Name: an optimized method for isolating and expanding invariant natural killer t cells from mouse spleen
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen at JoVE.com

D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.

Bu çalışmada, yetişkin (6-8 haftalık) dişi C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Fareler Gent Üniversitesi vivaryum kurallarına göre muhafaza ve yetiştirilen. Tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Fare Dalak Mononükleer Hücreleri (MNC) hazırlanması 1. <ol><li> Servikal dislokasyon ile fare Kurban. </li><li> Geri aşağı diseksiyon gemide fare yerleştirin ve pimleri, arka ve ön ayaklarını düzeltmek. </li><li> % 70 ile deri yüzeyi sterilize (hacim / hacim) etanol / H2O </li><li> Toraks karın orta hat boyunca cildi kesin ve steril cerrahi aletler kullanılarak dalak maruz. </li><li> Çevresindeki yağ dokuları kırpma sonra, oda sıcaklığında 1 mi 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ihtiva eden bir 24 yuvalı plaka içine dalak yerleştirin. </li><li> Steril bir neşter kullanılarak dalak incelemek ve 50 ml&#39;lik küvet içine yerleştirilen 70 mikron naylon filtre içine parçaları aktarmake. </li><li> 2 ml şırınga pistonu kullanarak, yavaşça hücre süzgecinden dalak parçaları püre ve PBS 1x 5 ml ile yıkayın. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüpe Ficoll-Paque 3 ml ilave edilir ve 5 ml hücre süspansiyonu ile yoğunluk gradyan orta kaplar. </li><li> Fren RT&#39;de 20 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Taze bir 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer interfaz 4 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de 10 ml soğuk 1 x PBS ve santrifüj ekleyin. </li><li> % 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (FACS tamponu) içeren PBS 1x 2 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Aktarım, küçük hücre süspansiyonunun tüpe 10 ul,% 0.4 10 ul ile karıştırın </li></ol> 2. Zenginleştirme, Algılama ve Fare iNKT Hücreleri saflaştırılması <ol><li> Fare dalak CD5positive (CD5 +) lenfositlerin zenginleştirilmesi. <ol><li> (İsteğe bağlı) Leke 10 5 hücreleri FITC ile konjuge anti-CD5 (4 ul 1:30 seyreltme / 10 6 hücre)Karanlıkta 4 ° C&#39;da 30 dakika için, 200 ul FACS tamponu ve 500 tekrar süspansiyon FACS tamponu ul ile yıkayın. 1x PBS içinde 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içindeki bir 20 uM çalışma çözeltisi hazırlayın, FACS tampon maddesi içinde ul bunun için 10 5 hücre 1 ekleyin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Akış sitometresinde 10 4 önceden zenginleştirilmiş hücreleri edinin. <ol><li> FCS-H ve FCS-W, hücre çiftleri ve agrega (Şekil 1A) dışlamak için FSC-W lo hücreleri üzerinde elektronik kapıyı kullanma. Ardından elektronik kapı dışarı DAPI + (ölü) FSC-W lo nüfus (Şekil 1B) içinde hücreleri ve elektronik boyut (Şekil 1C) tarafından lenfosit nüfus seçmek için SSC-A ve FCS-A kullanın. </li><li> Lenfosit kapısı içinde hücreleri kullanarak, CD5 karşı SSC-A arsa ve Şekil 1D gösterildiği gibi elektronik kapı CD5 + lenfositlerin. Akış sitometresinde öncesi zenginleştirilmiş numunenin kalanını edinin. </li&gt; </ol></li><li> FACS tampon 90 ul başına 10 7 hücreleri hücre sayımı ayarlayın ve 10 ul anti-CD5 mikroboncukları ekleyin. </li><li> 4 ml FACS soğuk FACS tampon tampon ve tekrar süspansiyon 500 ul ile bir kez yıkanır, 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Manyetik hücre ayrıştırma (MACS) kullanarak CD5 + lenfositlerin üreticinin önerilerine göre sütunlar için zenginleştirin. </li><li> FITC ile konjuge anti-CD5 opsiyonel) Leke 10 5 hücreleri (2.1.1 olarak 1:30 seyreltme / 10 6 hücre) ve DAPI 4 ul. Akış 10 4 zenginleştirilmiş lenfositlerin sitometresinde Edinme ve elektronik kapıları 2.1.1 oluşturulan doğrulayın. zenginleştirilmiş hücresel fraksiyonu CD5 + lenfositleri seçin. Akış sitometresinde 10 5 hücreleri Edinme ve Şekil 1E gösterildiği gibi zenginleştirilmiş fraksiyonu CD5 + lenfositlerin mevcut yüzdesini analiz - H. </li></ol></li><li> Algılama ve fare iNKT ce izolasyonuFACS ile lls. <ol><li> Anti-CD16 / CD32 içeren FACS tamponda yaklaşık 10 6 hücre başına 20 ul ve PE-konjuge αGalCer (1:50 seyreltme / 10 6 hücre 4 ul) içindeki bir konsantrasyonda zenginleştirilmiş CD5 + lenfositleri yeniden süspanse / CD1d tetramer (1 ug / 10 6 hücre). </li><li> Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Fare antikorları (mAb &#39;ler), anti-CD3ε V500 (1:20 seyreltme 4 ul / 10 6 hücreleri), anti-CD 19 e450 (1:50 seyreltme 4 ul / 10 6 hücre) ve anti-CD8α e450 (4 ul seyreltik FACS tamponu içinde 1:50 seyreltme / 10 6 hücre), CD5 + lenfosit ekle ve karanlıkta 4 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 10 7 hücre / ml &#39;lik bir son konsantrasyonda 4 ml FACS tampon, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile tekrar süspansiyon 1 ml&#39;lik FACS tamponu ile hücrelerin yıkayın. </li><li> 30 mikron hücre süzgecinden hücreleri Filtre ve buz üzerinde hücreleri koyun. </li><li> Üretici tavsiyelerine göre 14,15 sıralama hücre sitometresinin akış kalibre. Not: hücre sıralama için bir akış sitometresinin Kalibrasyon eğitim gerektirir ve deneyimli bir operatör veya eğitimli bir teknisyen tarafından yapılabilir. </li><li> 10 6 hücre başına DAPI 20 uM çalışma çözeltisinin 10 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Akış sitometresinde yaklaşık 10 4 zenginleştirilmiş CD5 + lenfositleri edinin. FSC-W lo hücreleri üzerinde elektronik kapı hücre çiftleri ve agrega (Şekil 2A) dışlamak için. Ardından elektronik kapı dışarı DAPI + CD8 + FSC-W lo nüfus (Şekil 2B) içinde CD19 + hücreler (döküm kanalı) ve 2.1.1.1 de anlatıldığı gibi elektronik lenfositler (Şekil 2C) seçmek için SSC-A ve FCS-A kullanın . <ol><li> CD3ε ve elektronik kapı αGalCer / CD1d tarafından arsa αGalCer / CD1d tetrameriŞekil 2D&#39;de gösterildiği gibi, tetramer + CD3ε + iNKT hücreleri. Zenginleştirilmiş hücresel fraksiyonunda mevcut yüzde αGalCer belirlemek için en fazla 5 10 x 2 den CD5 + zenginleştirilmiş lenfositleri Edinme / CD1d tetrameri + CD3ε + iNKT hücreleri. </li></ol></li><li> 2.2.7 oluşturulan elektronik kapıları kullanma. &#39;1.5&#39; bir akış hızında 70 mikron meme kullanılarak sitometresinde 70 psi akışı üzerinde, FACS sıralama αGalCer / CD1d tetrameri + CD3ε + iNKT hücreleri. 1 ml% 100 FCS ihtiva eden bir FACS tüpü içinde sıralanmış iNKT hücreler toplanır. Daha sonra 10 mi RMPI 1640 ortamında ve santrifüj 4 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücreler, FACS tüpü yanından kriteri iNKT hücreleri yıkayın. </li><li> Yeniden süspanse 1640 ortamı RPMI 1 ml iNKT hücreleri kriteri ve sıralanmış iNKT hücrelerinin saflığı analiz etmek üzere bir akış sitometresi üzerinde ul bunların 40 kazanır. Lenfosit - FSC-W lo DAPI seçins 2.2.7 tarif edildiği gibi. Elektronik ve kapı αGalCer / Şekil 2H gösterildiği gibi CD1d tetrameri + CD3ε + iNKT hücreleri - (G Şekil 2E). </li></ol></li></ol> 3. Kültür ve Fare iNKT Hücrelerinin Genişleme Gün 0 <ol><li> Kaplama oda sıcaklığında 1 saat boyunca hazne başına saflaştırılmış anti-CD3ε (3 ug / ml) ile, dibi düz 96 oyuklu plaka. 200 ul PBS ve bir kez 1 x 200 ul tam RPMI 1640 ortamında (% 10 hacim / hacim FCS, 100 U / ml penisilin-streptomisin, 5.5 uM β-merkaptoetanol) ile iki kez yıkanır. </li><li> 1.11 olarak% 0.4, bir hemositometre kullanılarak uygulanabilir kriteri iNKT hücreleri (aşama 2.2.8) sayısı., Tam RPMI 1640 ortamında 5 x 10 5 hücre / ml&#39;de, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje tabi tutulur ve tekrar süspansiyon Rekombinant fare IL-2 (10 ng / ml), rekombinant fare IL-12 (1 ng / ml) ve çözünür anti-fare CD28 (5 ug / ml) ihtiva eden. Plaka sAnti-CD3ε kaplı plakalar iyi 10 5 hücre / iNKT hücreleri orted ve 2 gün bir CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Gün 2 <ol start="3"><li> 2 gün bir CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de komple RPMI 1640 ortamı taze bir kaplanmamış düz dipli 96 oyuklu bir plaka ve kültür dinlenme koşulları altında, hücreler aktarın. </li></ol> 4. Gün <ol start="4"><li> Nazik pipetleme plaka hücreleri çıkarmak ve taze bir 15 ml tüp hücreleri aktarmak. Bir düz-10 5 hücre / göz, 4 ° C, rekombine IL-7 (5 ng / ml) ihtiva eden komple RPMI 1640 ortamında 5 x 10 5 hücre / ml&#39;de tekrar süspansiyon ve plaka 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin Bir CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de 4 gün boyunca 96 plaka altlı. </li></ol> 8. Gün <ol start="5"><li> 300 x taze tüp hücreleri toplayın, santrifüjçözünür anti-CD28 (5 ug / ml) içeren tam RPMI 1640 ortamı içinde 5 x 10 5 hücre / ml&#39;de 10 4 ° C&#39;de dakika ve tekrar süspansiyon g. </li><li> Kaplama oyuk başına saflaştırılmış anti-CD3ε (3 ug / ml) ile, dibi düz 96 kuyucuklu bir plaka ve 3.1 gibi yıkayın. Levha 10 5 hücre / göz Anti-CD3ε kaplı plakalar ve gün 11 kadar bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Gün 11-18 <ol start="7"><li> Tekrarlayın 3.6 3.4 adımları tekrarlayın. </li></ol> Gün 19-20 <ol start="8"><li> Tam RPMI 1640 ortamında 5 x 10 5 hücre / ml&#39;de 300 x g&#39;de tekrar süspansiyon taze bir 15 ml tüp, santrifüj hücreleri aktarın. </li><li> Levha 10 5 hücre hücre / kuyuda bir düz tabanlı 96 oyuklu bir plaka ve izin hücreler bir deney içinde kullanılmadan önce bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 2 gün süreyle dinlenmeye. </li></ol> 4. Sitokin üretimi CD1d Plat Kullanarak Fare iNKT Hücreleri tarafındane bağlı Deneyi <ol><li> Coat düz dipli 96 gözlü oyuk başına rekombinan sıçangil CD1d 100 ul (1 x PBS içinde 10 ug / ml) ile plaka ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> PBS 1x 200 ul ile dört kez yıkayın oyuk başına 1 x PBS (bloke çözeltisi) içinde% 2 FCS, 200 ul ekleyin ve 37 ° C&#39;de 2 saat inkübe edilir. </li><li> Blokaj çözeltisi kaldır, göz başına αGalCer 200 ul (5 ng / ml) ekleyin ve 16 st için 37 ° C &#39;de plaka inkübe edin. [ΑGalCer çözeltinin hazırlanması için, bir araç 96 mg / ml sakroz, 10 mg / ml sodyum deoksikolat ve 5 mg / ml Tween 20 ihtiva eden içinde çözülmüş αGalCer 55 ug 1085 μ 1x PBS ekleyin]. </li><li> Kuluçkadan sonra, αGalCer çözeltisi atılır ve 200 ul tam RPMI 1640 ortamı, ardından PBS 1x 200 ul de iki kez yıkayın. </li><li> Tam R santrifüj hücreler 300 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de ve tekrar süspansiyon, 21. günde, in vitro genişletilmiş iNKT hücreleri toplamak0.5 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda PMI 1640 ortamı. </li><li> Oyuk başına iNKT hücre yeniden süspansiyon 200 ul ilave edin ve bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 72 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Üreticinin protokolüne göre, enzim bağlantılı immüno emici bir testle (ELISA) ile, ilgilenilen süpernatan ve ölçü sitokinler toplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells:+development,+specificity,+and+function.">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li><li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells.">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families.">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells.">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li><li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1-restricted+CD4++T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice.">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li><li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides.">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li><li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease:+a+joint+dilemma.">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity:+a+new+immunoregulatory+axis.">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li><li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity.">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li><li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids.">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li><li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1.">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li><li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection,+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells.">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li><li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li><li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+'real+time'.">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li><li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages.">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

Geçerli protokol kritik adımlar izolasyon ve CD5 + lenfositlerin (Bölüm 1 ve 2) sonraki zenginleştirme, FACS sıralama (Bölüm 3) ve iNKT hücrelerinin ilk kaplama (Bölüm 4) yer alıyor. Bölüm 1&#39;de gerçekleştirilen adımların dikkatle ayrı bir hücresel interfaz santrifüj takip üretildiği şekilde yoğunluk gradyan ortamı üzerinden dalak hücresel süspansiyon katman unutmayın. Manyetik hücre ayırma (Bölüm 2) tarafından CD5 + lenfositlerin müteakip zenginleştirme leke için gerekli reaktifleri ve zamanı en aza indirir ve artış iNKT hücre verimlerle sonrası çeşit yardımcı FACS sıralama iNKT hücreleri (Bölüm 3). Son olarak, bu hücresel apoptozda neden olabilir iNKT hücrelerinin daha yüksek sayılar ile kuyu tohumlama olarak kültür (Bölüm 4) ilk 2 gün boyunca oyuk başına en fazla 10 5 iNKT hücreleri tohum önemlidir. Ve / veya troubleshoo değiştirirken hususlar bir dizi önemliting Bu protokol: Birincisi, kullanılan hayvanların yaşı önemlidir. Ya çok eski, ya da aksesuar enfeksiyonları Hayvanlar, izole ayırt yeteneğinizi engel ve dalak FACS sıralama yeterli hücreler olabilir. ΑGalCer / CD1d tetramerleri ile boyanarak İkincisi, bu + çok yüksek bir ses sırayla tetramer kümeleme azaltır αGalCer / CD1d tetramer, boyama etkinliğini dışarı sulandırır olarak PBS hücrelerin hacim düşük tampon tutmak önemlidir FACS ile iNKT hücreleri. İdeal olarak, FACS edinimi sırasında sıkı kümelenmiş αGalCer / CD1d tetrameri + iNKT hücrelerinin varlığı FACS ile daha doğru yolluk sağlar ve sonrası sıralama analizi sırasında yüksek oranda saflık iNKTs verir. Alt sıralı iNKT hücre verimleri kültürü sırasında diğer kirletici T hücre popülasyonlarının akıbet neden olacağı için bu önemlidir. Üçüncüsü, sürekli iNKT ce kültür ve genişleme sırasında sarı olur orta yenilemeklls. Örneğin, özellikle gün 8 ve kültür gün 11 sırasında uygun sitokinler ihtiva eden yeni ortam ile sararmış ortamın% 50&#39;sini. iNKT hücre verimleri bu şekilde maksimize edilebilir. Bildiğimiz kadarıyla bu fare dalak izolasyonu ve iNKT hücrelerinin zenginleştirilmesi için bir yoğunluk gradiyenti ve CD5 + lenfosit zenginleştirme aşamasını içeren ilk iNKT genişleme protokolüdür. Alternatif bir kısım yaklaşımlar, αGalCer / CD1d dimerler 13 de dahil olmak üzere dalak iNKT hücreleri zenginleştirmek üzere araştırılmıştır, manyetik hücre ayırma 9 tarafından Vα14 TCR Tg fareleri 10 yanı sıra dışı T hücrelerinin tükenmesi. INKT hücreleri başarılı bir şekilde bu yaklaşımları kullanılarak in vitro genişletilebilir Ancak, her ne, bu tür yöntemler, sadece 10 transgenik iNKT hücreleri oluşturmak, iNKTs 13 zenginleştirmek ya da eş zamanlı olarak bazı non-iNKT hücre çizgileri yol vermek için αGalCer / CD1d dimerlerin büyük miktarlarda ihtiyaç duyulmakta ya 9 &lt;/ sup&gt;. Ayrıca, plaka bağlı anti-CD3ε kullanımı korumak ve sıralı iNKT hücreleri (Bölüm 4) genişletmek vitro 9 iNKT genişleme sırasında aktive APC&#39;ler için bir gereklilik engellemektedir için. Bu bağlamda, bir APC içermeyen iNKT genişletme protokolü, in vivo olarak enjeksiyondan önce genişletilmiş iNKT hücrelerinden APC&#39;ler ayırmak zorunda olmamak avantajına sahiptir. Ancak aynı zamanda açıklanan protokol araştırmacı kalibre ve FACS sıralayıcı işletmek, kolay erişim, yanı sıra ilgili eğitim gerektirir gerçeği ile sınırlı olduğunu eklemek gerekir. Ne yazık ki FACS seçmeler pahalıdır ve her laboratuarda her zaman mevcut değildir. Geçerli protokol izole edilmesi ve kültürü sıçangil iNKT hücreleri için optimize edilmiş olmasına rağmen Bununla birlikte, bu tarifnamede tarif edilen zenginleştirme adım diğer nadir T zenginleştirmek ve karakterize etmek için, aynı zamanda iNKT son timik göçmenler (oturan RTE&#39;ler) 16 izole etmek ve incelemek için kullanılabilir ve uyarlanabilir FACS ile hücre popülasyonları. 8 iNKT hücreleri kadar üretmek için kullanılabilecek bir optimize edilmiş bir yaklaşım tanımlar. Bu şekilde oluşturulan iNKT hücreleri adoptif transfer deneyleri ve in vivo iNKT hücre biyolojisi çalışma için faydalı hale, stimülasyon üzerine sitokin salgılama kabiliyetini muhafaza eder.

Mürin değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri CD1d-ifade kortikal timositleri 1,2 ile timus seçilen doğuştan T lenfositlerinin farklı bir nüfus vardır. iNKT hücreleri Vβ8, Vβ7 ya CD1d bağlamında endojen yanı sıra dış lipid antijenlerini tanıma yeteneğine sahip olan Vβ2 TCRler 3 ya ile eşleştirilmiş değişmeyen bir Vα14-Jα18 TCR zinciri içeren bir T hücre reseptörü (TCR) ifade etmektedir. Örneğin, kemirgen iNKT hücreleri tanıyan ve endojen yağ antijen olarak adlandırılan isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, hem de α-galaktozilseramid (αGalCer) 5,6, deniz süngerlerinden izole edilen bir glikolipid ile aktive edilir. TCR bağımlı &lt;iNKT hücrelerinin aktivasyonu adaptif bağışıklık tepkilerinin teşvik hazırlanmasını, ve bunun sonucu olarak, iNKT hücreleri romatizmal hastalık 7 ve kanser dahil patolojilerin bir dizi iyileştirilmesi ya da geliştirme işlevsel olarak ilgili olduğu gösterilmiştirsup&gt; 8. Şu anda, sentetik iNKT hücre ligandlar immünopatolojik koşulları bir dizi düzenleme yeteneğine sahip olabilir umut vadeden yeni bir aşı yardımcı maddeleri oluşturmaktadır. Bu, daha önce iNKT hücreleri, ancak fare dokusundan izole aşağıdaki in vitro üretilebilir olduğu ortaya konmuştur; Bu çalışmaların bir çoğunda primer antijen sunan hücreler (APC&#39;ler) ve / veya hücre çizgileri 9 kullanımından yararlanmakta, Vα14 TCR transjenik (Tg) iNKT-hücresinden alınan hibridomadan 11,12 üretimi için farenin 10 veya timomalar. Bundan başka, farelerin çok sayıda, örneğin αGalCer yüklü CD1d dimerler ve uzun kültür zamanlarında gibi reaktiflerin yüksek hacimli bir yayınlanmış protokoller az etik ve ekonomik 9,13 çekici hale. Bu yazıda izolasyon ve fare dalak iNKT hücrelerin in vitro genişlemesi uyarlanmış bir yöntem tarif eder. Daha özel olarak ise, Protokol bir yöntem tarifFACS hücre sıralama için gerekli fareler, reaktifler ve süresini azaltır, ve in vitro sıralanan dalak iNKT hücrelerini genişletilmesi için optimize edilmiş bir yaklaşım önermektedir fare dalak iNKT hücrelerini zenginleştirmek için.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD8&amp;alpha; (53-6.7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500-conjugated anti-mouse CD3&amp;epsilon; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; - free]</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate F-bottom</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tube</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tube</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m filter</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separator</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Water-jacketed CO2 incubator</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Kit</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized method for isolating and expanding invariant natural killer t cells from mouse spleen

Hızla stimülasyon üzerine sitokinleri yeteneği değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücre soyunun işlevsel bir özelliğidir. iNKT hücreler bu bağışıklık yanıtlarını aktive ve direksiyon adaptif yeteneğine sahip doğuştan gelen bir T hücresi popülasyonu olarak karakterize edilir. Murin iNKT hücrelerin kültürü ve genişleme için geliştirilmiş tekniklerin geliştirilmesi, in vitro ve in vivo model sistemlerinde de iNKT hücre biyolojisi üzerinde çalışmayı kolaylaştırmaktadır. Burada, izolasyon ve murin splenik iNKT hücrelerinin genişlemesi için optimize edilmiş bir prosedürü açıklar. C57BL / 6 farelerinden alınan dalak çıkarılır, parçalara ayrılır ve süzülmüş ve elde edilen hücresel süspansiyon yoğunluk gradyan ortam üzerine yayıldı edilir. Santrifüj sonrasında, dalak mononükleer hücreler (MNC) toplanır ve CD5-pozitif (CD5 +) lenfositler manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirilmiştir. CD5 + fraksiyonu içinde iNKT hücreler daha sonra ^ ile boyanır5; CD1d tetramer GalCer yüklenmiş ve flöresanla aktive edilen hücre tasnif (FACS) ile saflaştırılmıştır. FACS murin yeniden birleştirici IL-7 varlığında genişletilmiş önce rekombinan sıçangil sitokin ve plaka bağlı T hücresi reseptörü (TCR) uyaran bir kombinasyonu kullanılarak iNKT hücreleri başlangıçta daha sonra in vitro olarak kültürlenir kriteri. Yaklaşık 10 8 iNKT hücreleri in vitro fonksiyonel deneyleri için ya da farelerde in vivo transfer deneyleri için de kullanılabilir ve bundan sonra kültür 18-20 gün içinde elde edilebilir Bu tekniği kullanarak.

Yoğunluk gradyanı kullanılarak dalak mononükleer hücrelerinin izolasyonu, yaklaşık 1 saat sürer ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) lize için gerekli reaktiflerin kullanımını ortadan kaldırır. Canlı hücreler yüksek verim alınır organın süzme sırasında üretilen bu yöntem ve tortuyu kullanılarak elde edilir. Tipik olarak, dalak lenfosit havuzu içinde iNKT hücrelerin frekansı, bu kullanılan hayvanların yaş, cinsiyet, sağlık durumuna bağlı olarak değişebilir, ancak toplam T lenfositlerin% 1 ila 5 arasında değişmektedir. Yaklaşık 10 6 iNKT hücreleri 6-8 haftalık farelerin dalaklarından elde edilen 3 farelerin dalakları ve toplanmış iNKT hücrelerin en yüksek verimle elde edilebilir. Fare anti-CD5 manyetik boncuk kullanımı önemli ölçüde CD5 antijeni eksprese B lenfositlerinin küçük bir popülasyonundan dışında, dalak MNC fraksiyonu içinde iNKT hücreler için zenginleştiren ve bu yöntem kullanılarak izole hücrelerin çoğunluğu CD5 + lenfo teşkillenfositler. Örneğin, CD5 zenginleştirme sonra elde edilen çokuluslu şirketlerin% 5-8 CD5 negatif (Şekil 1H) bulunmaktadır. ΑGalCer / CD1d tetramer ve anti-fare CD3ε Ancak 98% üzerinde iNKT hücre saflık elde edilir, dalak B ve CD8 T hücreleri için FACS döküm kanalı sırasında sıralama &#39;yapışkan&#39; lenfosit popülasyonunu ortadan kaldırmak için kullanılmalıdır birleştiren ayırma iNKT hücre FACS için. Buna ek olarak, kapı dışarı CD5 zenginleştirme aşamasında oluşmuş olabilecek ikili. Bu FACS kurulumu kullanarak,% 99 mertebesinde (Şekil 2H) içinde iNKT hücre saflık sonrası çeşit elde ettik. IL-2, IL-12 ve çözünür anti-CD28 mevcudiyetinde plaka bağlanan anti-CD3ε 10 6 kriteri iNKT hücreleri teşvik kültür 2 gün (Şekil 3), aşağıdaki iNKT numaralarının 3-kat genişletilmiştir. Kültür içinde 4 gün mevcut iNKT hücrelerinin sayısında bir 3- 4 katlık bir artışa, IL-7 sonuç mevcudiyetinde sonraki genişleme iNKT hücreleri. Notably, bu kültürleme koşulları yinelenen farklı günlerde kültür ortamında değişiklikleri arasındaki hücrelerin herhangi bir görünür kaybı (Şekil 3) olmadan genişleme iki tur sonra 7 x 10 7 iNKT hücrelerinin ortalama verim alınabilir. Bu nedenle, murin splenik iNKT hücreler, en az 18 gün, bu koşullar kullanılarak 70 kat genişletilebilir. Ayrıca αGalCer yüklü plaka bağlı yeniden birleştirici sıçangil CD1d ile uyarma yoluyla genişletilmiş iNKT hücrelerinin sitokin üretim kapasitesine değerlendirildi. 48 saat sonra stimülasyon &#39;de, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α ve IL-6 ELISA ile kolaylıkla kültürü süpernatanlarında saptanan edilebilir (Şekil 4). Genişletilmiş iNKT hücreler bu Th1 ve Th2 sitokinlerinin sonrası genişleme üretme yeteneğini muhafaza eder. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53256/53256fig1.jpg" /> CD5 + için Şekil 1. ZenginleştirmeFare dalak ÇUŞ gelen lenfosit. Önceden zenginleştirilmiş (MS) içinde mevcut CD5 + lenfositler ve manyetik hücre ayrıştırma zenginleştirilmiş (EH), fare dalak MNC süspansiyonların yüzde analiz etmek için Yolluk stratejisi. Hücre ikili (A, E) ve ölü hücreleri (B, F) sırasıyla FSC-A araziler karşı FCS-W ve DAPI karşı FSC-H kullanılarak çıkarılmıştır. Lenfosit kapısı öncesi ve zenginleştirme sonrasında (C, G) içinde mevcut yüzde CD5 + hücrelerinin D ve H gösterilmektedir sırasıyla. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53256/53256fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53256/53256fig2.jpg" /> incir<html> ure CD5 zenginleştirilmiş dalak çok uluslu şirketler gelen iNKT hücreleri sıralama 2. FACS. Yüzde αGalCer analiz etmek için Yolluk strateji / önce mevcut CD1d tetrameri + CD3ε + iNKT hücreleri (A - D) ve (E - H) sonra FACS sıralama. Yolluk stratejisi FSC karşı FCS-W ve DAPI, CD8 ve CD19 (döküm kanalı) karşı FSC H çizilmesi hücre çiftleri (A, E), ölü hücreleri ve analizden CD8 + CD19 + lenfositleri (B, F) ortadan kaldırır A, sırasıyla. Yüzde αGalCer / önce ve sonra olan limfosit FACS sıralama vanasına (C, G) içinde mevcut CD1d tetramer + CD3ε + iNKT hücreleri, sırasıyla, (D) ve (H) &#39;de gösterilmiştir. CD1d-Tet., ΑGalCer / CD1d Tetramer.= &quot;_ blank&quot; olsun&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53256/53256fig3.jpg" /> In vitro üretilen iNKT hücrelerinin Şekil 3. mutlak sayısı. In vitro genişleme 3 hafta sonra belirtilen zaman noktalarında iNKT hücrelerinin sayısında artış katlayın. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53256/53256fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53256/53256fig4.jpg" /> Şekil 4. Sitokin in vitro genişletilmiş iNKT hücrelerinin üretim kapasitesi. Gün 20 genişletilmiş iNKT hücrelerinin fare αGalCer yüklü CD1d ile in vitro olarak uyarıldı. 72 saat üst fazlan toplanır ve I varlığı bakımından analiz edilmiştirFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 ve IL-6 ELISA ile. Barlar SEM (n = 2). Temsil <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53256/53256fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen at JoVE.com

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

an-optimized-method-for-isolating-expanding-invariant-natural-killer

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Görüntüleme.  Ghent University Hospital. Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents. 

Video: An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

Vitro ve In Vivo değerlendirme T, B ve Myeloid hücrelerin süpresif etkinlik ve nakli alıcılardan gelen Humoral yanıt

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) face and is frequently associated with a poor clinical outcome. While, for instance, GvHD manifestations of the skin are usually responsive to established immune-suppressive therapies and are, hence, not taking a fatal course, the presence and the intensity of intestinal GvHD, especially of the mid-to-lower parts of the gut, strongly influence the outcome and overall survival of patients with acute GvHD. Therapeutic options are essentially limited to the classic immune-suppressive agents yielding only moderate disease-mitigating effects. Hence, detailed knowledge about the tissue-resident immune cascade, changes in the intestinal microbiota, and the stromal response prior, upon, and after intestinal GvHD onset are urgently needed to understand the events and mechanisms underlying its pathogenesis and to develop innovative therapeutic options. Murine models of GvHD are frequently employed to identify and functionally assess molecules and pathways putatively driving intestinal GvHD. However, means to specifically monitor and evaluate intestinal inflammation over time are essentially lacking since established scores to assess and grade acute GvHD are routinely comprised of various parameters which rather reflect&#160;systemic GvHD manifestations. The detailed evaluation of intestinal GvHD has been restricted to studies using euthanized mice, thereby essentially excluding longitudinal (i.e., kinetic) analyses of the colonic compartment under a given experimental condition (e.g., antibody-mediated blockade of a proinflammatory cytokine) in live mice (i.e., in vivo). The mini-endoscopic in situ assessment of the distal colon of allo-HCT-treated mice described here allows a) a detailed macroscopic evaluation of different aspects of intestinal inflammation and b) the option to collect tissue samples for downstream analyses at various time points over the course of the observation period. Overall, the mini-endoscopic approach provides a major advance in preclinical noninvasive monitoring and assessment of intestinal GvHD.

Here, we present a protocol that describes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and allows repetitive mini-endoscopic evaluations of the distal colon in situ for the presence, characteristics, and severity of colonic inflammation within live mice suffering from intestinal graft-versus-host disease.

İndüksiyon bağırsak Graft - versus - host hastalığı ve canlı fareler, Mini-endoskopik değerlendirme

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or microbial lipid antigens presented by the non-polymorphic MHC class I-related molecule CD1d. Preclinical and clinical studies support a role for iNKT cells in cancer, autoimmunity and infectious diseases. iNKT cells are very conserved throughout species and their investigation has been facilitated by mouse models, including CD1d-deficient or iNKT-deficient mice, and the possibility to unequivocally detect them in mice and men with CD1d tetramers or mAbs specific for the semi-invariant TCR. However, iNKT cells are rare and they need to be expanded to reach manageable numbers for any study. Because the generation of primary mouse iNKT cell line in vitro has proven difficult, we have set up a robust protocol to purify and expand splenic iNKT cells from the iV&#945;14-J&#945;18 transgenic mice (iV&#945;14Tg), in which iNKT cells are 30 times more frequent. We show here that primary splenic iV&#945;14Tg iNKT cells can be enriched through an immunomagnetic separation process, yielding about 95-98% pure iNKT cells. The purified iNKT cells are stimulated by anti-CD3/CD28 beads plus IL-2 and IL-7, resulting in 30-fold expansion by day +14 of the culture with 85-99% purity. The expanded iNKT cells can be easily genetically manipulated, providing an invaluable tool to dissect mechanisms of activation and function in vitro and, more importantly, also upon adoptive transfer in vivo.

We describe a rapid and robust protocol to enrich invariant natural killer T (iNKT) cells from mouse spleen and expand them in vitro to suitable numbers for in vitro and in vivo studies.

In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Isolating Invariant Natural Killer T Cells from a Mouse Model

Source: Meng, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60048">Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video illustrates a method for isolating invariant natural killer T cells, also known as iNKT cells. The procedure begins with injecting a synthetic glycolipid into a mouse to stimulate the activation and proliferation of iNKT cells in the spleen. Subsequently, single-cell suspensions are prepared from the spleen and incubated with iNKT-cell-recognizing complexes labeled with fluorophores, followed by magnetic bead-based separation, to isolate the iNKT cells.

Bir Fare Modelinden Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin İzole Edilmesi

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünoterapi

Hücresel İmmünoterapi

T-Cell Enrichment: A Technique to Isolate T-Cells from Mixed Cell Population by Magnetic Separation

Source: Nguyen, H. D., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/t/60083">Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes T-cells enrichment from the spleen of a mouse by negative selection using a magnetic separator. The technique involves targeting the other cells in the sample for depletion using antibodies or ligands directed against specific cell surface antigens.

T-Hücresi Zenginleştirme: Manyetik Ayırma ile Karışık Hücre Popülasyonundan T-Hücrelerini İzole Etme Tekniği

Source: Nguyen, H. D., et al. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. ...

Kanser Araştırmaları

Lösemi

Hayvan modeli çalışmaları

Induction of Graft Versus Host Disease in Mouse Models via Allogeneic Bone Marrow and Splenic Cell Transplantation

Source: Buchele, V., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58871">Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates the induction of intestinal graft-versus-host disease, GvHD, in a lethally-irradiated recipient mouse using allogeneic hematopoietic stem cells and GvHD-inducing splenic alloreactive T lymphocytes. This protocol helps establish a severe acute intestinal GvHD model to understand the mechanism of the disease and develop innovative therapeutic options.

Allojenik Kemik İliği ve Splenik Hücre Nakli ile Fare Modellerinde Graft Versus Host Hastalığının İndüksiyonu

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. GvHD ...

İmmünopatoloji

Konak-Patojen Etkileşim Modelleri

Nanoparticle-Based Enrichment and Expansion of Antigen-Specific CD8+ T Cells

To isolate antigen-specific CD8-positive T cells, macerate the spleens and lymph nodes from wild-type C57Black/6j mice through a sterile 70-micrometer cell strainer with frequent PBS rinses, and use a no-touch CD8-positive T cell isolation kit, according to the manufacturer&#39;s instructions, to eliminate the non-CD8-positive T cells.
After counting, collect the isolated CD8-positive T cells by centrifugation, and resuspend the pellet in 100 microliters of PBS, supplemented with 0.5% bovine serum albumin and 2-millimolar EDTA.
Then, incubate the cells with the nanoparticle artificial antigen-presenting cells such that there are 1 x 1011 peptide-loaded MHC-Ig, per 1 x 106 isolated CD8-positive T cells in a sterile 5-milliliter polystyrene round-bottom tube for 1 hour at 4 degrees Celsius with continual mixing.
At the end of the incubation, wash the nanoparticle cell suspension three times on the magnetic stand as demonstrated, re-suspending the artificial antigen-presenting cells and the enriched CD8-positive T cells in 500 microliters of fresh supplemented medium with 1% T cell growth factor, after the last wash.
For maximum cell recovery, it is critical to leave the particles in cells on the magnetic column for at least 2 minutes, and to aspirate the buffer carefully without disrupting the particles and cells subject to the magnetic field.
After counting, seed 2.5 x 105 enriched CD8-positive T cells and magnetic particle mixture per 160 microliters of supplemented medium plus 1% TCGF in a 96-well U-bottomed plate. On day three, feed the cells with 80 microliters of supplemented medium with 2% T cell growth factor per well, and return the plate to the cell culture incubator for four more days.
On day seven, harvest the stimulated cells into a 5-milliliter round-bottom tube for counting, and collect the cells by centrifugation. Resuspend the pellet in 0.5 milliliters of PBS supplemented with 0.05% sodium azide and 2% fetal bovine serum for counting, and aliquot 5 x 104 to 5 x 105 cells into new 5-milliliter round bottom tubes for antigen-specific staining.
Label the appropriate tubes with biotinylated MHC-Ig and anti-mouse CD8a for 1 hour at 4 degrees Celsius, followed by a centrifuge wash in fresh PBS, to remove any excess biotinylated immunoglobulin. Then, stain the samples with an appropriate streptavidin-conjugated secondary antibody, and an appropriate live/dead fixable dead cell stain for 15 minutes at 4 degrees Celsius, and read the cells on a flow cytometer to determine the specificity and number of the antigen-specific CD8-positive T cells, according to standard protocols.

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare Naif CD4