Name: quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Cam lameller hazırlanması 1. <ol><li> Etanol tüm lamelleri toplam pozlama sağlamak için zaman zaman ajitasyon ile en az 10 dakika süreyle% 70 etanol onları iliklerine cam lamelleri yuvarlak 12 mm çapında sterilize edin. Steril hücre kültürü kabı içine cam lamelleri ve etanol dökün (ya da 6 cm ya da 10 cm çapında). </li><li> Steril ince 5B forseps bir çift ile, pick up ve 24 de küme plaka bir kuyuya her cam lamel yerleştirin. Lamelleri Kuyunun taraflarına dokunarak ve kuyunun ortasında yaklaşık olarak emin olmak için özen gösterin. </li><li> Akış kabinede kurumaya cam lamelleri ile un kaplı 24 kuyu küme plaka bırakın. Bu yaklaşık 10 dakika sürer </li><li> Bu süre içinde, 0.1 mg / ml Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 10 mg / ml insan fibronektin seyreltilmesi ile kaplama karışımı hazırlayın. </li><li> Lamelleri kuruduğunda, her bir cam co üstüne kaplama çözeltisi pipetle 100 ulböylece verslip çözüm de dış çevresindeki havuzu olmayan tek cam kaplar. En azından bir saat için bir hücre kültürü inkübatöründe kaplı 24 çukurlu toplu plaka koyun. </li><li> Sadece Kullanmadan önce, kaplama çözümü çıkarın. aynı kaplama çözeltisi steril bir tüpe transfer edilmiş ve etkinlik görünür bir kayıp ile üç kez kullanılabilir. </li></ol> Endotel Hücre Monolayer 2. Hazırlık <ol><li> 37 ° C &#39;de orta ve% 5 karbon dioksit Kültür insan koroner arter endotel hücreleri (EC). </li><li> Kültür ortamı aspire ve 10 ml HBSS ile AK tek tabaka durulayın </li><li> HBSS kapalı aspire ve 2 ml% 0.5 tripsin,% 0.2 EDTA çözeltisi. Yaklaşık olarak 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> AT şişeye tarafına bir musluk tarafından yerinden edilebilir olduğunda, soya fasulyesi tripsin inhibitörü 5 ml ilave edilir ve pipet ile daha da hücreleri çıkarmak için şişenin yüzeyi fışkırtma. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp ve santrifüj tüpü içine aktarın hücreleri5 dakika boyunca 200 x g&#39;de. </li><li> Süpernatant kapalı aspire ve medya 5 ml AK pelletini. Bir haemocytometer ile hücre sayımı ve AT medya ml başına 50.000 EC hücre konsantrasyonunu ayarlamak. </li><li> Kaplanmış cam lamelleri içeren 24 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna hücre süspansiyonu 1 ml koyun. 37 ° C artı% 5 karbon dioksit, hücre kültürü inkübatöründe hücreleri O / N inkübe edin. </li><li> konfluent tek tabaka 3 gün içinde, meydana getirildiği zaman hücreler, deneylerde kullanılmak üzere hazırdır. </li></ol> Monositler 3. hazırlanması <ol><li> RPMI içinde kültürlenir transfer HL-60 hücreleri bir 15 ml tüp içine, süspansiyon kültürü olarak% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiştir. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. </li><li> 5 mi ortam içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın ve 2.000.000 hücre / ml ortam hücre konsantrasyonunu ayarlamak. HL-60 floresan etiketleme isteniyorsa, serum ve PR olmadan RPMI hücreleri tekrar süspansiyonbölüm 4&#39;te tarif edildiği gibi oceed. </li><li> 1 ile 3 arasında bir zaman seçilen sabit bir süre için AT tek tabaka ihtiva eden 24 çukurlu toplu plakanın her oyuğuna HL-60 hücre süspansiyonu, 0.5 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de ve% 5 karbon dioksit, bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe plaka hr. Küçük bir fark bağlama doygunluk elde edilir, 1 saat, 3 saat zaman noktası arasında görülmektedir. </li><li> Hücre Yıkama / toplama için hazırlayın: HBSS, 100 ml ile 120 ml tüp doldurun. Taze 24 yuvalı plakanın her oyuğuna formalin 1 ml koyun. </li><li> Dokunmamaya özen kuluçka döneminden sonra, keskin forseps bir çift kullanın ve kuyudan cam lamel pick up ve dikey lamel tutun ve 3 sn bankta doku parçasının üzerine lamel kenarına dab doku ile lamel hücre kaplı yüzeyi. </li><li> Forseps bir çift ile sıkıca lamel tutarak, ve HBSS beş kez dışarı lamel dunk. </li><li> Beşinci dunk sonraHBSS, 3 saniye boyunca doku üzerinde lamel kenarına hafifçe sürün. </li><li> Bir dab izledi 5 dunks üç set toplam yapım, 3.6 ve 3.7 &#39;de açıklandığı smaç vurma ve prosedürleri tekrarlayın. </li><li> RT&#39;de hücreleri gidermek için iyi içeren% 10 formalin içine lamel aktarın. Lamel, numaralandırma hazır uzun süreli depolama için ya da aşağıda tarif edilen diğer prosedürler tabi etmektir. </li></ol> Hücre Tracker ile HL-60 hücrelerinin 4. Etiketleme (isteğe bağlı) <ol><li> Sayım bir 15 ml santrifüj tüpüne HL-60 hücreleri (örneğin, 10000000) uygun miktarda aktarın. Santrifüj HL-60, 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de hücreleri. Süpernatantı. </li><li> 1.000.000 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda serumsuz RPMI ortamı içinde hücre Tracker tekrar süspansiyon hücre peleti. 1 saat süre ile hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri. </li><li> 200 x g&#39;de santrifüjleyin hücreler, 5 dakika süreyle tavlandı ve süpernatant atılır. 2.000.000 C&#39;lik bir konsantrasyona kadar ortam içinde tekrar süspansiyon hücre peletiarşın / ml olmuştur. </li><li> Cam lamel üzerinde büyümüş içeren her endotel hücrelerine hücre Takibi etiketli HL-60, 0.5 ml ilave edilir. 3.3 devam edin. </li></ol> Yapıştırıcı endotel hücrelerinin 5. numaralandırma <ol><li> Mikroskop bireysel hücreleri belirlemek için DAPI karşı boyası ile slaytlar Mount lamelleri. </li><li> Bir 4X veya 10X amacı ile ters bir mikroskop kullanılarak, çeşitli alanlarda (örneğin, 5 alanlar) görüntülerini almak ve un-ışınlanmış endotel hücreleri üzerinde agrega monositlerin en çok (Bu genellikle 3-5 olmalıdır) saymak. </li><li> Endotel hücre monositlerin eşik olarak iki kez bu sayısını ayarlayın bir küme olarak tanımlanabilir için. Eğer gerekirse, farklı bir kriter, deney doğasına bağlı olarak bir küme tanımlamak için kullanılabilir. </li><li> Kümelerinin sayısını ve alan endotel hücre sayısı. Yapışkan endotel hücrelerinin yüzdesini elde etmek rezistans tarafından önceki bölün. GolÇok sayıda alanları sayısı arasında bir ortalama ve standart sapma elde edilmiştir. </li></ol> Antikorlar 6. counterstaining <ol><li> Lamel yapışma deneyi ve hücreler oda sıcaklığında 15 dakika için% 10 formalin içinde sabitlenir sonra, standart bir prosedür 10 ve seçim antikorlar kullanılarak immünofloresans lamelleri maruz. </li><li> Ekle ve endotel hücrelerine bağlı monositler yerinden oynatmamaya önlemek için çok çeşitli çözümler yavaşça çıkarın. </li></ol> Yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz aktivitesi bakımından 7. counterstaining <ol><li> Lamel yapışma deneyi ve hücreler yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz faaliyeti için 15 dakika, leke için formalin sabit edildikten sonra boyama seti eşlik kılavuzunda açıklandığı gibi. Ekle ve endotel hücrelerine bağlı monositler yerinden oynatmamaya önlemek için çok çeşitli çözümler yavaşça çıkarın. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yukarıda tarif edilen monosit yapışma deneyi endotel mono tabakaları 10 iyonizan radyasyon biyolojik etkilerini incelemek amacıyla tasarlanan deneylerde başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu endotel tek tabaka yapışkanlığını değerlendirmek için tek yöntem değildir, ancak, bu yapıştırıcı, bir tek tabaka içindeki oranı veya endotelyal hücrelerin yüzdesi ölçümü sağlayan tek bir yöntemdir. Bu monositler yapışmasının küresel bir niceliksel değişiklik olarak önemli bir fark, diğer yöntemlerle ölçülen endotel tek tabaka ya da endotel hücrelerinin bir alt-nüfusa artışı yapışkanlık tüm hücre yapışma genel bir artışa ya da atfedilebilir tek tabaka içinde yukarıdaki örnekte gösterilmiştir. Bu bilgiye sahip değer ışınlama ines neden sonra yeteneği gelişmiş yapışkanlığı sergiledi endotel hücrelerinin yüzdesini ölçmek için gerçeği ile örneklenmiştirBu etki, yapışkan olan hücrelerin yüzdesi olarak belirli bir genin, genetik mutasyona bağlı değildir sahip sonuç, bu dozda X-radyasyon ile bir genin rastgele mutasyon beklenebilecek olanı (1000 kat daha fazla) büyük ölçüde yukarıda edildi . Sonuçların iyi tekrarlanabilirlik sağlayan faktörü yıkama rejimidir. Yıkama işlemi, bir doku üzerinde dabbing ardından yıkama tamponu içine cam lamel daldırma içerdiğinden, kaçınılmaz olarak kuyuya yıkama tamponu pipetleme gelen eski yöntem ortaya tamponu türbülansa değişkenliği önlenir. Aslında yıkama adımından değişkenlik elemanı kaldırılmış bir yıkama işlemi hazırlamak için bize mecbur pipet yöntemi kullanılarak elde edilen çoğaltır arasındaki aşırı değişkenlik gözlem oldu. Kuşkusuz, muhtaç bu testte yalan sınırlamalar n do monosit kümeleri manuel sayısı, yürütmek içinOT yüksek verimlilik analizleri için adapte edilmesini sağlar. İkincisi, birçok monositler bir küme oluşturan nasıl karar yarı keyfi belirlenmelidir ve düzeyi çok yüksek ayarlanmış ve bazı orijinal kümeler dışlanmasına neden olabilir. bu yöntemde, kesme kuvveti eksikliği, aynı zamanda, endotelyal hücrelerin ağır gelişmiş yapışkanlık neden olduğu deneylerde (örneğin, + TNFa) bir sınırlama olarak görülebilir. Bu yapışkanlık az abartılmış büyütme algılanmasını sağlar diğer durumlarda ancak, kesme kuvveti eksikliği bir avantajdır. Monosit yapışkanlık mütevazı bir artış özellikle önemlidir ve ilgili olabilir. İn vivo koşullarında, monositler (tipik bir deney zamanında) kırma gücüne karşı büyük ölçüde yapışkanlık mütevazı bir artış ile endotelial hücrelere büyük sayılarda takmak için beklenmez. Zaman içinde, ancak bazı monositler olasılıkla olur ve bu kronik iltihaplanma ortamı temsil etmek için daha olasıdır. Gibi,o yapışkanlık artışının makaslama stres altında uyulması gereken izin tipik olarak kısa ve muhtemelen çok kısacık deneysel zaman dilimlerinde ortaya endotel hücre yapışkanlık küçük artışlar için fırsat sağlar olarak kesme kuvveti bulunmaması bir avantaj olabilir. Yukarıda gösterildiği gibi, belirli hücresel proteinlerin ya da hücresel devletlere özgü endotel hücrelerinin yapışkanlık ilişkisini veriyor gibi yaşlanma tahlil ve immünofloresan boyama gibi diğer analizlere bu tahlilde sonra hücrelerin maruz yeteneği, bir özellik bu yöntemin yararını artırır Eski yapışma deneyleri ile mevcut değildir. Bu yöntem, EST2-ölümsüzleştirilmiş insan koroner endotel hücreleri ve benzer sonuçlar ile kullanılmıştır da sadece özel bir hücre hattına özgü olmadığını gösteren, primer insan koroner endotel hücreleri 10 ile elde edilmiştir. Ayrıca, adoendotel hücrelerinin yapışkanlığı tahlil bu yöntemin ption etiketli immünositlerin floresan ölçer standart yapışma deneyi aynı hücrelerin maruz engel değildir. Birlikte, bu rapor, bu yöntem, kapsayıcı, çok yönlü ve standart yapışma deneyinde çok daha fazla bilgi sağladığını göstermektedir.

Kan damarlarını kaplayan endotel hücre tabakası boyunca monositler gibi immün hücrelerin infiltrasyonu iltihabı 1 sürecinde önemli bir adımdır. Bu yaralanmanın bir siteye bağışıklık hücreleri (imünositler) homing sağlar. Örneğin, koroner ve karotis arter gibi durumlarda ve yerlerde, endotel tabaka boyunca monosit sızması potansiyel istilanın 2 oluşumuna yol, arter çeperinde bu hücrelerin istenmeyen uzun süreli ikamet yol açabilir. Immünosit infiltrasyonu Her durumda, ilk adım, kan damarının lokal bir bölgedeki endotel hücrelerinin aktivasyonunu içermektedir. Endotel hücreleri, endotel hücre yüzeyi 3- üzerine immünositlerin görevlendirilmesini ve bağlanmasını kolaylaştırmak örneğin, VCAM, ICAM ve E-selektin gibi hücre yüzeyi proteinlerinin ifadesini geliştirmek için, TNF-α ve IL-6 pro-enflamatuvar sitokinler tarafından aktive edilir 6. 7 endotel yapışık monositler sayımı sureti ile ifa edilmiştir. hassasiyet açısından bu yönteminin sınırlamaları lenfositler ve monositler yapışma 4 karşılık gelen radyoaktif madde miktarının, ardından radyo işaretli lenfosit veya monosit kullanımına yol açmıştır. Bu yöntem, sonuçta 8 ölçülür ilgi imünositler farkı yerine radyoaktivite bu floresans olduğu yukarıdaki ile aynı prosedüre floresans boya ile etiketlenir ve tabi tutuldu ve böylece bir floresans bazlı yöntem, değiştirildi. Halen bu yöntem en uygun olarak ortaya çıkmıştır ve çok sayıda ticari tedarikçiler tarafından kit halinde satılmaktadır. Bu deney, kontrol ve deney numuneleri arasındaki yapışkanlık göreli düzeylerini ölçmek mümkün olmakla birlikte, floresan bir değişiklik bütün e boyunca yapışkanlık üniform bir değişikliğe bağlı olup olmadığı ortaya koymamaktadırndothelial hücre topluluğu veya değişiklik, hücre alt-popülasyonu içinde yapışkanlık bir farka ise. Bu yıkama darlığı sonucu üzerinde derin etki gösterir ve daha da önemlisi, farklı endotel hücre mono tabakaları arasındaki ilişkisiz monositler kapalı durulama tekdüzelik numuneler arasında sonuçların çoğaltır sonuçlarının yakınlık ve tekrarlanabilirlik büyük ölçüde etkileyeceğini de açıktır . Daha yakın zamanda, bir endotelyal hücre tek tabaka boyunca ortam içinde monositleri pompa çeşitli sistemler, bu sorunu çözmek 9 için kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu akış sistemleri de endotelyal hücreler üzerinde kesme kuvvetinin etkisi özetlemek. Bu sistemlerin avantajı net ve çok cazip olmakla birlikte, akut iltihap durumunda olduğu gibi, bu örneğin iyonize edici radyasyon gibi TNFa, başka bir aktivatörleri, gibi faktörler ile, endotelial hücre yapışkanlığı önemli ölçüde artar edilebilir ise gerçekleştirmek için de önemlidir 10 meydana çıkarmak t değiştirirşapka kolaylıkla bunlar çok sıkı sistemlerinin in vitro deneysel süreler dahilinde tespit edilmez. Endotel hücre yapışma gibi dakika değişiklikleri kolayca cevapsız veya in vitro ilişiği kesilen iken, kronik inflamasyon özelliği olan bir yaşam süresi içinde böyle küçük değişiklikler, çok önemli sonuçlar uygulamayın in vivo, mutlaka iyi huylu değildir. Dolayısıyla sağlam, ancak duyarlı ve spesifik bir yöntem tespit ve endotel hücre yapışkanlık gereklidir ölçmek için. Burada, doğrudan endotel hücrelerinin yapışkanlığını ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, endotelyal hücre yapışma dolaylı taşıyıcı göstergesi olarak floresans ölçümleri dayanmaz. Bu yapışkanlık değişiklikler tüm hücrelerin tektip değişiklik nedeniyle ya da bir alt nüfusa sınırlı olup olmadığını ortaya koymaktadır. Bundan başka, bu örneğin yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz, hücre canlılığı, mar olarak işaretleri ile endotel hücrelerinin ko-lekeleme sağlarker, Calcien AM ve bazı hücre durumlar veya spesifik protein ekspresyonuna bireysel yapışkan endotel hücrelerinin ilişki sağlayan hücre yüzeyi ve hücre içi proteinlere karşı antikorlar.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media</td><td>Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

Inflamasyon ana işlemlerden biri, çevredeki dokuya kan damarı lümeninden bağışıklık hücrelerinin sızıntıdır. Kan damarları kaplayan endotel hücreler, monositler gibi bağışıklık hücreleri, dolaşımdaki yapışkan olduğunda ortaya çıkar. Bu yapışkanlık in vitro ölçülmesi artık yeni bir doğrudan sayısı olarak ya bir endotel katmana yapışık monositler sayısı miktarının yapılır kadar veya yapışık monositler floresan dolaylı ölçümü ile saptanmıştır. Bu ölçümler endotel hücre popülasyonunun ortalama yapışma gösterir ise de, bu tür hücre sayısı gibi faktörler, bir dizi eleştirilmiştir edilir ve aslında yapışkandır endotel hücrelerinin oranını göstermez. Burada tarif ve endotel tek tabaka bir test nüfus içinde yapışkan hücrelerin numaralandırma sağlayan bir yöntem ortaya koymaktadır. Endotel hücreleri cam lamelleri üzerinde yetiştirilen ve istenen aşağıdakitedavisi (yani, floresanla işaretlenmiş olabilir) monositler ile tehdit edilir. Daldırma ve drenaj birden mermi içeren inkübasyon, bir durulama prosedürü, sonra hücreler sabittir. Monositler çevrili Yapıştırıcı endotel hücreleri, kolayca tespit ve yapışkan olan nüfus içindeki endotel hücrelerinin gerçek oranını ortaya bir yapışma indeksi vererek, numaralandırılan.

Bu yöntem, bir popülasyon içindeki bireysel yapışkan endotelyal hücrelerin saptanmasını sağlar. Örneğin, un ışınlanmış endotelyal hücre tek-tabakalı (önceki bağımsız endotel hücreleri çevresinde en kümelerdeki monositler bağlı edildi monositler ile kuluçkalamadan 7 gün sonrası 10Gy ışınlama ile inkübasyon ve yıkama, endotel tek tabakalı sonra birkaç sporadik HL-60 monositler muhafaza ederken Şekil 1). Bu fenomen faz kontrast mikroskobu altında kolaylıkla gözlemlenebilir olmasına rağmen, floresan mikroskopi monosit kümeleri daha da net bir görüntü ortaya koyuyor. Tarif edilen yapışma tahlili gerçekleştirdikten sonra, standart yöntemler ile immünofloresan uygun antikorlar kullanılarak membran, sitoplazmik ya da nükleer (Şekil 2) proteinlerin hücrelerin boyanması devam etmek mümkündür. Bundan başka, örneğin yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz (Şekil 3) gibi enzim-bazlı analiz aynı zamanda PE olabilirrformed. Her bir monosit, küme bağımsız bir endotelyal hücreye karşılık geldiğinden, kümelerin numaralandırma tek tabaka içinde yapışkan endotelyal hücrelerin sayısı ortaya çıkaracaktır (Şekil 4) ve popülasyon içindeki yapışkan endotel hücreleri bu nedenle oranı (Tablo 1, Şekil 6) . Bu endotel hücre yapışma gibi ölçümü sağlar bugüne kadar tek yöntemdir. Burada yapılan deneylerde kullanılan endotel hücreleri temas inhibe ve kaplayana kadar sayısındaki artış yoktur dikkat çekicidir. Bu daha sonraki zaman noktalarında artmış endotel hücre sayısına göre yarattığı potansiyel karmaşıklığı ortadan kaldırır. Eğer arzu edilirse, endotelyal monokatmanlarına bağlanmış monositler (3.9 yerine tespiti)% 0.5 tripsin% 0.2 EDTA çözeltisi ile yerinden alınabilir ve modern yöntemler durumda (Şekil 5) olduğu gibi floresans bir plaka okuyucusu kullanılarak ölçüldü. </p&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Endotel hücrelerinin tek tabaka üzerinde monositlerin Şekil 1. yapışması. Un-ışınlanmış endotel hücreleri üzerinde, monositler sporadik ve rastgele bir şekilde tek tek hücrelerin (paneller sol) olarak ve post-10 Gy ışınlanmış 7 gün bireysel endotel hücreleri üzerinde kümeler halinde yapıştırılır tek tabaka (sağ paneller). Alt paneller faz kontrast altında görülebilen, küçük ve parlak bir küresel hücrelerin gerçekten de hücre-Tracker Green ile ön-etiketli monositler olduğunu teyit üst panellerin floresans görüntüleri bulunmaktadır. Monosit kümeleri Bazı beyaz oklarla gösterilir. Görüntüler 10X objektif kullanılarak alınmıştır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Proteinler sonrası yapışma deneyi için, endotel hücrelerinin Şekil 2. boyanması. Anlatılan yapışma deneyi gerçekleştirmek sonra, cam lameller üzerine hücreler (A), membran proteinin (CD44) için immünofloresan tabi tutuldu, b) Sitoplazmik protein (tubulin) veya c) nükleer protein (γ-H2AX). (A) ve gösteri monositler Hücre Tracker Green ve sağ panellerde benzer bir görüntü ile önceden etiketlenmiş (20X amacı ile görülen) (B) Sol panel CD44 ve mikrotübüller (kırmızı) ve DAPI lekeli çekirdekleri (mavi) ortaya koymaktadır. Γ-H2AX karşı antikorlar ile boyandı ışınlanmış endotel hücre çekirdekleri için (C) noktasında beyaz oklar. DAPI tarafından parlak bir mavi lekeli Monosit çekirdekleri kolayca endotel hücrelerinin oval biçimli çekirdekleri ayırt edilir. Görüntüler 20X amacı ile alınmıştır.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Endotel hücresindeki açıkça görüldüğü gibi endotel hücrelerinin Şekil 3. yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz boyama. Adezyon deneyinde sonra lamelleri hücreler, yaşlanmış hücrelerin lizozom mavi dönmesine neden olur yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz için boyama maruz kaldığı seçici nedeniyle küçük boyutu ve küresel şekle kolayca tespit sayısız monositler, ile bağlıdır. 20X objektif görünen görüntü. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Bireysel endotelyal hücreler üzerinde monosit kümelerinin Şekil 4. numaralandırma. Adezyon deneyinde sonra hücrelerin görüntüleri alan birçok farklı pozisyonlarda ve monosit kümelerden alındı ​​ve (yeşil) çember. Bir küme, bir endotelyal hücre 10 veya daha fazla veya monositlerin bir aglomerasyon olarak tanımlandı. Görüntüdeki Monosit kümeleri ve 12 gün sonrası ışınlanmış endotel hücreleri sayısı sayısı (kırmızı noktalı) sayıldı ve hesaplanan yapışık endotel hücrelerin yüzdesi 10X objektif ile çekilen Tablo 1. Görüntü gösterildiği gibi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Şekil yapışık monositler floresansının 5. miktarının belirlenmesi. Aşağıdaki Adhe<html> sion deneyi, cam lameller üzerine hücreler tripsinize edildi ve monositlerin endotelyal floresan tek tabaka yapışkanlık dolaylı bir göstergesi olarak, bir floresan plaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür CellTracker Green ile önceden etiketlenir. Belirtilen gün sonrası ışınlama tür ölçümlerden elde edilen sonuçlar ve yukarıdaki grafikte platted bulundu. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Şekil 4&#39;te tarif edilen sonuçlar, ışınlanmış de 12 gün sonra 10 Gy ışınlama, 8-10 oranında gösteren yukarıdaki tabloda verilen üç cam lameller üzerine beş farklı konumlarda 1. Yapışkan endotel hücreleri skorlandı Tablosundan yapışma deneyi skoru Şekil 6. Temsil Endotel hücreler, Yapışkan olmuştur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; yapıştırıcı yüzdesi endotel hücreleri </td></tr><tr><td></td><td> Disc 1 </td><td> Disc 2 </td><td> Disk 3 </td></tr><tr><td> Tarla 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Alan 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Alan 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Alan 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Alan 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Ortalama </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Yapışma deneyi puanları. F de tarif edildiği gibi, üç cam lameller üzerine beş farklı konumlarda Yapışkan endoteliyal hücreler skorlandıŞEKIL 4 ve sonuçlar, 12 gün, 10 Gy ışımadan sonra, ışınlanmış endotel hücrelerinin 8-10 oranında yapıştırıcı haline geldiğini gösteren yukarıdaki tablo.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K Görüntüleme.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

Video: Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Biyomühendislik

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yapışma için Frekans Testi Yerinde Kinetik Analizi