Name: measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate
Uploaded: 2015-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate at JoVE.com

We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

1. Bir Ekstrasellüler Flux yürütülecek olan arabelleğe Güç Ölçme: İki Variations NOT: hesaplamalar ve burada açıklanan yöntemler, bir Ekstraselüler Akı Analyzer kullanılarak geliştirilmiştir. Diğer enstrümanlar için ölçüm hacmi uygun ölçekli olmalıdır. <ol><li> Üretici talimatlarına göre (Materyaller ve Ekipman bakınız) HCl konsantre kullanılarak su içinde 0.1 M standart HCl hazırlayın. Not: Tüm dört enjeksiyon çıkışlarından kullanım için HCI enjeksiyonları hazırlanması için bir örnek hesaplaması, Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir: </li></ol><img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> Tablo iyi bir hücre dışı akı tahlil içine 1. Ardışık HCl enjeksiyonu. <ol start="2"><li> Ortam içinde HCI standart dilüe carr olan teknik çoğaltır sayısı için Tablo 1 &#39;de olduğu gibi denenmektedir edilmesibir tabak içinde ied, artı bir pipet hatası sağlamak için; örneğin, liman dört teknik çoğaltır A enjeksiyonu için, (48.9 ul x 5) tahlil ortamında (1.1 ul x 5) 0.1 M HCl bir stok hazırlamak. </li><li> Ölçüm probu kartuşunun her Liman A içine 50 ul dağıtın. Kalan limanlar B, C, ve D için bu yordamı yineleyin </li><li> Dört liman eklemeler her biri için [2 dakika karıştırın, 1 dakika bekleyin ve 5 dk ölçümü] iki döngü izledi standart kalibrasyon döngüsü ile bir hücre dışı akı tahlil 10, Run (bakınız Şekil 2). <ol><li> Yazılım talimatlarına göre alet yazılımı yukarıda deneyi programlayın. Makinenin içine hazırlanmış kartuşu yükleyin ve yazılım talimatlarına göre kalibrasyonu yapın. </li><li> Program tarafından istendiğinde, kalibrant içeren plaka kaldırmak ve iyi aracı haline her tahlil ortamı içeren plaka takın; programı devam ettirin. </li></ol></li><li> U<html> daha önce gelen kararlı durumda elde edilen 8-10 veri noktaları (genellikle son 8-10 puan) ortalamasını şarkı ve her port ilavesinden sonra, standart asidin her enjeksiyonundan kaynaklanan pH (ΔpH) olarak (kümülatif) farkı hesaplayın. </li><li> Nmol H karşı ΔpH Plot + ölçüm probu tarafından yakalanan 7 ul hacminde içeriyordu. Doğrusal eğim mph / pmol H + tamponlama gücü (BP) &#39;dir. </li><li> Alternatif olarak adımları 1,2-1,3, Tablo 2&#39;de olduğu gibi Liman D&#39;de bir HCI enjeksiyonu takiben bağlantı noktaları A, B, ve C Bir deney için kullanılan bir deneyde, aşağıdaki ΔpH ölçümleri yürütmek dört teknik eşlemeler Hücre dışı akı analiz plakasının (dört arka plan sıcaklık düzeltmesi kuyular hariç) 20 deneysel kuyularda 5 puanlık bir standart eğrinin her noktası oluşturmak için kullanılan. </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; Iyi bir hücre dışı akı tahlil içine Tablo 2. Tek HCl enjeksiyonu. 2. Harici pH Metre Kullanımı arabelleği Güç Ölçme Not: Harici bir pH sondasını kullanarak bir maddenin tamponlama gücünü ölçmek 37 ° C&#39;de sondasını ayarlamak ve deney süresince her reaktifler için bu sıcaklığı korumak için. <ol><li> Üretici talimatlarına göre HCl konsantre kullanılarak su içinde 0.1 M standart HCl hazırlayın. </li><li> Sıcak pH probu, pH standartları olan tamponlama kapasitesine ölçülecek deney ortamı, ve bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar 0,1 M HCI. </li><li> Üretici talimatlarına göre 37 ° C&#39;de pH sondasını kalibre edin. Bir ısı plakası ya da su banyosu kullanılarak analiz boyunca 37 ° C&#39;de tüm reaktifler koruyun. </li><li> Kısım küçük bir cam bardak veya konik tüp içine tahlil ortamı 10 ml. Sürekli bir dalmış pH prob kullanılarak pH&#39;ı izleyin. </li><li> Şu şekilde 0,1 M HCI ekleme10-20 ul alikotları orta söylüyorlar. <ol><li> Bir karıştırma çubuğu kullanarak veya elle her asit ilavesinden sonra kabı dönen karıştırma emin olun. </li><li> PH ölçümü stabilize etmek için bir kaç saniye sonra her eklemeden sonra pH&#39;ı kayıt izin verin. </li><li> Tablo 3&#39;te görüldüğü gibi, ilave yeterli sayıda doğru eğim hesaplama sağlamak ve deney sırasında beklenen pH aralığını karşılamak için tercih. </li></ol></li></ol><img alt="Tablo 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> Tablo 3. pH metre kullanılarak tamponlama gücü ölçümü. Veriler 0.1 M HCl altı 20 ul eklemelerle tipik bir deney temsil etmektedir. <ol start="6"><li> Nmol H + karşı komplo ΔpH tamponlama gücü (Şekil 1) temsil eden bir lineer eğim vererek, 7 ul başına katma. </li></ol> Şekil 1. tamponlama gücü belirlenmesi. HCI standart eğri Tablo 3&#39;te aşağıdaki Tablo 1, Tablo 2 (burada) &#39;deki gibi ölçülür. Lineer eğri uyum eğimi tamponlama gücü (pH / nmol H + 7 ul içinde) elde edilir. Her nokta n ± SEM = 9 teknik çoğaltır ortalama temsil eder. <ol start="7"><li> Tamponlama gücü Yöntem 1 veya yukarıdaki 2 ile bilinen kez iktidarı tamponlama ile ECAR bölerek PPR (pmol H + / dak / mg protein) için ECAR sinyali (mph / dak) dönüştürmek (BP) (mph / pmol H +) ve her bir kuyu protein içeriği ölçekleme: PPR tot (pmol H + / dak / mg protein) = ECAR (mph / dak) / BP (mph / pmol H + 7 ul) iyi (ug) başına / protein Denklem 6 </li><li> Alternatif olarak, Yöntem aynı deneyleri kullanmaks 1 ya da 2 otomatik veri toplama sırasında PPR hesaplamak için cihaz yazılımı tarafından kullanılan arabelleği Kapasitesi (BC) değerini hesaplamak için. NOT: Cihaz kullanım kılavuzu 12 (sayfa 107) hesaplanması ve M.Ö. olarak açıklanan tamponlama kapasitesi, kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlar BC (mol / L) = mol H + / (ΔpH x tampon hacmi (L)) Denklem 7 Not: Denklem 7&#39;de tanımlanan tamponlama kapasitesi, yukarıda tarif edilen cihaz veya harici pH probu deneylerinde hesaplanabilir. Tamponlama gücü ve tamponlama kapasitesi arasındaki Dönüşüm kolayca (ekli e-tabloyu bakınız) yapılır: BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + 7 ul) / 7 ul) Denklem 8 NOT: tahlili yapmadan önce Eğer biliniyorsa, tamponlama kapasitesi deneysel kurulum sırasında cihaz yazılımı doğrudan girilebilir. </li><li>Önceki yayın 6&#39;da tarif edildiği gibi, bu yordamı ve çoğu geleneksel tampon sistemlerinde yukarıda kullanılan hesaplamaları uygulanır. NOT: Tablo 4 tamponlama gücü ve çeşitli geleneksel medya tamponlama kapasitesi. </li></ol><img alt="Tablo 4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> Tablo 4. Tamponlama gücü ve seçilen medya tamponlama kapasitesi. 3. C2C12 Miyoblast Hücreleri Kullanarak Hücre dışı Akı Testi Sahne Not: Aşama 3.4.3 içinde, CO 2 açısından farklılık varlığını HCO 3 CO 2 tam dönüşümü için gerekli olmadığını öne C2C12 kültüründe karbonik anhidraz varlığına asit üretimi bağlıdır -türevli vardı - + H +. Ancak, ampirik farklı deneysel sistemlerde bu test om önce öneriliritting karbonik anhidraz. <ol><li> Kültür fare C2C12 11,1 mM glukoz, 2 mM glutamin,% 10 h / h cenin sığır serumu (FBS), 100 U Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) içinde% 95 hava /% 5 CO2 altında 37 ° C&#39;de 13 miyoblastlar / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin. </li><li> Testten 24 saat önce için 20.000 hücre, aynı kültür ortamında 100 ul plaka / tohum hücre / oyuk, herhangi bir ek kaplama ile 24 oyuklu polistiren hücre dışı akı deney plakası (Malzemeler ve Yöntemler bölümüne bakınız). </li><li> , FCCP oligomycin seyreltilir ve Krebs Ringer fosfat HEPES (KRPH) deney ortamı (2 mM HEPES, 136 mM NaCI, 2 mM NaH 2 PO 4, 3.7 mM KCI, 1 rotenon artı myxothiazol ve 10x son konsantrasyona HCI (isteğe bağlı) mM MgCI2, 37 ° C&#39;de 1.5 mM CaCl2,% 0.1 w / v yağ asidi-içermeyen sığır serumu albümini, pH 7.4) eklenmiştir. </li><li> Hücre hazırlığı <ol><li> 30 dakika önce tahlil için, ge aspire yapışık hücreler üç defa yıkamakntly kuyudan orta kaldırmak ve daha sonra yavaş yavaş 500 ul KRPH sözlerine ekledi. </li><li> Hava altında 37 ° C &#39;de, üçüncü bir yıkama aşamasından sonra hücreler inkübe (değil% 5, bu bikarbonat içermeyen ortamın pH değerini değiştirdiklerini CO2 altında). </li><li> Deney başladığında, ek bir alt-tabaka ile, 500 U / ml, karbonik anhidraz ve ya glikoz (10 mM) veya sadece ortam içeren 500 ul taze KRPH kuyularda KRPH değiştirin. </li></ol></li><li> Sensör kartuşu yükleme <ol><li> Liman A: 2 ug / ml oligomycin Port B: 0.5 uM FCCP, Port C (analizdeki nihai konsantrasyon da verilebilir) aşağıdaki gibi hücre dışı bir akış algılayıcısı, kartuşun kartuş bağlantı noktalarına Aşama 3.3&#39;te hazırlanan her bir 10x bileşik pipetleyin 50 ul tam bölünen miktarları : 1 uM rotenon, 1 uM myxothiazol, Port D: HCI (yukarıda ve Tablo 2&#39;de tarif edildiği gibi bir in-deney asit kalibrasyon gerçekleştirmek ise). NOT: Tüm solunum zincir engellenmesi amacı Burada anlatılan için, 1 uM benimxothiazol 1 uM antimycin A ile değiştirilerek kullanılabilir </li></ol></li><li> Ekstrasellüler akış deneyi: <ol><li> 10 de tarif edildiği gibi, solunum kontrol belirlenmesi için standart bir hücre dışı akı tahlili gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> NOT: Deneyin her segment için, karışımı belirlemek bekleyin ve ölçüm süreleri kesimi başına döngü yanı sıra numarası, istenilen. NOT: Tablo 5&#39;teki veriler üç deney çevrimleri tamponlama kalibrasyonu için HCI (farklı miktarlarda Port D ilave edildikten sonra meydana gelen, 2 dk karışımı, 1 dakika bekleyin ve her segment için 5 dakika ölçüm iki deney çevrimi üzerinde toplandı Tablo 2 deki gibi gücü). <img alt="Tablo 5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> Tablo 5. Hücre dışı akı tahlil yapılandırması. 4. Measuring sonu nokta Laktat Konsantrasyon Not: azaltılması (2 dakika boyunca), ilk hızının ölçümü geleneksel bir 96 oyuklu plaka içerisinde direkt olarak belirlenebilir hücre dışı bir akı deneyin sonunda bazı farklı sistem, son nokta laktat konsantrasyonu burada tarif Dolaylı tahlil doğrulamak için NAD + → NADH, bizim daha önceki yayında 6 ayrıntılı olarak tarif laktat dehidrojenaz ile katalize. Örnek Sonuçlar sunulan veriler için, glükoz-ihtiva eden test gözlerine bitiş noktası laktat konsantrasyonu ~ 40 uM idi. <ol><li> 2x hidrazin orta hazırlayın: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hidrazin, pH 9.8 22 ° C&#39;de),. Hemen deney başlamadan önce, 40 U / ml 4 mM ve laktat dehidrojenaz (LDH) NAD + ilave edin. Nihai deney ortamı bileşimi (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM, hidrazin, 2 mM NAD +, 20 U / ml LDH. </li><li> Hemen hücre dışı akı tahlili sonra, 100 kaldırmaOpak bir (siyah) bir çukuruna hücre dışı akı deney plakası ve iletiminin her kuyudan tahlil ortamı 96-çukurlu plaka ul. </li><li> Her bir numune için, 100 ul 2x hidrazin orta ekleyin. </li><li> Hemen bir mikro-okuyucu plaka yük ve 340 nm uyarma / 460 nm emisyon NADH floresan izleme başlar. </li><li> Yaklaşık 2 dakika boyunca başlangıç ​​hızı kaydedilir. </li><li> 0 ila 50 uM ilave laktat konsantrasyonları için laktat konsantrasyonuna karşı başlangıç ​​hızını gösteren standart bir eğri oluşturmak için benzer bir deney başlat. </li><li> Her deneysel iyi standart eğri kullanılarak laktat konsantrasyonunu hesaplayınız. </li></ol> 5. Protein İçeriği Ölçme <ol><li> Deney plakasının her bir oyuğuna kalan deney ortamını çıkarın. </li><li> Alt kuyu yüzeyindeki hücrelerin yerini değiştirmemek en aza indirmek için dikkatli olmak, BSA içermeyen KRPH ul wells 250 ile üç kez yıkayın. </li><li> 25 ul RIPA lizis ekleortamı (150 mM NaCI, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA,% 1 h / h Triton X-100,% 0.5 w / v sodyum deoksikolat,% 0.1 h / h SDS, 22 ° C&#39;de pH 7.4) deney plakasının her oyuğuna. </li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde plaka inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 1200 rpm&#39;de bir plaka karıştırıcısı üzerinde çalkalayın plaka. </li><li> Liziz tamponu bileşimin ölçümü yöntemi ile uyumlu hale getirmek için, bir BCA aracıyla, örneğin, standart yöntemler, protein konsantrasyonu ölçümü. Şekil 2&#39;de deneyde protein içeriği ~ 4 ug / oyuk oldu. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).</li><li>Renner, K., Jansen-D&#252;rr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption.">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).</li><li>Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+production+in+glycolysis-impaired+tumors+provides+new+insights+into+tumor+metabolism.">Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism.</a> Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li><li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Seahorse Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).</li><li>Blau, H., Chiu, C., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+human+heterocaryons.">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons.</a> Cell. 32, 1171-1180 (1983).</li></ol>

Dr. Shona Mookerjee o hiçbir rakip mali çıkarlarını sahip olduğunu beyan eder. Dr Martin Brand Bu maddede kullanılan araçlar ve reaktifler üreten Seahorse Biosciences için görüşmelerini tamamladı. Bu yazı için Açık Erişim ücretleri Seahorse Biosciences tarafından ödendi.

Hücre dışı asidifikasyon hücresel metabolik hızının kolayca ölçülebilir bir göstergesidir. (Laktat üretimi tarafından tanımlandığı gibi) düzgün bir deney ortamı tamponlama gücünü bilmek önemlidir hücresel glikoliz oranını belirlemek için, ve üretim oranları proton, oksijen tüketimi ve asitlenme dışı akı ölçümlerini dönüştürmek. Bu hesaplama gerçekleştirilmesi ile, sitrik asit döngüsünde serbest CO 2 kaynaklanan asidifikasyon laktat üretimi ile sonuçlanan asitlenme bırakarak çıkartılabilir. Bu düzeltme için tamponlama gücünü ölçmek için burada verilen çok farklı şekillerde, farklı avantaj ve dezavantajlara taşırlar. PH sondası kullanılarak Dış ölçüm son derece doğru ve tekrarlanabilir, ancak deney plakası, deney sırasında bileşiklerin eklenmesi ya da t mevcudiyetinde içinde ihtiva floroforlar ile getirilen pH tespiti küçük farklılıkları yansıtmayabilirO hücrelerin kendileri. In-plaka pH ölçümleri bu konuları ele, aynı zamanda deneysel gürültü değişen derecelerde tanıtmak. ECAR CO 2 Düzeltme ilk kez glikolitik oranı net ve kantitatif hesaplama sağlar ve bir deney sırasında, toplam ECAR solunum ve glikolitik katkı değişimini göstermektedir. Denklem 5 ve OCR, ECAR ölçümlerini kullanarak, güç ve tamponlama, glikolitik hızı sağlanan basit bir tablo (Tablo 6) kullanılarak hesaplanabilir. 6 istenirse bu oran post-hoc laktat ölçümü ile kontrol edilebilir. Pentoz fosfat yüksek ölçüde aktif olan hücrelerde, örneğin 6-aminonicotinamide olarak yolu inhibitörleri kullanımı glikolitik hız izole etmek için yararlı olabilir. Her iki CO 2 katkılarının hesaplanması - toplam ve laktat türevi H + Ekstra Hücresel Asidifikasyon Oranı ve Oksijen Tüketim ölçüleniyon Oranı metabolik aktivite konusunda güçlü ve nicel ifadeler yapmak dışı akı verilerini kullanmak için paha biçilmez bir araçtır. Tamponlama gücünün ölçülmesi ve araştırma ve istenen veri altında hücreleri için hücre dışı bir akış deneyi optimize etmek için çeşitli değişiklikler dahil olmak üzere, burada tarif edilen prosedürler kullanılarak, dokunulmamış hücrelerde glikoliz oranı, deney şartlarının geniş bir yelpazede altında belirlenebilir. Bu yöntem, bir polistiren yüzey (yapıştırılabilir ya da hücreler veya organellerin) yapışık kültürde büyüyebilen hücreler ile sınırlıdır. Kültürlenmiş hücreler homojen ve konfluent olduğunda yararlı veriler yine de bu bir koşul aralığı üzerinde elde edilebilir olsa en güvenilirdir. Hesaplamalar k hücreleri ise, ancak farklı alt-tabaka ve kısmi oksidasyon 6 daha tam oksidasyonu için 0.65 ile 1.0 en fazla H + / O olarak 2 aralıkları, hücrelerin metabolizması bilgisine ihtiyaçnown glikoz oksitlenmesi için, 1.0 bir değer kabul edilebilir. Sistemlerinde kullanıldıklarında tüm metabolik karakterizasyonu ile ilgili, bu yöntem özellikle yararlı olabilir rağmen burada solunum yolu ve aynı zamanda glikolitik metabolizması arasında bir kayma hücresel ATP kaynağı kök hücre ve tümör kaynaklı kanser hücreleri karakterizasyonu dahil olmak üzere, önemli bir fenotipi muhafaza etmek. Bu ve diğer bağlamlarda metabolik kontrol değişiklikleri anlamak bu hücre tiplerinin deney tasarımı ve analizi sofistike ve doğruluk yüksek derecede sağlayacaktır.

Bu yöntemin genel amacı doğru dışı akı analizi kullanılarak hücrelerin glikolitik oranını ölçmektir. Dışı asitlenmesine kullanarak glikolitik oranı kantitatif ölçümü birçok deneylerin istenilen uç noktasıdır. Bununla birlikte, hücre dışı asidifikasyon oranı toplam iki bileşenden toplamıdır: Solunum asitleştirme, CO (2 CO 3 daha sonra HCO 3 ayrışmaktadır H nemlendirir - + H +), 2 şeklinde, ve aynı zamanda glikolitik asitleştirme formda + H + - laktat. Toplam dışı asitleşmeye CO 2 katkıları yakın zamana kadar burada kullanılan ölçüm platformu, XF24 analizörü 7 önemsiz kabul edilmiştir. Ancak, 2 dışı asitleşme 4-5 büyük katkı olabilir CO çoklu diğer sistemlerde açıktır. Çoklu kağıtlar Bu con kabultribution, ancak asit 3,8,9 -türevlenmiş CO 2 doğrudan kantitatif çalışmayın. Biz son zamanlarda bu CO 2 üretimi, bu sistemde 6 hücre dışı asitleşme önemli bir kaynağıdır kantitatif gösterdi. Glikoz katabolizma gelen CO 2 üreten çok sayıda metabolik yol olmasına rağmen Dahası, bu sitrik asit döngüsü matris dehidrogenazlar tarafından yürütülen ezici katkıda ve tüm diğer kaynaklar deneysel hata 6 dahilinde CO 2 miktarını oluşturur. CO2 üretimi için düzeltilmesi olmadan, hücre dışı asitleşme oranı dolayısıyla glikolitik belirsiz bir göstergesidir ve kantitatif kullanılamaz. Daha önceki yayın solunum CO 2 bile genellikle öncelikle glikoliz 6 kullanmak inanılan hücrelerde toplam asitlenme sinyalinin toplu oluşmaktadır çeşitli örneklerini vurgulamaktadır. Buna ek olarak,Toplam asitleştirme solunum CO2 katılım bir deney farklı aşamalarında glikolitik oranının doğru karşılaştırma CO2 için düzeltme gerektiren gösteren yaygın metabolik profil deneyleri sırasında büyük ölçüde değişir. Hücre dışı asidifikasyon oranını kullanarak hücrelerin glikolitik hızını ölçmek için, üretilen toplam H + değişim pH değişiklikleri dönüştürmek ve sitrik asit döngüsünün çalışması sırasında ortaya çıkan CO2 neden olduğu hücre dışı asidifikasyon çıkartılması gerekli olmaktadır. Burada, (O 2 konsantrasyonunda hücre dışı değişiklikler elde edilmiş) ve CO2 üretimi (pH hücre dışı değişiklikler ve kalibre edilmiş deney ortamı tampon gücünden) hücre dışı bir proton üretim hızının ölçülmesi için basit bir yöntem tarif eder ve glikolitik hızı nasıl hesaplanacağını gösterir, Bu ölçümleri kullanılarak. Bu yöntem, mukavemet<html> laktat üretimi ile tanımlanan düzgün glikolitik oranını hesaplamak için kullanarak hücre dışı asitleşme ölçüm programı ens. Solunum CO 2 (ya da laktat doğrudan ölçümü) için düzeltme olmadan, belirlemek mümkün olup olmadığını ve toplam asitlenme hızı laktat üretiminin doğrudan ölçümü olarak toplam hücre dışı asitlenme kullanmak deneyler yorumlanması karıştırıcı, glikolitik oranını yansıtan ne ölçüde. HESAPLAMA CO 2 ve laktat deneysel hata içinde vardır, miyoblast hücreleri 6 deneylere dayalı dışı asit üretimi için sadece iki katkıda. Dolayısıyla, toplam hücre dışı asidifikasyon (PPR proton üretim oranı) oranı olarak tanımlanabilir: PPR tot = PPR solunu + PPR glisin Denklem 1 . _content &quot;&gt; tot = toplam; solunu = solunum, glisin = glikolitik Glikolitik PPR böylece: PPR glisin = PPR tot - PPR solunum Denklem 2 İşte, PPR tot = ECAR tot / BP Denklem 3 burada ECAR = dışı asitleşme oranı (mph / dk) ve BP = tamponlama gücü (mil / pmol H + 7 ul), süre PPR resp = (10 pH pKa 1 / (1 ​​+ 10 pH pK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Denklem 4 burada K 1 = CO 2 hidrasyon ve HCO 3 ayrışma kombine denge sabiti - + H; max H + / O 2 = the CO glikoz 6 tam oksidasyonu gibi belirli bir metabolik dönüşüm için 2 -türevi asitlenme; OCR = oksijen tüketimi oranı (pmol O 2 / dk), ve OCR rot / myx = olmayan mitokondrial OCR. Denklem 4 (mitokondriyal solunum zehirler rotenone ve myxothiazol dayanıklı OCR olarak tanımlanan) ve maksimum H hesapları + her bir taban (max H + / O 2 için tüketilen O 2 başına üretilen olmayan herhangi bir mitokondrial OCR çıkarılarak mitokondrial OCR izolatlarının ) () 6 ya bakınız, yanı sıra deneysel sıcaklık ve pH (10 pH pKa 1 / (1 ​​+ 10 pH pKa 1 H + sebebiyet veren CO2 oranı). glukoz tam oksidasyonu için, mitokondriyal Oksijen Tüketim Oranı (OCR) CO 2 üretim hızının tam olarak eşittir. ekstrasellüler akı ölçüm sınırlı tahlil hacmi, CO 2 üretmeksolunum yoluyla d tahlil ortamında sıkışıp kalır. + H + - tuzağa CO 2 Çoğu sonra HCO 3 ayrışmaktadır H 2 CO 3 için hidratlanır. Küçük bir kısmı çözündürüldü kalır ama hidrate olmadığı ve HCO 3 CO 2 hidrasyon ve ayrışma sabiti ile birleştirilmiş denge termodinamik dikte edildiği gibi bir küçük bir kısmı, sulu, ancak ayrışmış değil - + H + deney sıcaklığında (37 ° C) ve pH (~ 7,4). Böylece, PPR tot olduğu PPR resp çıkarılarak PPR g hesaplanması için tam denklem: PPR glisin = ECAR tot / BP - (10 pH pKa 1 / (1 ​​+ 10 pH pK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Denklem 5 benn bu yolu, solunum ve glikoliz yanı sıra bunların ilişkili ATP üretim oranları oranları, kantitatif basit ölçümlerle (oksijen tüketimi, hücre dışı asitleşme, tamponlama kapasitesi) ve diğer gerekli değerlerin ithalat veya hesaplama (H + / O 2 belirlenebilir P / O ve denge sabiti K 1) 6. Burada anlatılan deney Seahorse XF24 10,11 olarak Ekstraselüler Akı Analyzer gibi kullanmak için standart teknikler genişletir; Diğer dışı akı ölçüm biçimleri (örneğin, XF e 96 ya da XFP) için, aşağıdaki tüm birimler uygun ölçekli edilmelidir. Deney ortamı tampon gücü, kalibre edilmiş bir pH sondasını kullanarak ya doğrudan hücre-dışı akı platformda veya ayrı olarak, standart bir eğri elde ile ölçülebilir. Burada dışı akı deney ortamı ile tamponlama ölçmek için üç seçenek tüm Injecti kullanarak da dahil olmak üzere, verilenHücre içermeyen örnek kuyu veya hücre içeren kuyu (bölüm 1) veya harici pH ölçümü (bölüm 2) kullanılarak yalnızca son enjeksiyon portu kullanarak dışı akı analizör portları. Örnek verileri tam hesaplamalar için ekli elektronik tablo bakın. Hücre dışı akı enstrümanın pH tespit yeteneğini kullanarak tamponlama gücünü ölçmek için, sinyal değişimi en aza indirmek için hücre içermeyen kuyuları kullanmak için güvenli olduğunu. Bununla birlikte, hata payı içinde, anlamlı bir fark hücre içermeyen ve hücre ihtiva eden bu ölçümü gerçekleştirirken kuyu (veriler gösterilmemiştir) arasında bulunmaktadır. Not: Adım 1.7&#39;de tarif edilen varyasyon gürültüsü sinyalinin dezavantaj, ilave bileşikler ile ya da hücrelerin varlığı ile kazandırılan tamponlama herhangi bir potansiyel değişiklikler hesaba olanaklar taşır. Yukarıda belirtildiği gibi, ancak, önemli bir fark, Tablo 1 &#39;de gösterilen hücre içermeyen tasarım arasında hesaplanan tamponlama gücü bulunan veBurada tarif edilen deney koşulları altında, Tablo 2&#39;de sonrası deney tasarımı. Ayrıca, küçük ΔpH aralıkları (&lt;0.4 ünite, deneysel iyi 0.2 ünite ile sınırlı) üzerinden, doğrusal eğimi Δ mph / pmol H çizilerek elde + yeterince ΔpH ve [H +] ile logaritmik bir ilişki yakındır. Bu standart eğrinin eğimi dolayısıyla 7 ul pH / nmol H + test edilen deney ortamı tamponlama gücünü temsil, veya mph / pmol H + 7 ul. Biz orta tamponlama gücünün artırılması ya da ölçüm süresinde 0.2 pH birimi değişikliği aşan numuneler için hücre yoğunluğu azalan öneririz. Ölçüm süresi de azalmış olabilir, ama bu kararlı hal asitlenme hızının kısaltmak ve hızı hesaplama içine hatayı tanıtmak olabilir.

<table><tbody><tr><td>Pherastar FS</td><td>BMG</td><td>n/a</td><td>microplate reader</td></tr><tr><td>Seahorse XF-24</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>n/a</td><td>extracellular flux instrument</td></tr><tr><td>Seahorse XF assay plate</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>V7-PS</td><td>consumable</td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td>solution</td></tr><tr><td>HCl standard</td><td>Sigma</td><td>38280</td><td>chemical</td></tr><tr><td>oligomycin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>chemical</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>chemical</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>chemical</td></tr><tr><td>Myxothiazol</td><td>Sigma</td><td>T5580</td><td>chemical</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>medium component</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>medium component</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>medium component</td></tr><tr><td>carbonic anhydrase</td><td>Sigma</td><td>C2624</td><td>chemical</td></tr><tr><td>96-well assay plate</td><td>Corning</td><td>CLS3991</td><td>consumable</td></tr><tr><td>NAD&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>N7004</td><td>chemical</td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td>chemical</td></tr></tbody></table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> Şekil 2 tipik bir deney için ham verileri gösterir. OCR ve pH (dikey barlar gölgeli) hem de point-to-point kayıt son 10 ölçüm noktası hesaplamalar için kullanılmıştır. İlk endişeler her tahlil döngüsünün ortalama değeri (orta noktası ölçümü), dışarı kaynaklı değildi liman ilave ve sürekli hal asitlenme hızının arasında hafif bir gecikme ortaya çıktı özellikle de doğru bir hesaplama için oran yeterli çözünürlüğü sağlamak olmaz Bu hesaplama hatası önemli ölçüde katkıda görünmüyor gibi (gösterilmemiştir). Doğru tamponlama kapasitesi deneysel kurulum sırasında girilen Alternatif olarak, eğer PPR enstrüman yazılımında veya veri çıkış ayarları biri olarak mevcut PC uyumlu bir biçimde PPR çıkışı göstererek enstrüman veri toplama okuma doğrudan okunabilir. ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2, O ve H + 2. Örnek hücre dışı akı izleri. OCR ve pH deney başlangıcında 10 mM glükoz ihtiva eden, Tablo 5 &#39;de bir örnek deney için izler. D çıkışı (bu ortalama izleri gösterilmemiştir) tampon gücü kalibrasyonu için farklı HCl konsantrasyonları. Önceki yayında 6 veriler. Her nokta n = 8 biyolojik çoğaltır ortalama ± SEM temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Temsili sonuçlar Veri analizi -Tabloyu Tablo 6&#39;da gösterilen bir ek olarak sağlanır kullanılarak, tek tek oyuklara veri değerleri sarı başlıkları ile gösterilen sütunlar girilebilir. Altı sütunları<html> Sağ bu girdileri hesaplanır. Tablo 6&#39;da örnek PPR resp ile ya da ekledi glikoz olmadan doğal koşullar, oligomycin önceki Limanı bir ek için ayrı kuyudan ECAR ve OCR verileri kullanılarak PPR glisin hesaplamalarını gösterir. Her biyolojik hazırlık Teknik çoğaltır normalde son dört sütun halinde çıkışların tek değerleri vermek için ortalaması alınır, daha sonra farklı biyolojik hazırlıklar veri hatası BP istatistik ve bu dört değerlerin uygun yayılımı ile ortalaması alınır. <img alt="Tablo 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> Tablo 6. Solunum ve glikolitik asitlenme hesaplanması. Sarı başlı Sütunlar değerler hesaplamadan girilecek gösterir (örneğin, BP, max H + / O 2), ya da veri toplama (örn, ECAR tot, OCR).<html> ps: //www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu tablonun büyük halini görmek için tıklayınız |. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">tıklayınız bir Excel elektronik olarak bu tabloyu indirmek için .</a> Düzeltme sonrası PPR için glikoliz ve solunum Katılımlar Şekil 3 FCCP ek (Liman B) Aşağıdaki yerli glikolitik ve solunum asidifıkasyon oranları, ek (Liman A) oligomycin aşağıdaki oranlara ve oranları Tablo 6&#39;daki olarak hesaplanan verilerin grafiksel çıkışını gösterir. Bu veriler açıkça substrat seçimi ile solunum ve glikolitik asitlenme değişim oranları (hiçbiri ile kontrol (CTL vs glikoz) eklenmiştir) nasıl göstermek ve mitokondriyal durumu (yerli fonksiyon vs farmakolojik fonksiyonu değişmiş) ile. &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> Glikolitik ve solunum kaynaklardan Şekil 3. Proton üretim hızı (PPR). Solunumla PPR (açık kısımları) ve katma glukoz (üç sol çubuklar) veya katma glikoz (üç sağ çubuklar olmadan) Denklem 5 kullanılarak hesaplanan C2C12 hücrelerinin glikoliz (dolu bölümleri). 6 ila veriler. Tüm veriler n ± SEM = 8 biyolojik çoğaltır ortalama temsil etmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate at JoVE.com

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

measurement-analysis-extracellular-acid-production-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

25.1K Görüntüleme.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Video: Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Kanser Araştırmaları

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration and differentiation, and cytokine production. All of these events are tightly linked to the energy status of the cell, and therefore studying the energy-producing pathways may give clues about the overall functionality of these cells. The extracellular flux analyzer is a commonly used device for evaluating the performance of glycolysis and mitochondrial respiration in many cell types. This system has been used to study immune cells in a few published reports, yet a comprehensive protocol optimized particularly for lymphocytes is lacking. Lymphocytes are fragile cells that survive poorly in ex vivo conditions. Oftentimes lymphocyte subsets are rare, and working with low cell numbers is inevitable. Thus, an experimental strategy that addresses these difficulties is required. Here, we provide a protocol that allows for rapid isolation of viable lymphocytes from lymphoid tissues, and for the analysis of their metabolic states in the extracellular flux analyzer. Furthermore, we provide results of experiments in which the metabolic activities of several lymphocyte subtypes at different cell densities were compared. These observations suggest that our protocol can be used to achieve consistent, well-standardized results even at low cell concentrations, and thus it may have broad applications in future studies focusing on the characterization of metabolic events in immune cells.

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Bir Optimize Protokol Lenfositlerindeki Glikoliz ve Mitokondriyal Solunum Analiz

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. Macrophages are commonly classified as M1-like (inflammatory) and M2-like (anti-inflammatory) subtypes. M1-like macrophages are pro-inflammatory macrophages that get activated by LPS and/or pro-inflammatory cytokines such as INF-&#947;, IL-12 &#38; IL-2. M1-like polarized macrophages are involved in various diseases by mediating the host&#39;s defense to a variety of bacteria and viruses. That is very important to study LPS induced M1-like macrophages and their metabolic states in inflammatory diseases. M2-like macrophages are considered anti-inflammatory macrophages, activated by anti-inflammatory cytokines and stimulators. Under the pro-inflammatory state, macrophages show increased glycolysis in glycolytic function. The glycolytic function has been actively investigated in the context of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve, compensatory glycolysis, or non-glycolytic acidification using extracellular flux (XF) analyzers.
This paper demonstrates how to assess the glycolytic states in real-time with easy-to-follow steps when the bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are respiring, consuming, and producing energy. Using specific inhibitors and activators of glycolysis in this protocol, we show how to obtain a systemic and complete view of glycolytic metabolic processes in the cells and provide more accurate and realistic results. To be able to measure multiple glycolytic phenotypes, we provide an easy, sensitive, DNA-based normalization method for polarization assessment of BMDMs. Culturing, activation/polarization and identification of the phenotype and metabolic state of the BMDMs are crucial techniques that can help to investigate many different types of diseases.
In this paper, we polarized the na&#239;ve M0 macrophages to M1-like and M2-like macrophages with LPS and IL4, respectively, and measured a comprehensive set of glycolytic parameters in BMDMs in real-time and longitudinally over time, using extracellular flux analysis and glycolytic activators and inhibitors.

<meta charset="utf8"></head><body>Kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonu, kültürü, polarizasyonu ve glikolitik karakterizasyonu için kapsamlı bir yüksek verimli protokol

This protocol provides detailed and comprehensive methods for the isolation, culture, polarization, and measurement of the glycolytic metabolic state of live bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This paper provides step-by-step instructions with realistic visual illustrations for workflow and glycolytic assessment of BMDMs in real-time.

Kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonu, kültürü, polarizasyonu ve glikolitik karakterizasyonu için kapsamlı bir yüksek verimli protokol

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. In addition, photoreceptors also exhibit high aerobic glycolysis like cancer cells. Precise measurements of these metabolic activities can provide valuable insights into cellular homeostasis under physiological conditions and in disease states. High throughput microplate-based assays have been developed to measure mitochondrial respiration and various metabolic activities in live cells. However, a vast majority of these are developed for cultured cells and have not been optimized for intact tissue samples and for application ex vivo. Described here is a detailed step-by-step protocol, using microplate-based fluorescence technology, to directly measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration, as well as extracellular acidification rate (ECAR) as an indicator of glycolysis, in intact ex vivo retinal tissue. This method has been used to successfully assess metabolic activities in adult mouse retina and demonstrate its application in investigating cellular mechanisms of aging and disease.

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Described here is a detailed protocol for performing mitochondrial stress assay and glycolytic rate assay in ex vivo retinal tissue samples using a commercial bioanalyzer.

Ex Vivo Retinal Doku Örneklerinde Mitokondriyal Solunum ve Glikoliz Tayini

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Nörobilim

Analyzing Ex Vivo Metabolic Flux in Splenic and Cardiac Macrophages and Bone Marrow Monocytes

Metabolic reprogramming is a hallmark of monocyte/macrophage activation and polarization between pro- and anti-inflammatory states. For example, pro-inflammatory (i.e., M1-like) monocytes/macrophages display more reliance on anaerobic glycolysis and less reliance on mitochondrial oxidative phosphorylation, whereas anti-inflammatory (M2-like) macrophages display more reliance on glucose and fatty acid oxidation in the mitochondria. Here, we describe in-depth protocols for extracting macrophages from the two major monocyte/macrophage reservoirs in the body, the spleen and bone marrow, as well as injured tissues such as the heart following myocardial infarction.
Macrophages or monocytes are extracted by immunomagnetic sorting by using antibody-tagged microbeads, which easily bind to cells without compromising their phenotypes. The extracted cells are then cultured in 96-well plates, followed by extracellular flux analysis using a metabolic flux analyzer. Both glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation can be measured simultaneously in small numbers of cells (as little as 2-3 &#215; 105 cells). This method can easily be performed in 1 day and produces reliable and repeatable results. Ultimately, these methods help to enhance our understanding of metabolic changes during immune and inflammatory responses to injury and disease, which could lead to the development of novel therapeutic targets for immunometabolic pathways.

Here, we describe in detail methods for extracting macrophages from the bone marrow, spleen, and infarcted heart, and subsequently assessing metabolic flux in live cells.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Metabolic reprogramming is a hallmark of monocyte/macrophage activation and polarization between pro- and anti-inflammatory states. For example, ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Biyoloji

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Bir Optimize Protokol Lenfositlerindeki Glikoliz ve Mitokondriyal Solunum Analiz

İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi

Kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonu, kültürü, polarizasyonu ve glikolitik karakterizasyonu için kapsamlı bir yüksek verimli protokol

Kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonu, kültürü, polarizasyonu ve glikolitik karakterizasyonu için kapsamlı bir yüksek verimli protokol

Ex Vivo Retinal Doku Örneklerinde Mitokondriyal Solunum ve Glikoliz Tayini

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi