Name: sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions
Uploaded: 2015-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions at JoVE.com

The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.

Dorsal Yüzeyler 1. Üretimi <ol><li> Çözücü döküm tarafından PLLA düz bir filmin üretimi. <ol><li> Oda sıcaklığında tam olarak (yaklaşık 3 saat) çözününceye kadar (RT) karıştırılarak% 2 bir çözeltisi, kloroform içinde (ağ / hac) PLLA (100 mi kloroform içinde 2 g PLLA) hazırlamak üzere, bir çeker ocak içinde çalışır. </li><li> Cam Petri kabı pulları yerleştirin. Not: (ventral Örnek çapından biraz daha küçüktür) 10.5 mm&#39;lik bir iç çapa sahip ve paslanmaz çelik çamaşır yıkama ventral alt-tabakanın üzerine yerleştirilir ve böylece. Örneğin politetrafloroetilen (PTFE) veya cam pullar gibi başka malzemeler de kullanılabilir. </li><li> Yıkayıcı PLLA çözeltisi 200 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça buharlaşmasına izin verin. Çözücünün düşük buharlaşmasını sağlamak amacıyla, birkaç delik ile alüminyum folyo ile Petri kabı kapatmak. </li><li> Çözücü izleri buharlaştırılması için 5 dakika boyunca 120 ° C &#39;de örnekleri ısıtın. </li><li> Numuneler yapmak serin yapalımRT&#39;de wn. </li><li> Numuneler (30 dk yaklaşık) soğuduktan sonra, Petri kabındaki · cm su M 18.2 ile kaplayın ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe. Not: örnekler tamamen soğuduktan değilse, bunlar · yukarı cm su M 18.2 alıp bir lastik devleti kabul edebilir. Buna ek olarak, daha az 8 dakika boyunca · cm su 18.2 kuluçka uygunsuz dekolmanı ve yıkama ayrıldıktan fazla 8 dakika boyunca neden olabilir. </li><li> Bir jilet ile, Petri kabı onları kalkmasına pulları kaldırın. </li><li> Cımbız ile yıkama kenarından herhangi bir kusurları çıkarın ve numuneler hava kurumaya bırakın. </li><li> PLLA hidroliz ile parçalanabilir olduğu için deney gününe kadar bir vakum kurutma cihazı (80 mbar) örnekleri saklayın. </li></ol></li><li> Elektrospinning tarafından PLLA liflerinin üretimi. <ol><li> Karışması sağlandı göre heksaflorizopropanol içinde bir% 8 çözeltisi (ağırlık / hacim) PLLA (100 mi heksaflorizopropanol içinde 8 g PLLA) hazırlamak üzere, bir çeker ocak içinde çalışmatamamen çözülene kadar oda sıcaklığında ing (3 saat, yaklaşık). </li><li> Sırasıyla, rastgele ya da düzenli fiber elde etmek için, bir alüminyum levha veya Elektrospinning bir tambur üzerinde, politetrafloroetilen (PTFE), çamaşır makineleri yerleştirin. Not: (ventral Örnek çapından biraz daha küçüktür) 10.5 mm&#39;lik bir iç çapa sahip kullanımlar politetrafloroetilen (PTFE), çamaşır yıkama ventral alt-tabakanın üzerine yerleştirilir ve böylece. Örneğin, paslanmaz çelik ya da cam pullar gibi başka malzemeler de kullanılabilir. Tambur hizalanmış fiberler elde etmek için 160.7 saniye -1 (yarıçap = 7 cm) &#39;lik bir açısal hızda dönmelidir. Daha yavaş bir hızlı fiber hizalama tetikleyebilir olmayabilir ve daha hızlı kırık lifleri neden olacaktır. </li><li> Polimer çözeltisi ile şırınga yükleyin ve şırınga pompası üzerine yerleştirin. </li><li> 30 kV voltaj ve 12 cm&#39;lik bir toplayıcı mesafe ile, bir 0.9 ml / saat akış oranı kullanılarak PLLA çözeltisi Electrospin. </li><li> Elektrospinning süreci kıç Durdurer 20-30 dk (hücreler aynı anda birkaç lifleri ile etkileşim var çünkü) bir zamanlar iyi bir lif yoğunluğu elde edilir. </li><li> Çözücü izleri buharlaştırılması için 5 dakika boyunca 120 ° C &#39;de örnekleri ısıtın. </li><li> PLLA hidroliz ile parçalanabilir olduğu için deney gününe kadar bir vakum kurutma cihazı (80 mbar) örnekleri saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Sandviç Kültürü <ol><li> Hücreler ventral 2B yüzeye yapıştırılır kez sandviç gibi kültür birleştirin. <ol><li> Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek. </li><li> Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) Ca içeren 2+ ve Mg2 + (200 ul / sn içinde eritildi fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe1 st için) yeterli. Not: Çözücü döküm film ve electrospun elyaflar yıkama yanlarından birine bağlanır, çünkü nedeniyle imalat işlemine, sırt alt-tabakalar belirlenmiş bir üst ve alt kenara sahiptir. Bu taraf, bu nedenle hücreleri (Şekil 3) bakan bir tanesidir. <ol><li> Protein Kaplamadan sonra, fazla proteini uzaklaştırmak amacıyla DPBS ile iki kez numune yıkayın. Daha sonra, bu protein, Doğallıktan neden olduğu, kuru alma örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Iki değerli katyonların beri 2+ Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS protein katlanmasını düzenler. </li></ol></li><li> Camına Tohum hücreleri 13 lamelleri. Not: sandviçe benzer kültürü 2B alt tabakalar üzerine dayandığı için, hücre ekim Benzer 2B örnek olarak yapılacaktır. Örneğin, C2C12 miyoblast cm-1 farklılaşma deneyleri ve NIH3T3 fibroblast için 7000 ° C&#39;de tohumlanır 17.500 hücre düşecek şekilde,arşın cm -1 izole kültürleri hücre morfolojisi ve yapışma incelemek için. </li><li> % 5 CO2 37 ° C&#39;de bir kuluçka numuneler ve hücreler 3 saat ventral substrata yapışmasına izin verir. </li><li> (Çamaşır uygun yerlerde), bir 12 çok oyuklu bir plakanın yeni bir kuyu ventral tohumlu yerleştirilmesidir. Not: Yeni bir kuyuda sandviç gibi kültür Montaj bu besinleri tüketmek ve içinde kültüre hücreleri etkileyen büyüme faktörleri ve atık salgılarlar beri iyi tohumlama sonrası dibine yapıştırılır var hücrelerin kurtulmak için tek yoldur sandviç gibi sistem. Bu aynı zamanda sandviç benzeri ortamında kültüre sadece hücreleri lize amacıyla hücresel çekimi için bir zorunluluktur. </li><li> Dikkatle ve bir cımbız yardımıyla, hücreler üzerinde dorsal alt tabakayı bindirme. Ortam (1 mi) ile doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Not: yıkama ağırlığı dorsal alt önleyecektiryüzen tedir. </li><li> Standart 2D kültürlerde olduğu gibi haftada iki kez orta değiştirin. Bu hücre hasarına neden olabilir çünkü dorsal substrat hareket ettirmeyin. </li></ol></li><li> Sadece hücre tohumlama sonrası sandviç gibi kültür birleştirin. <ol><li> Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek. </li><li> Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, Ca + 2 ve Mg + 2, 1 saat boyunca (200 ul / numune) ihtiva eden DPBS içinde eritilmiş fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe edin. <ol><li> Protein Kaplamadan sonra, fazla proteini uzaklaştırmak amacıyla DPBS ile iki kez numune yıkayın. Daha sonra, bu protein, Doğallıktan neden olduğu, kuru alma örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS <s&gt; 2+ kadar iki değerlikli katyonlar, protein katlanmasını düzenleyen beri. </li></ol></li><li> (Çamaşır uygun) 12, çok oyuklu bir plaka iyi cam lameller üzerine tohum hücreleri. Bunu yapmak için, dorsal substratı döşeme sonra hücre kaybını önlemek için son derece konsantre hücresel süspansiyon kullanın. </li><li> Dikkatle ve bir cımbız yardımıyla, hücreler üzerinde dorsal alt tabakayı bindirme. Ortam (1 mi) ile doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Not: Yıkama ağırlığı yüzen dorsal alt tabakayı önleyecektir. </li><li> Standart 2D kültürlerde olduğu gibi haftada iki kez orta değiştirin. Not: Bu hücre hasarına neden olabilir çünkü dorsal substrat hareket ettirmeyin. </li></ol></li></ol> 3. Analiz Not: Sandviç gibi kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır ve bu nedenle yaygın olarak zaten standart 2D kültürler için geliştirilmiş prosedürler ile analiz edilebilir. Örneğin, beri PLLA şeffaf ve cel olduğunuls xy düzlemi içinde hareket etmek kısıtlanır, mikroskopi 2B yüzeylerde olarak yapılır. Hücre göçü, bu nedenle deneme ve görüntü analizi kolaylaştırır 3D kültürleri için z-ekseni hücreler izleme gerek kalmadan, 2B kültürleri gibi analiz edilebilir. Bir çizik testi ile yara iyileşmesi tahlil incelemek için bu protokolü uygulayın: <ol><li> Sandviç gibi kültür içinde Çalışma hücre göçü (yara iyileşmesi deneyi). <ol><li> Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek. </li><li> Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, 1 saat süre ile Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) Ca + 2 ve Mg içeren 2+ içinde eritildi fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe edin. <ol><li> Protein Kaplamadan sonra, DPBS ile iki kez numune yıkayınamacıyla fazla proteinin ayrılması için. Daha sonra, protein Doğallıktan neden olabilir, bu, kurutma elde örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Iki değerli katyonların beri 2+ Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS protein katlanmasını düzenler. </li></ol></li><li> Yüksek yoğunlukta 13 cam lamelleri Tohum hücreleri. </li><li> % 5 CO2 37 ° C&#39;de bir kuluçka numuneler ve hücreler kaynaşmaya elde etmek için izin verir. </li><li> Bir boşlukla ayrılan 2 hücre popülasyonlarının almak için hücre tek tabaka kazımak için bir pipet kullanın. </li><li> Time-lapse edinimi için yeni bir kuyu uygun ventral numaralı seribaşı substrat yerleştirin ve dorsal yüzeylerde (yani 12 çoklu plaka) uygun yerlerde. </li><li> Dikkatli ve bir çift cımbız yardımı ile, hücreler üzerindeki sırt alt tabaka kaplaması ve daha sonra (bir 12 çok-delikli plaka için 1 mi) ortam ile doldurun. Not: yıkama ağırlığı önleyecektir tO yüzen alt tabakayı dorsal. </li><li> Time-lapse mikroskop örnek yerleştirin (37 ° C olarak ayarlanmış ve% 5 CO 2) ve boşluk kapatma her 20 dk görüntüleri alır. </li><li> Böyle ImageJ gelen eklenti MiToBo olarak özel bir yazılım kullanılarak boşluk kapatma analiz edin. 14 </li></ol></li></ol> Not: protein ve nükleik asit ekstraksiyon 2B alt tabakalar üzerinde benzer şekilde gerçekleştirilir. Ekstraksiyon verimini artırmak amacıyla hücreleri üzerinde doğrudan lizis tamponu eklemek için sandviç gibi kültür demontaj oluşur tek fazladan bir adım vardır. Örneğin mRNA çıkarımı için: <ol start="2"><li> Sandviç gibi Kültürler mRNA Özü <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir kit ile ilgili tüm tamponları hazırlayın. </li><li> Inkübatör dışarı sandviç gibi kültür atın. </li><li> Örneklerden kültür ortamı çıkarın. </li><li> DPBS Ca içeren bir kez numune yıkayın2 + ve Mg2 + (1 mi) ve bütün çözelti çıkarın. </li><li> Bir çift cımbız yardımı ile, sırt alt-tabakanın çıkarın ve ventral substrata liziz tamponu (350 ul) ilave edin. Ayrıca, sırt alt-tabakaya yapışan hücreler lize etmek için yeniden ventral alt-tabaka üzerine sırt alt tabaka kaplaması. </li><li> Lizis çözeltisi izole etmek için, dorsal substrat çıkarın. </li><li> MRNA almak için üreticinin talimatlarına uyun. </li></ol></li></ol> Not: Proteinlerin imüno-da 2 boyutlu yüzeylere olduğu gibi gerçekleştirilebilir. Sandviç gibi kültürler antikorlar ve tampon doğru difüzyon engel olabilir için, inkübasyon süreleri arttırılmalıdır. Ayrıca, sandviç boyama protokolü başlamadan önce demonte edilebilir, ancak bu ikinci durumda bazı hücreler dorsal ve ventral substrat alt tabakaya bazı bağlı kalacaktır. <ol start="3"><li> Bir sandviç gibi kültürün içinde Immunodetect proteinler <ol&gt; <li> DPBS ile bir kez örnek yıkayın ve 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit ile sabitlenir. Not: Sırt alt-tabaka difüzyon problemleri önlenebilir, böylece sabitleme işlemi esnasında çıkarılabilir. </li><li> DPBS (1 mi) ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS içinde% 0.5 Triton X-100 (1 mi) ile geçirgenliği. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DPBS içinde% 1 albümini (1 mi) ile spesifik olmayan bağlanma yerleri bloke eder. </li><li> Primer antikor ile inkübe (2 ug / ml; 1 mi), oda sıcaklığında 3 saat çözüm engelleme. </li><li> DPBS ile 10 dakika /% 0.5 Tween 20 (1 mi) 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında çözeltisi (1 mi) bloke sekonder antikor (2 ug / ml) ve 1 ug / ml DAPI ile 2 saat inkübe edin. </li><li> DPBS içinde 10 dakika /% 0.5 Tween 20 (1 mi) 3 kez yıkayın. </li><li> DPBS yıkayın. Not: Numuneler Vectashield bir slayt üzerine monte edilir ve dorsal yüzeyler önce immunodeteksiyon çıkarıldığında oje ile kapatılabilir. </li><li> Floresan mikro altında gözlemleyinstandart 2D yüzeyler gibi kapsamı. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).</li><li>Ruffner, H., Lichtenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems--towards+primary+drug+discovery+platforms:+an+interview+with+Heinz+Ruffner+(Novartis)+and+Jan+Lichtenberg+(InSphero).">3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero).</a> Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).</li><li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs.">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration:+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis.">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).</li><li>Schor, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+'sandwich'+assay+for+quantifying+chemo-regulated+cell+migration+within+3-dimensional+matrices:+wound+healing+cytokines+exhibit+distinct+motogenic+activities+compared+to+the+transmembrane+assay.">A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).</li><li>Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+system+for+the+assessment+of+cell+migration+on+3D+micropatterned+substrates.">Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).</li><li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+sandwich-like+microenvironments.+Effect+on+cell+differentiation.">Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation.</a> Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-matrix+sandwich-like+microenvironments+to+manipulate+cell+fate.">Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate.</a> Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions:+effect+on+cell+morphology.">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments.">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li><li>Gla&#223;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration+Analysis:+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines.">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell/matrix+interface+to+control+stem-cell+fate.">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulatory+effects+of+a+three-dimensional+microenvironment+on+cell-mediated+fibronectin+fibrillogenesis.">Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Günümüzde, 3D kültür kanseri dahil olmak üzere hücre biyolojisinde önemli bir ilaç ve biyoteknolojik sanayi için konu yanı sıra araştırma, ve kök hücre. Bunun bir sonucu olarak çok sayıda 3D kültür sistemleri geliştirilmiştir. Ne yazık ki, 3D sistemleri arasındaki farklılıklar genellikle hücre kader anlayışı engelleyen, farklı hücre davranışı neden olur. Ayrıca, deneysel işlemler genellikle 2B kültür sistemleri gibi basit değildir. Bu nedenle bu bazı sakıncaları çok önemlidir aşmak isteyen yeni kültür sistemlerinin geliştirilmesi. Sandviç-benzeri kültür güçlü, hücre farklılaşması, hücre morfolojisi, hücre sinyal iletimi ve hücre göçü gibi önemli hücresel süreçleri etkilemeye gösterilmiştir. Sandviç gibi kültür 3D kültür sistemleri ile 2D bağlantıları bu ifadeyi destekleyen 3D sistemlerde kültür hücreleri ile Dahası hücreler paylaşmak benzerlikler. Fizyolojik dokuları 3-14 μ aralığında gözeneklere sahipBu nedenle hücrelerin sınırlandırılmasına ve m, göç gibi hücresel süreçleri etkilerler. Dorsal ve ventral uyaranlar başına hücre morfolojisi sınırlar ve mutlaka ne olursa olsun, protein kaplamaların hücre göçü etkileyecek bir kısıtlı bir ortamda temsil gibi bu şekilde sandviç benzeri bir sistem kullanılarak değinmeyecek. Nedeniyle dorsal ve ventral reseptörlerinin eşzamanlı uyarılmasına, sandviç gibi kültür hücre davranış boyutluluk rolünü araştırmak için sağlam bir teknolojidir. 2B yüzeylerde dayanmaktadır Dahası, bu kültür sistemi malzeme özellikleri ve farklı mikroçevrelerde altında hücre davranışının çalışma izin ECM girişleri farklı çalışma son derece çok yönlüdür. Ayrıca, dorsal reseptörleri hücre kaderi üzerinde uyarılır hangi zaman etkisi farklı zaman noktalarında dorsal alt tabakayı kaplayan tarafından incelenebilir. Bu nedenle, diğer 3D sistemlerinden farklı olarak, sandviç benzeri bir sistem geniş bir tayfıhücresel mikroçevrelerde iyi kontrol edilir. Sonuç olarak sandviç gibi sistem farklı kültür koşulları altında hücre biyolojisi ve test hücresi kaderi incelemek amacıyla farklı fizyolojik ortamlarda taklit etmek için ilginç bir hücre kültürü platformudur. Daha önce de belirtildiği gibi, bu sistemin bir avantajı da, farklı ventral ve dorsal alt-tabakalar farklı protein kaplamalar kullanılarak incelenebilir olmasıdır. Bu nedenle, ligand yoğunluğu gibi hücre kaderi için önemli parametreler kullanılan 2B substratların her biri (örn ventral ve dorsal yüzeyler) ligand yoğunluğunu kontrol ederek ayarlanmış olabilir. Ancak, farklı yüzeyler protokolde değişiklik gerekebilir unutmayın. Örneğin, büyük dorsal substratlar kullanılarak Petri kabı kapalı örnekleri soymak için uygun inkübasyon süresi ayarlamak için ihtiyaç neden olabilir. Benzer şekilde, daha büyük bir ventral alt tabakalar için ventral sınırlı oksijen geçirgenliği numunenin merkezinde hipoksik bölgelerinde sonuçlanabilirAlt tabaka (cam lamel nedeniyle). Ayrıca, analiz prosedürleri substrat özelliklerine bağlıdır. Hala protein / nükleik asitler çıkarma sağlayacak olsa Örneğin, opak dorsal substratlar kullanılarak standart mikroskopi protokolleri engel olacaktır. Hücreler ortamdan besin almak ve atık atmak için izin verilmelidir çünkü bir diğer önemli faktör dorsal substratın geçirgenliği. Özetle, bir sandviç gibi kültür hücre kaderi araştırmak için farklı 3D benzeri mikroçevrelerde taklit imkanı sunuyor basit bir sistemdir.

In vivo hücre mikroçevrelerde çoğu üç boyutlu (3D) bir yapıya sahip olsa Geleneksel olarak, hücre kültürü, iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bu doğal olmayan 2D ortam düz bir dünya için kendini uyarlama bir yolu olarak, hücre davranış değişiklikleri, tetikler hangi doğrudan etkiler, hücre kaderi 1,2. Bu nedenle, 2B hücre kültürlerinde elde edilen sonuçlar her zaman in vivo tekrarlanabilir değildir. Bu, herhangi bir boyut bağımlı biyolojik mekanizma 3,4 içine daha fazla anlayış almak için daha fazla fizyolojik benzeri koşulların sağlanması isteyen yeni alakalı kültür sistemlerinin geliştirilmesi teşvik etmiştir. 2B hücreleri ventral yapışır yüzeylerde oysa, in vivo hücrelerin çoğunluğu tamamen ECM ve çevrili: 2B kültür ve in vivo ortamda 3D arasındaki ana farklardan biri ekstrasellüler matriks (ECM) demirlemiş hücre reseptörlerinin dağılımı Böylece ceII yapışma reseptörlerinin bir 3D dağıtım yoluyla gerçekleşir. Bu sayede, hücre büyümesi, hücre farklılaşması ve gen ekspresyonu gibi önemli işlevleri modüle farklı hücre yapışma sinyal yollarını başlatır. Onların değişkenlik ve karmaşıklık ortak hücre kültürü prosedürlerinin kendi standardizasyon engel olsa son on yılda, pek çok farklı 3D kültür sistemleri, 5-8 kurulmuştur. Ayrıca 3D sistemler genellikle işlemek ve 2D yüzeylerde mevcut deneysel işlemler kolayca 3D kültürler için kurulmuş olamaz kolay değildir. Buna ek olarak, edebiyat nadiren bu modellerde hücre davranışını doğru anlaşılmasını engelleyen, eşdeğer 2B durumu veya diğer 3D sistemlerle 3D kültürleri karşılaştırır. Bir kez 2B substrat, dorsal reseptörlerinin uyarılması üzerine yapıştırılır hücrelere sahip - yeni bir malzeme (sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan ile - hücre hem yanıtları 3D ortamlar tetikleyebilir. reaBunun arkasında oğlu dorsal ve ventral reseptörleri yapışır ve sandviç ortamında yaymak için (Şekil 1) 9,10 hem de eş zamanlı aktivasyonu olduğunu. Bunun bir sonucu olarak, hücreler 2B kültürleri 11,12 ile ilgili olarak önemli değişimler geçirirler. Dorsal uyarım önemli hücresel yollardaki değişiklikler tetikler çünkü Böylece, hücre kaderi, çünkü sandviç kültürü montajı esnasında belirlenir. Bu nedenle, hücre kaderi yüksek sandviçe benzer kültürü 11 monte edilir zaman ile tespit edilir. Nedeniyle sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hem ventral ve dorsal tarafı böyle kimya, topoğrafya, sertlik ve protein kaplamalar gibi hücre / malzeme etkileşimleri farklı parametrelerin çalışma sağlayan basit ve çok yönlü bir araçtır. Bu, geniş bir v bağımsız olarak dorsal ve ventral kombinasyonu diğer 3D Systems (Şekil 2) göre çok yönlü bir yüksek derecesiYüzey koşullarının ariety. Buna ek olarak, farklı hücre hatları ve sandviç-benzeri kültür monte farklı zamanlarda olanakları geniş spektrumunu artan incelenebilir. Sandviçe benzer kültür standart bir protokol kullanılarak aşağıda ayrıntılı olarak, ya sırt alt tabakalar, protein kaplama olarak ventral alt-tabaka ve fibronektin gibi cam lamel gibi asit (PLLA) electrospun elyaflar ya da filmler-L-laktik poli. Sandviç gibi kültürler, sadece hücre tohumlama sonra veya 2B kültür 3 saat sonra monte edilmiştir. Bununla birlikte, diğer malzeme sistemleri ve proteinler kullanılabilir dikkat ediniz; aynı şekilde sandviç benzeri bir kültürü, farklı zaman noktalarında monte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Ploy(lactic acid)</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Cover glasses (12 mm&amp;Oslash;)</td><td>Marienfeld</td><td>631-0666</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Scharlab</td><td>CL0200</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Sigma</td><td>105228</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe (1 ml)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>High Voltage DC Power Supply</td><td>Glassman High Voltage</td><td>Series FC</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hucoa-Herl&amp;ouml;s</td><td>3111</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Laminar flow&amp;nbsp; hood</td><td>Telstar</td><td>AV30/70</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Human Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI 6000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Reagent</td></tr></tbody></table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

Hücre kültürü, geleneksel hücre biyo materyal yüzeyi ventral reseptörleri kullanarak uygun iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bununla birlikte, in vivo olarak, hücrelerin çoğu tamamen reseptörlerinin bir üç boyutlu (3D) dağılımı ile sonuçlanan hücre dışı matrisin (ECM) ile çevrilidir. Bu sinyal yolları dışında-ve böylece hücre davranış farklılıkları tetikleyebilir. Bu makale zaten yeni bir malzeme (bir sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan bir 2B yüzeye yapıştırılır hücrelerin dorsal reseptörlerini uyararak standart 2D kültürlere göre önemli değişiklikler tetikler olduğunu göstermektedir. Ayrıca, ventral ve dorsal reseptörlerinin aynı anda uyarma yakın 3D ortamlarda bulunan edilene hücre davranışını değiştirir. Buna ek olarak, bağlı sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hücre / malzeme inte farklı parametrelerin çalışma sağlar çok yönlü bir araçtırkasılma konsantrasyona, örneğin, topoğrafya, sertlik ve hem ventral ve dorsal kenarlarında farklı protein kaplamaları. Sandviç benzeri kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır çünkü nihayet, birkaç analiz prosedürleri zaten 3D sistemleri için gerekli daha karmaşık prosedürleri aşarak, normal olarak kullanılabilir standart 2D kültürler için geliştirilmiş.

sandviç gibi kültürün içinde dorsal reseptörlerinin uyarılması, hücre morfolojisi, hücre yapışması ve hücre içi sinyal yolları (örneğin fokal yapışma kinaz, FAK) 10-12 değişiklikleri tetikler. Diğer 3D kültürler 15,16 için görüldüğü gibi, bir örnek olarak, sandviç benzeri bir sistem içinde kültürlendi fibroblastlar, 2D göre α 5 integrin alt birimi aşın. Hücre kaderi, hidroj eller gibi diğer 3D sistemlerinde olur Benzer şekilde, sırt reseptörleri uyarılır zaman ve sırt etkileşim özellikleri ile son derece bağlıdır. Örneğin, proteinler, sıkı bir şekilde, genellikle bağlı hidrojeller gelişmemiş aktin hücre iskeleti ile daha küçük ve yuvarlak hücrenin ve fokal yapışmalarda yayılır. Hücreler mekanik proteinler ve hücre SPREA bu ​​katmanı yeniden mümkün değildir, böylece bu, sıkı proteinleri adsorbe bir sandviç gibi kültür kullanan yüzeylerde taklit edilebilirding engellendiği. Benzer bir şekilde, hücreler ECM yeni model olabilir hidrojeller proteinleri daha gevşek 10 adsorbe substratlar ile sandviç sistemi ile taklit edilebilir. Dorsal reseptörlerinin uyarılması C2C12 hücre kaderine modüle ettiği gösterilmiştir. Fibronektin ile kaplı ancak sığır serum albümini (yapışkan olmayan bir protein) ile kaplanmış olmadığında electrospun PLLA liflerin doğrudan hücre hizalama Dorsal. Bu sonuç hücreleri (Şekil 4) biyolojik anlamda yapmak ve dorsal girişlerine tepki işaret 9. Ayrıca, uçak dorsal PLLA sandviç benzeri kültürler Miyogenesis düzeyinde bir artışa neden oldu. Bu ayrı farklılaşma oranlarında farklı dorsal proteinler sonuçları (Şekil 5) 9 ile etkileşim beri dorsal biyolojik uyaranlara de bağlıdır. 2B kültürüne göre sandviç gibi kültür içinde hücre göçü de değişir. Bu edildiğiniyara iyileştirici tahlilinde göstermiştir tr, sandviç kültürü içindeki hücreler, oldukça uzun bir morfolojiye kabul ve 2D substratlar üzerinde daha kısa mesafeler geçirmek (Film 1 ve 2). Hücre göç hızları ayrıca ventral ve dorsal stimülasyon 12 doğasına bağlıdır. Benzer şekilde 3B fibronektin ve kolajen jellerin içindeki olarak 17,18, sandviç benzeri bir kültürü (Şekil 6) 12 2B durumuna göre hücre aracılı ECM ​​yeniden düzenlenmesi (örneğin, ventral fibronektin) artar. Bu süreç kontraktilitesi inhibitörleri (blebbistatin, Y27632) süreci engellenmiş kullanımı beri dorsal mekanik uyaranlara ve hücre iskeletinin istikrar dayanır. İlginç bir şekilde, farklı bir dorsal proteini kaplama (örneğin, vitronektin ve sığır serum albümini) kullanıldığında ventral fibronektin, aynı zamanda yeniden yapılanmış ve bile, kaplanmamış 12 bıraktı. Şekil 1:.. Standart (2B) Sketch ve sandviç gibi kültürler sandviç gibi kültürün içinde dorsal reseptörlerinin uyarılması önemli hücresel süreçleri modüle ek hücre yapışması sinyallerini tetikler <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53090/53090fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53090/53090fig2highres.jpg" width="700" /> Şekil 2: Sandviç gibi kültür hem ventral ve dorsal yüzeylerde farklı iyi kontrol parametreleri (topografik girdiler, sertlik, degradeler ...) çalışma sağlayan çok yönlü bir sistemdir. Şekil 3:. Sırt yüzeyler belirlenen üst ve alt tarafı göstermek için üst ve kesit görünümü hem de kabataslak (A) Düz PLLA film ve (B) electrospun lifleri. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53090/53090fig4highres.jpg" width="700" /> Şekil 4:. Gerektiğinde düzlemde (p) ve hizalanmış lifleri (a) PLLA ventral (indis) olarak kullanıldığına dair veya dorsal (üst simge) yüzeylerde dahil olmak üzere farklı kültür koşulları altında C2C12 morfolojisi Noktalı çizgiler liflerin yönünü temsil etmektedir. Hücreler düzlem yüzeye kültüre ve PLLA ve hizalanmış lifleri (SW p a) dorsal uyaranlara anlamda ile kaplanmış. Özel olarak, hücreler, fibronektinle kaplanmış, ancak wi kaplı olmayan zaman sırt lifleri duyuinci sığır serum albümini (yapışkan olmayan bir protein). Sonuç olarak hücreler, fibronektinle kaplanmış elyaflara uygun ve aynı yönde hizalanır. Referans 9 uyarlanmıştır Görüntü. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53090/53090fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53090/53090fig5highres.jpg" width="600" /> Şekil 5: farklılaşma ortam içinde 4 gün sonra sandviç gibi kültürlerde hücre farklılaşması. Farklı kültür koşulları düzlemine (P) ve sıralanmış liflerden (a) PLLA ventral (simge) veya dorsal (numaralar) olarak kullanıldığı alt-tabakalar. Örnekler her durumda fibronektin ile kaplandı da dahil olmak üzere analiz edilmiştir. (A) Floresans sarkomerik miyozin pozitif hücreler (yeşil) ve hücre çekirdekleri (kırmızı) gösteren lekeleme. (B) FarklılaştırılmışHızlı Fourier Dönüşümü hesaplanan hücreler oryantasyon. (C) Miyogenesis sarkomerik miyozin-pozitif hücrelerin yüzdesi ile belirlenen. Veri altın standart kontrol normalize edilir. Istatistiksel olarak anlamlı farklılık *** P &lt;0.001 ile gösterilir. Referans 9 uyarlanmıştır Görüntü. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53090/53090fig5highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53090/53090fig6highres.jpg" width="700" /> Şekil 6: ventral fibronektin Reorganizasyon. Sandviç kültürü yeni fibronektin fibriller oluşturarak ventral FN reorganizasyon tetikler. (Fırça gibi etiketleme, beyaz oklarla işaret) ventral fibronektin farklı dorsal protein kaplama (fibronektin, vitronektinin ve sığır serum albümini) ile sandviç benzeri kültürler içinde yeniden düzenlenirya da dorsal substrat kaplanmamış sol bile. Aktin hücre iskeleti (yeşil), çekirdekleri (mavi) ve FN (kırmızı) gösterilmektedir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53090/53090fig6highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Film 1: 2B Hücre göçü. L929 fibroblast iyileşmesi deneyini yara bir fibronektin kaplı cam lamel göç. Görüntüler (her 20 dakikada alınan bir çerçeve ile) 16 saat boyunca elde edildi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53090/2D.avi" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Film 2:. Sandviç gibi kültür içinde hücre göçü, bir sandviç gibi kültür içinde iyileşmesi deneyini yara göç L929 fibroblast ventral alt tabaka bir fibronektin kaplı cam lamel ve dorsal substrat bir fibronektin kaplı PLLA filmdi vardı. Görüntüler (her 20 dakikada bir alınan bir çerçeve ile) 16 saat süre ile elde edilen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53090/movie_2_SW.avi" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions at JoVE.com

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Görüntüleme.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Video: Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Kanser Araştırmaları

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from development to malignant transformation.&nbsp; In particular, interaction with neighboring stroma has been implicated in a plethora of biological phenomena; however, conventional techniques limit the ability to interrogate the spatial and dynamic elements of such interactions.
In Micromechanical Reconfigurable Culture (RC), we employ a micromachined silicon substrate with moving parts to dynamically control cell-cell interactions through mechanical repositioning. Previously, this method has been applied to investigate intercellular communication in co-cultures of hepatocytes and non-parenchymal cells, demonstrating time-dependent interactions and a limited range for soluble signaling 1.
Here, we describe in detail the preparation and use of the RC system. We begin by demonstrating the handling of the device parts using tweezers, including actuating between the gap and contact configurations (cell populations separated by a narrow 80-&micro;m gap, or in direct intimate contact). Next, we detail the process of preparing the substrates for culture, and the multi-step cell seeding process required for obtaining confluent cell monolayers. Using live microscopy, we then illustrate real-time manipulation of cells between the different possible experimental configurations. Finally, we demonstrate the steps required in order to regenerate the device surface for reuse: toluene and piranha cleaning, polystyrene coating, and oxygen plasma treatment.

This article describes an experimental approach for dynamic regulation of cell-cell interactions between adherent cells on a micrometer scale. Manipulation of intercellular communication between hepatocytes and stromal cell is demonstrated. The developed platform enables investigation of cell-cell interactions in a variety of biological processes, including development and pathogenesis.

Hücre hücre Etkileşim kurgulama için Silikon mikroçipler

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

Biyoloji

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.