtıcı hücre canlılığı 7 günlük bir kültürden (Şekil 4B) sonra restore süresi (t 0) başlayan kıyasla sonra. Benzer sonuçlar, Şekil 4C (dermis örnekleri gözlenmiştir). Her bir numune, yinelenen ve Tablo 2&#39;de gösterilen değerleri değerlendirildi. Hücre canlılığı ile birlikte, Tablo 3&#39;te belirtildiği gibi, bu sonuçlar temelinde, cilt dokusuna üç tip hücre canlılığını korumak için ayrıştırma uygun bir zaman tespit kültürlenmiş hücresel süspansiyon morfolojik kısmı da, tek hücreler, belirleme değerlendirilmiştir doku ayrıştırma 24 saat sonra, orada 7 gün ve deri dokusu ve Ded / dermis örneklerinde lif kalıntıları gözlenmiştir süre sonra (Şekil 5 AB). Buna ek olarak, akış sitometri analizi ile hücre karakterizasyonu ve homojenizasyon sonrasında dermiş numunesinde gerçekleştirildi: endotel hücreleri ve mezenkimal kök hücreleri dahil olmak üzere birçok hücre tipi tarafından oluşan hücre heterojen havuzu (Şekil 6) tespit edilmiştir. Ayrıca, bakteriyel büyüme olmaması i tanımlandı<html> n tüm ayrıştırılmış örnekler vaktinde deneysel prosedür (Şekil 7) steril kanıtlayan, Ağar yemekleri numaralı seribaşı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53579/53579fig1.jpg" /> Şekil 1. Bio-kompleksleri Bina Doku Doku bozucular ile Ardından Ayrıştırılmış. Biyo-kompleksleri kollajen sünger mikro greft birleştirerek elde edildi oldu Hastanın Lezyon Alanı&#39;ndan Derma bir küçük Piece Bozucu Sistemi (A) ve Koleksiyon lezyon onarımı (C) için kullanılacak insan yamalar hazır elde etmek. (D) Hematoksilen &amp; eozin (H &amp; E) boyama temsili biyo-kompleks DMEM ortamında üç gün boyunca kültüre ve mikroskop gözlenen <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53579/53579fig1large.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.</a> içerik &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53579/53579fig2.jpg" /> C (Bacak Lezyonu kollajen ve hastadan elde edilen mikro-greft oluşan biyo-Kompleksi Şekil 2. Biyo-Kompleksi uygulama ayağı lezyon (A) uygulanmış ve yara, 30 gün (B) ve 5 ay sonra değerlendirildi ). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53579/53579fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53579/53579fig3.jpg" /> Şekil 3. C ell Canlılık hemen Bozulmamış deri Dokular (B). Cilt bakımından deri Dokuların (A) Üç Türü Farklı Times parçalanma sonra, dört farklı donörlerden elde edilen Ded ve dermis dokular doku disru ile ayrıştırılmış edildiolarak ptors metinde uygun bölümünde göstermektedir. Hücre canlılığı, her doku numunesi için iki kopya halinde yapılan MTT testi ile değerlendirildi. Grafik, her numune için iki kopya halinde yapılan dört ayrı deneyi temsil etmektedir. Sonuçlar optik yoğunluk (OD) ve doku gram (gr) arasındaki oran olarak ifade edilmiştir; standart sapma dokusunun Optik yoğunluğun (OD) ve gram (gr) arasındaki oran hesaplandı. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53579/53579fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53579/53579fig4.jpg" /> Cilt Doku (A) Ayrıştırılmış Numunenin Şekil 4. C ell Canlılık Düzeyleri, Ded (B) ve Zaman (T 0) Başlama dermis (C) ve 24 saat ve 7 gün için alt kültürden sonra. Dokular doku ile homojenize edildi indica olarak bozucularMetinde uygun bölümünde te. ayrıştırılmış örnekleri ayrıştırma 24 saat sonra, 7 gün süre ile, daha sonra kültürlendi ve RPMI 1640 ortamında muhafaza,% 5 CO2 / hava atmosferinde 37 ° C &#39;de% 10 fetal bovin serumu ve antibiyotiklerin ile takviye edilmiştir. daha önce tarif edildiği gibi hücre canlılığı MTT ile değerlendirildi. Grafik, tek bir donörden türetilmiş deri dokusu, DED ve dermis her bir örnek için iki kopya halinde yapılan bir deneyin temsilcisidir. Sonuçlar doku Optik yoğunluğun (OD) ve gram (gr) arasındaki oran olarak ifade edilmektedir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53579/53579fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53579/53579fig5.jpg" /> Ayrıştırılmış Cilt Doku Şekil 5. Morfolojik Analizi (A) ve Ded / dermis (B) sonra 24 saat ve Kültü 7 Gün<html> ure. Morfolojik analiz 24 saat ve cilt dokusu ve Ded / dermis dokularda RPMI ortamında varlığında kültür 7 gün sonra ışık mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53579/53579fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53579/53579fig6.jpg" /> Sitometrisi Analizi ile Şekil 6. Hücre Karakterizasyonu. Mekanik ayrıştırma sonra, dermis ile elde edilen mikro greftler kültürde koymak ve 7 gün CD146, CD34 ve CD45 antijenleri de dahil olmak üzere mezenşimal ve hematopoetik hücre belirteci, için pozitiflik için analiz edildikten sonra. Edildi <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53579/53579fig6large.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.</a> les / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg &quot;/&gt; Ayrıştırılmış deri dokusu, aşınmıştır ve dermis Örneklerinde Şekil 7. Mikrobiyolojik analizi. Ayrıştırılmış doku örneklerinin küçük fragmanları laminer akış başlığı altında,% 5 koyun kanı (BioMerieux Company) ilave Columbia agar üzerine ekilmiş ve üç gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edildi prosedürün sterilite mikrobiyolojik analizi gerçekleştirmek ve değerlendirmek. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53579/53579fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> DOKU ÖRNEKLERİ </td><td> Ayrıştırma TIMES (sn / dk) </td></tr><tr><td> cilt </td><td> 30 sn </td></tr><tr><td></td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td> ded </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 10 dakika </td></tr><tr><td> alt deri </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 10 dakika </td></tr></tbody></table> Cilt ayrıştırılması için kullanılan dört farklı Times Tablo 1. şematik Temsil, Ded ve Deri Dermis. Sekiz, dört ve üç punch biyopsi, Ded ve dermis sırasıyla biyolojik özelliklerine göre, dört farklı zamanlarda ayrıştırılmış bulundu. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="6"> cilt dokusu </td></tr><tr><td colspan="2"> için </td><td colspan="2"> 24 saat </td><td colspan="2"> 7 gün </td></tr><tr><td> 2 </strong&gt; &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 5 &#39; </td></tr><tr><td> 37.1 </td><td> 41,07143 </td><td> 41,07143 </td><td> 65,78571 </td><td> 41,14286 </td><td> 37,42857 </td></tr><tr><td> 35.8 </td><td> 43,82143 </td><td> 36,60714 </td><td> 66.5 </td><td> 41,46429 </td><td> 38,67857 </td></tr><tr><td colspan="6"> ded </td></tr><tr><td colspan="2"> T 0 </td><td colspan="2"> 24 saat </td><td colspan="2"> 7 gün </td></tr><tr><td> 5 &#39; </td><td> 10 &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 10 &#39; </td><td> 5 &#39; </td&gt; <td> 10 &#39; </td></tr><tr><td> 6,649485 </td><td> 8.237113 </td><td> 5.463918 </td><td> 5.731959 </td><td> 7.835052 </td><td> 7,85567 </td></tr><tr><td> 6,845361 </td><td> 8,360825 </td><td> 5.257732 </td><td> 5.989691 </td><td> 8 </td><td> 7.938144 </td></tr><tr><td colspan="6"> alt deri </td></tr><tr><td colspan="2"> için </td><td colspan="2"> 24 saat </td><td colspan="2"> 7 gün </td></tr><tr><td> 10 &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 10 &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 10 &#39; </td><td></td></tr><tr><td> 1.690909 </td><td> 2,77193 </td><td> 0.293898 </td><td> 0.786704 </td><td> 2.880952 </td><td> 2.869048 </td></tr><tr><td> 1.736364 </td><td> 2.830409 </td><td> 0.306351 </td><td> 0.814404 </td><td> 2.940476 </td&gt; <td> 2.928571 </td></tr></tbody></table> Bir Biyolojik Replicate OD / gr olarak ifade Değerleri Tablo 2. Range. Deri dokusundan hücre canlılığı değerleri, Ded ve dermis başlangıç ​​zamanı ve belirtilen sürelerde mekanik ayrıştırma sonra değerlendirilir. sonuçlar, bir deney iki kopya halinde yapıldı ve doku optik yoğunluk (OD) ve gram (gr) arasındaki oran olarak ifade temsilidir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> Çarpma zamanının </td></tr><tr><td> cilt dokusu </td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td> ded </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td> derma </td><td> 2 dakika </td></tr></tbody></table> Ayrıştırma iyi Zaman Tablo 3. şematik Temsil differe İyi hücre canlılığını korumak içinnt doku örnekleri alındı. Cilt aşınmıştır ve dermis doku örnekleri optimum hücre canlılığı, sırasıyla, ayrıştırma 5, 1 ve 2 dakika sonra.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation at JoVE.com

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

protokol yeni bir yöntem, insan doku ayrıştırmak ve kollajen sünger ile birlikte, deri lezyonlarının tedavisinde kullanıma hazır insan biyo-kompleksleri doğuran otolog mikro greft oluşturmak açıklar. Bundan başka, bu sistem, mekanik ayrıştırma sonra farklı zamanlarda mikro greft hücre canlılığı korur.

Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

tissue-characterization-after-new-disaggregation-method-for-skin

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

21.5K Görüntüleme.  Burns Centre and Emilia Romagna Regional Skin Bank.  protokol yeni bir yöntem, insan doku ayrıştırmak ve kollajen sünger ile birlikte, deri lezyonlarının tedavisinde kullanıma hazır insan biyo-kompleksleri doğuran otolog mikro greft oluşturmak açıklar. Bundan başka, bu sistem, mekanik ayrıştırma sonra farklı zamanlarda mikro greft hücre canlılığı korur. 

Video: Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Genetik

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Sıkıştırılmış Kolajen kıyılmış Doku: Tek aşamalı Rekonstrüktif Onarım için Cep içeren Biotransplant

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Biyomühendislik

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Doku Microcolumns ürün toplama aparatı

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Decellularization for the Preparation of Highly Preserved Human Acellular Skin Matrix for Regenerative Medicine

Extracellular matrix (ECM) provides biophysical and biochemical stimuli to support self-renewal, proliferation, survival, and differentiation of surrounding cells due to its content of diverse bioactive molecules. Due to these characteristics, the ECM has been recently considered a promising candidate for the creation of biological scaffolds to boost tissue regeneration. Emerging studies have demonstrated that decellularized human tissues could resemble the native ECM in their structural and biochemical profiles, preserving the three-dimensional (3D) architecture and the content of fundamental biological molecules. Hence, decellularized ECM can be employed to promote tissue remodeling, repair, and functional reconstruction of many organs. Selecting the appropriate decellularization procedure is crucial to obtain acellular tissues that retain the characteristics of the ideal microenvironment for cells. 
The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the decellularization method to obtain a reproducible and effective cell-free biological ECM. Skin fragments from patients undergoing plastic surgery were scaled down and decellularized using a combination of sodium dodecylsulfate (SDS), Triton X-100, and antibiotics. To promote the regular and homogeneous transport of the solution through the samples, they were enclosed in embedding cassettes to ensure protection from mechanical insults. After the decellularization procedure, the snow-white color of skin fragments indicated complete and successful decellularization. Additionally, decellularized samples showed an intact and well-preserved architecture. The results suggest that the proposed decellularization method was effective, fast, and reproducible and protected samples from architectural damages.

Decellularized human skin is suitable for tissue regeneration. A major issue of decellularization is the preservation of the native architecture, along with the appropriate content of structural proteins, glycosaminoglycans (GAGs), and growth factors. The method proposed allows fast and effective decellularization, producing decellularized skin with well-preserved native features.

Extracellular matrix (ECM) provides biophysical and biochemical stimuli to support self-renewal, proliferation, survival, and differentiation of ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Biyoloji

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational research in skin immunology. Murine and human skin differ substantially in anatomy and immune cell composition. Therefore, traditional mouse models have limitations for dermatological research and drug discovery. However, successful xenotransplants are technically challenging and require optimal specimen and mouse graft site preparation for graft and host survival. The present protocol provides an optimized technique for transplanting human skin onto mice and discusses necessary considerations for downstream experimental aims. This report describes the appropriate preparation of a human donor skin sample, assembly of a surgical setup, mouse and surgical site preparation, skin transplantation, and post-surgical monitoring. Adherence to these methods allows for maintenance of xenografts for over 6 weeks post-surgery. The techniques outlined below allow maximum grafting efficiency due to the development of engineering controls, sterile technique, and pre- and post-surgical conditioning. Appropriate performance of the xenograft model results in long-lived human skin graft samples for experimental characterization of human skin and preclinical testing of compounds in vivo.

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

The present protocol describes how to graft human skin onto non-obese diabetic (NOD)-scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) mice. A detailed description of the preparation of human skin for transplant, preparation of mice for transplant, transplantation of split-thickness human skin, and post-transplantation recovery procedure are included in the report.

İnsan Bağışıklık Tepkilerini In Vivo'da Manipüle Etmek için Ksenograft Cilt Modeli

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler