Name: isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

NGL Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatal Girişimi tarafından desteklenmiştir. Biz minnetle yazının eleştirel okuma Maureen McGerty ve Amy E. Furcron (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.

Bu protokolde belirtilen numuneler ile çalışmaya başlamadan önce, hayvan etik onay Yerel Araştırma Etik Kurulu ve Kurumsal Gözden Kurulları tarafından verilmelidir. Hayvan kanı, hücreleri, ya da bu protokolde belirtildiği gibi tehlikeli maddelerle çalışırken, uygun biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği eylemleri takip edilmelidir. 1. Fare Taşıma ve Doku Koleksiyonu <ol><li> Steril bir iş istasyonu hazırlayın ve doku toplama steril araçlar edinin. Bu araçlar büyük ve küçük cerrahi makas, forseps ve ince uçlu cımbız içerecektir. (- 22 ° C 20), oda sıcaklığına dengelendi - (5 mi 3) 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi ile doldurulmuş uygun doku adlarını taşıyan kültür kaplarına, içerir. (- 15 mi 10) da 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş, etiketlenmemiş büyük bir Petri kabı, içerir. </li><li> Hamile bir fare Euthanize (10,5-19,0 ​​gün sonrası coitum (DPC) ya da teslimattan önce) karbondioksit kullanarak (CO 2). Fare ötenazi emin olmak için, servikal dislokasyon tekniği kullanın. Not: 10.5 DPC önce, manüel olarak uterus dokulardan desidual dokuları ayırmak zordur. Desidual lökositlerin izolasyonu gerekli değilse, rahim gebe olmayan farelerin dokularında ya da fareden olanlardan lökositler &lt;10.5 DPC de bu protokol takip edilerek gerçekleştirilebilir. </li><li> Steril cerrahi makas kullanılarak, tam olarak deri ve kas dokusu alt karın kısmı çıkartın. Forseps ile rahim kadar bir kenara diğer tüm organları taşımak ve yumurtalıklar görebilir. Rahim hala bağlı olan, periton boşluğuna (Şekil 1A) dışına hareket ettirmek için forseps kullanır. </li><li> Her uterin boynuz yumurtalık ve uterotubal kavşağına uzak yumurtalıkların bulun. Küçük cerrahi makas kullanarak, uterotubal kavşakta bir kesi yapmak ve rahim damarları içeren mezenter gelen rahim boynuzları ayrı; o zaman,servikste tüketim periton boşluğuna (Şekil 1B) den rahim boynuzları ayırmak için. </li><li> Küçük cerrahi makas ile, serviks ve uterus boynuzları alt segment arasında bir kesi yapmak. Ara uterin boynuzu açma önlemek için bu işlem (Şekil 1C) serviksin bir kısmı eklenmiş. </li><li> Implantasyon siteleri nemlendirmek için - (15 ml 10) 1x PBS çözeltisi ile dolu büyük bir Petri kabındaki (serviks dahil) rahim boynuzları daldırın. </li><li> Hala 1x PBS çözeltisi batırılır iken, küçük cerrahi makas ile rahim boynuzları gelen herhangi bir yağ kırpın. Diseksiyon boyunca 1x PBS çözeltisi dalmış dokuların tutun. </li><li> Forseps ile yerde rahim boynuzları Holding, küçük cerrahi makas (Şekil 1D) kullanılarak arası implantasyon bölgesinde kesti bir enine ile rahim implantasyon sitelerinden birini kaldırın. implantasyon sitesi çevrili fetus içerirkoriyoallantoik membran ve rahim, desidual ve plasental dokuların. </li><li> Forseps kullanarak, yerinde siteyi tutun ve plasenta ve desidual dokularda (Şekil 1E) komşu rahim duvarında küçük bir kesi yapmak. Bu rahim duvarına ve fetus içeren chorioallantoic membran (Şekil 1F) hem ayrılmış hale gelene kadar plasenta / desidua çevresinde Trim. </li><li> 1x PBS çözüm plasenta ve ekli desidual doku ve yer çıkarın (3-5 ml; adım 1.12 bakınız). </li><li> (- 5 mi 3) 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabındaki uterus dokularının bağlı chorioallantoic membran ile çevrelenmiş fetus yerleştirin. Bu dokuların hidrasyon rahim duvarından korioallantoik membranın ayrılmasını kolaylaştıracaktır (adım 1.14 bakınız). </li><li> Ince uçlu bir cımbız kullanarak, yavaşça plasenta yüzey desidual doku (beyaz-gri tabaka) soyun. Bu gerçekleştirinplasenta ve desidual dokularda (Şekil 1G) bütünlüğünü korumak için dikkatli adım. </li><li> (- 5 ml her 3) 1x PBS çözeltisi ile doldurulmuş iki ayrı etiketli Petri kapları plasenta ve desidua dokuları yerleştirin. </li><li> Yavaşça ince uçlu cımbız ile chorioallantoic zarından rahim duvarına çıkarın. Bu rahim dokulardır. </li><li> (- 5 mi 3) 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabındaki uterus dokularının yerleştirin. </li><li> Tüm implantasyon yerleri işlendikten yineleyerek 1.15 ile 1.8 adımları. </li><li> Enzimatik sindirim sırasında hücre verimini artırmak için çok sayıda uterin, desidual ve plasental dokularda toplayın. dokuların miktarı çöp boyutuna bağlıdır; Bununla birlikte, lökosit yalıtım doku&gt; 2 adet gerektirir. Not: Farklı gestasyonel günlerde implantasyon sitelerinin diseksiyonu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için, soruşturmalar için Kılavuzu, Bölüm İki bulunan resimleri görüntülemekFare Gebelik 42 üzerinde. </li></ol> 2. Rahim, Desidual ve Plasental Doku Ayrılma <ol><li> Uygun doku isimde çok sayıda steril 2 ml konik tüpler etiketleyin ve buz üzerinde enzimatik solüsyon 1,000 ul bir şişe yerleştirin. </li><li> Etiketlenmiş bir 2 ml konik tüp, uterin, desidual ya da plasental dokularda - (150 ila 100 mg), 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş petri, iki parça aktarın. </li><li> Her bir 2 ml konik tüp içine soğuk bir enzimatik solüsyon 500 ul ekle. </li><li> Ince steril makas ile, ince kıyılmış kadar enzimatik solüsyon batırılır doku ayırmak başlar. Zamanla, süspansiyon sütlü bir görünüm geliştirecektir. Bu aşama, örneğin aşırı manipülasyonu önlemek için en fazla 2 dakikayı geçmemelidir. </li><li> Doku ayrışmış sonra, 2 ml konik tüp, soğuk enzimatik solüsyonun bir ilave 500 ul ekle. </li><li> Buz üzerinde 2 ml konik tüp yerleştirin. </li><li> Tüm dokular işlendikten yineleyerek her doku ile 2.6 ile 2.2 arasındaki adımları. </li><li> 37 ºC bir inkübatör içine buz homojenize doku (kıyılmış dokuya + enzimatik solüsyon) numuneler ile tüm 2 ml konik tüpler aktarın ve nazik bir yörünge ajitasyon (80 rpm) gerçekleştirin. 35 dakika - 30 inkübe. Kuluçka sıcaklığı inkübasyon süresi başlamadan önce stabilize olduğundan emin olun. </li><li> İnkübasyon sonrasında, inkübatör ayrışmış dokularla 2 ml konik tüpler çıkarın ve başka sindirim önlemek için buz üzerine koyun. </li><li> Doku tipine bağlı olarak, steril 50 ml konik tüp etiketleyin. Kapakları çıkarın ve steril bir hücre süzgeç (100 mikron gözenek boyutu) ile değiştirin. </li><li> ~ 1 x PBS çözeltisi 20 ml hücre süzgecinden konik tüp kullanılarak 2 ml ayrışmış dokuları dökün. doku fragmanları hücre süzgecinden kalır ve hücre süspansiyonu içinden geçecek. </li><li> Di yıkayınhücre süzgecinden ssociated dokular 2 - Bir transfer pipeti kullanarak, 1x PBS çözeltisi, 20 ml ile 3 kez. </li><li> Boş 2 ml 1 x PBS çözeltisi (1 mi) ile konik tüp durulayın ve hücre süzgeçler yoluyla içeriğini dökün. </li><li> 50 ml konik tüpler hücre süzgeçler çıkarın ve kapaklarını değiştirin. 4 ºC de 10 dakika boyunca 1.250 xg&#39;de tüpler santrifüj. </li><li> Dikkatle, hücre pelet bozmadan süpernatant aspire. Hücre pelet izole lökositler ve stromal hücreler içerir. </li><li> Fetal sığır serumu (FBS) içermeyen RPMI kültür ortamı, 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Hafifçe karıştırın. Vorteks kullanmayın. </li><li> 5 ml polistiren plastik tüp düzgün FBS 500 ul ekleyin ve yavaş yavaş hücre süspansiyonu kaplaması. </li><li> Hücresel kalıntı PBS / FBS arayüzde korunur ise, oda sıcaklığında freni olmadan 1,100 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj canlı hücre pelet. </li><li> Hücre pelet dokunmadan süpernatant aspire. cell pelet çoğunlukla canlı hücreleri içerir. </li><li> İsteğe bağlı: Aşağıda açıklandığı gibi mononükleer hücreleri konsantre etmek,% 20 doymuş polisakkarit çözümü kullanın. <ol><li> FBS&#39;siz RPMI kültür ortamının 1000 ul hücre pelletini. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir 5 ml polistiren plastik tüpe% 20 doymuş polisakarit çözeltisi 1 ml ilave edilir ve yavaşça, bu çözeltinin üzerine hücre süspansiyonu kaplar. Örnek katman birlikte, hücre süspansiyonu% 20 doymuş polisakarit çözeltisi karıştırma kaçının. </li><li> Frensiz oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 xg&#39;de bir salıncak-out rotorlu santrifüj. Bu hücrelerin karıştırma ve degrade kaybetmemek için fren kapatmak için çok önemlidir. Mononükleer hücreler,% 20 doymuş polisakarit çözeltisi ve 1 x PBS çözeltisi arasında arayüzde bulunacaktır. </li><li> Aspire ve süpernatant atın. Hücre topağı çoğunlukla mononükleer hücreleri içerir. Hayırte: gerçekleştirmek için adım 6&#39;ya bakınız, izole lökositlerin hücre kültürü gerçekleştirmek için adım 5. bkz canlılık boyama ve sadece dışı boyama gerçekleştirmek için adım 4. bkz immünofenotıpleme gerçekleştirmek için 3. adımı bkz canlılık boyama ve hücre içi boyama gerçekleştirmek için Manyetik hücre sıralama, adım 7 bkz. </li></ol></li></ol> Tamir edilebilir Hücreler 3. geçerlilik boyaması <ol><li> 1x PBS çözeltisi 1.100 ul hücre pelletini. Hafifçe mikro-pipet kullanılarak karıştırılır. </li><li> 5 ml&#39;lik bir polistiren plastik tüp içine hücre süspansiyonu 100 ul aktarın. 5 ml polistiren tüp 1x PBS çözeltisi 400 ul ekleyin. Bu tüp, doku bir oto-floresan için kontrol edilmesidir. Adım 3.5 kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Yeni 5 ml polistiren plastik hücre süspansiyonunun tüpe Geriye kalan 1000 ul aktarma. Canlılık boya 1 ul ekleyin ve hafifçe homojenize. 4 ° C&#39;de karanlıkta 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> İnkübasyon sonrasında, 1,000 &amp; # ekleyin181; 1 x PBS çözeltisi l. Elle hafifçe karıştırın. </li><li> Santrifüj her ikisi de 5 ml polistiren tüpler 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1250 x g&#39;de (3.2 ve 3.3 adım). Aspire ve süpernatant atın. Not: hücre topağı (aşama 3.3), doku bir oto-floresan için bir kontrol olarak hizmet edecek aşama 4. hücre topağı (aşama 3.2) kullanılır. </li></ol> 4. İmmünofenotipleme <ol><li> Anti-fare CD16 / CD32, 50 ul hücre pelletini (1 seyreltilmiştir: FACS tampon maddesi içinde 100 [% 0.1 BSA,% 0.05 sodyum azid, 1x PBS çözeltisi, pH 7.4]). Yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın. Vorteks kullanmayın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C de karanlıkta 5 ml polistiren bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, hücre-dışı hücre yüzey markörlerinin veya izotip-eşleştirilmiş kontrol antikoru ile reaksiyona sokulması her anti-lökosit monoklonal antikor 50 ul (antikor seyreltme doğrulanması gerekir) ekleyin. Örneğin, lökosit alt popülasyonları analiz anti-mo kullanmak içinCD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 (Tablo 1): Aşağıdaki lökosit hücre yüzey belirteçleri ile reaksiyona antikorları kullanır. </li><li> Hücre-dışı belirteçleri karşı antikorlar, 5 ml polistiren plastik tüpe ilave edildikten sonra, yavaşça karıştırın. 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. </li><li> Bu kuluçka sırasında hazırlanması ve (iyonu giderilmiş su ile seyreltildi, 1: 5) sabitleme tampon çözeltisi önceden ısıtmak, gerekirse 37 ºC&#39;ye. Kullanımı gereklidir kadar karanlıkta 37 ºC &#39;de tampon tutun. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, 5 ml polistiren plastik tüp FACS tampon 500 ul ve hafifçe karıştırın. Bu adım, hücrelerin yıkayın ve bağlanmamış antikor fazlasını uzaklaştırmak için gereklidir. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de örnekleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. Not: hücre içi boyama gerekli değilse, hücre içi boyama gerekli ise, adım 5 bkz geçirgenliği yapmak ve hücreler arasıular boyama burada ve daha sonra sabitleme (adım 4.8) ile devam edin. </li><li> Hücre pelletine önceden ısıtılmış sabitleme tampon çözeltisi 500 ul ilave edin ve 37 ° C &#39;de 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilir. </li><li> 5 ml polistiren plastik tüp içine FACS tampon 500 ul koyun. Hafifçe karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de örnekleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. </li><li> Her bir örnek için FACS tampon 500 ul ekle. Bu örnekler hemen akış sitometrisi ile analiz edilebilir. En iyi sonuçlar için derhal örnekleri edinin. </li></ol> Unfixable Hücreler 5. geçerlilik boyaması <ol><li> Hücre-dışı immünofenotiplendirme sonra FACS tampon 500 ul hücre pelletini. </li><li> Sadece örnek elde edilmesinden önce 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI, 200 ug / ml) 1 ul ekle. </li><li> Debi sitometresinde DAPI ekledikten sonra 2 dakika - 1 içindeki örnekleri gözünüzde canlandırın. </li></ol><ol><li> Steril bir davlumbaz altında bir iş istasyonu hazırlayın. Bir su banyosu kullanılarak 37 ° C RPMI kültür ortamının önceden ısıtın. </li><li> Hücre sayımı için FACS tampon 1000 ul hücre pelletini. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi kullanılarak canlı hücre sayısı, saymak. Toplam canlı hücre sayısını kaydedin. </li><li> Santrifüj 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de hücreler 10 dakika FACS tampon kaldırmak için. </li><li> Yavaşça 2-3 kez pipetleme önceden ısıtılmış RPMI kültür ortamında 500 ul hücre pelletini. </li><li> Steril 24 oyuklu bir plaka içerisinde hücrelerin istenilen sayıda plaka ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kuluçka süresi araştırma sorusu ile belirlenecektir. </li></ol> 7. Manyetik Hücre Ayırma <ol><li> MS sütunlar, manyetik hücre ayırıcı, 15: Aşağıda yer alan maddelerle temiz bir iş istasyonu kurmakml konik tüpler, 30 mikron ön ayırma filtreleri ve bir çok standı. </li><li> MACS tamponu (% 0.5 BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS çözeltisi, pH 7.2) içinde 500 ul hücre pelletini. </li><li> Otomatik Hücre sayıcı veya hemasitometre ve% 0.4 tripan mavisi çözümü kullanarak, saymak ve toplam canlı hücre sayısını kaydedin. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. MACS tamponu başka 500 ul ekleyin. </li><li> Üreticinin önerilerine aşağıdaki manyetik ayırma gerçekleştirmek için devam edin. </li><li> Flow sitometri veya mikroskop ile saflığını belirlemek. </li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları anlatmaktadır.

maternal-fetal arayüzünde sızan lökositlerin bolluğu ve fenotipik özelliklerini kaydeden tutarlı veri toplanması gebelikle ilgili komplikasyonlar patogenezini anlamak için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 31,38,39,43-46 boyunca anne-fetal arayüzünde Fare dokularından elde lökositlerin infiltre izolasyonunu kolaylaştırmak olduğu tarif edilmiştir. Ancak, her teknik farklıdır, her zaman izole hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzimler veya enzim kombinasyonları farklı kullanır gerektiren farklı ayrışma süreleri, doku miktarları belirtmez ve. Bu tarifnamede tarif edilen protokol, yüksek yaşama kabiliyetiyle, maternal fetal arayüzünde Fare dokularından elde lökositlerin infiltre izolasyonunu sağlar ve valide ayrıntılı ticari reaktifler ile ilgili bilgileri, tampon hazırlanması, doku miktarları ve inkübasyon sürelerini içerirLaboratuvar. Lökosit izolasyon işleminin en kritik adımlardan biri, doku ayrışma; Bu adım, fenotipik karakterizasyonu 47&#39;de kullanılan hücre dışı proteinlerin bütünlüğünü değiştirebildiği mekanik homojenleştirme ve / veya enzimatik reaksiyonları içerir. Bu tarifnamede tarif edilen protokol plasenta ve farelerin desidual ve uterus dokularından izole lökosit hücre dışı belirteçlerin bütünlüğünü korumak için hafif bir mekanik ve enzimatik doku ayrılma tekniklerinin kullanılmasını birleştiren yeni bir yaklaşım sunmaktadır. Tek enzimler ve farklı enzimlerle kombinasyonları maternal fetal arayüz 31,32,39,44 sıçangil dokulardan süzücü lökositlerin izole etmek için kullanılmıştır. Birçok durumda, laboratuarda elle belli konsantrasyonlarda hazırlanır, bu enzimler, insan hatası tabi olabilir. Burada, bunun yerine, kullanıma hazır bir kullanım saflaştırılmış kolajenaz / nötr protkokteyl, Accutase, laboratuvarda uygulamaya konmuştur kolaylığı; Bir ticari olarak temin edilebilen enzim preparatı olarak, hücre kültürü 48&#39;deki güvenilir sonuçlar gösterilmiştir. Bu enzimatik solüsyon yüzeyi kaybetmeden 48 antijenleri olmadan etkili, daha da önemlisi, kazıma olmayan kültür plakalarından makrofajlar ayırmak için bilinmektedir. Hazırlanan bu enzim, aynı zamanda daha sonra kültür 47 izin veren, uzun süreler boyunca sürdürülebilir kalan canlı izole hücrelerde elde edilen, insan ve hayvan sinir sistemi dokuların sindirim işlemek için kullanılmıştır. Ayrıca, bu enzimatik çözelti, merkezi sinir sistemi 47 izole edilmiş hücrelerde CD24 antijenliğini korur. Liberase®-1, kollajenaz ve nötr proteaz başka kokteyl, ne Accutase ne Liberase®-1 serbest DNA agrega üretmek için karşılaştırıldığında; Ancak, Accutase doku ayrılma 47 sırasında Liberase®-1 den nazik olduğunu. kolajenaz / nötr proteaz koBu protokolde kullanılan cktail da CD44, bir kanser kök hücre yüzey belirteci 49 korunmasında tripsin üstünlük göstermiştir. Bu laboratuvarın çalışmaları sürekli bu enzimatik solüsyon fare lökosit yüzey antijenleri koruduğunu kaydetti. Gerçekten de, bilgilendirici farklılıklar makrofajlarda hücre dışı markerlerin ifadesi bulunmuştur (CD11b + F4 / 80 + hücreleri), nötrofil (CD11b + Ly6G + hücreleri), NKT hücreleri (CD3 + CD49b + hücreleri), T hücreleri (CD3 + hücreleri) ve B CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L ve CTLA4 ve sitokin salınması ile dahil olmak üzere hücreleri (B220 + CD19 + hücreleri). Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem için temsili sonuçlarda görüldüğü gibi, farelerde maternal-fetal arayüzünde lökositlerin infiltre immünfenotipleme için en uygunudur. Bu yöntemin önemli bir avantajı canlılığı kapısı içinde çeşitli hücre dışı ve hücre içi antijenlerin aynı anda belirlenmesidir. boya en de kullanılantermine hücre canlılığı propidyum iyodür (PI) &#39;dir; sadece FITC ile kombinasyon halinde kullanılabilir Bununla birlikte, kullanımı sınırlıdır. PI yeterince mavi ve kırmızı lazerlerden 50 heyecan çoğu diğer fluorochromes ayırt edilemez olmasıdır. Bir çözüm DAPI 50 veya UV lazerler tarafından değil yaygın immünofenotiplendirme için kullanılan mavi ve kırmızı lazerler tarafından heyecan herhangi başka bir boya kullanmaktır. Bu unfixable hücreler veya tamir edilebilir hücreler için canlılığı, boyanın kullanımı için DAPI 50 kullanımını içerir şekilde Bu protokol, yaşayan hücrelerin immünofenotıpleme sağlar. Bu tarifnamede tarif edilen protokolün bir ikinci önemli avantajı, canlı hücrelerin yüksek bir verimle lökositlerin izole izin vermesidir. Örnek veriler izole edilmiş hücrelerin% 70 ile 89,% uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Bu protokol, maternal fetal arayüzünde sıçangil dokulardan izole hücrelerin fonksiyonel özelliklerinin çalışma imkan veren bu büyük bir önem taşımaktadır. Fveya örneğin, desidual ve uterin makrofajlar ve stimülasyon altında sitokin salınımının çalışmanın kültürleri, bu yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Canlılığını muhafaza etmek için 1), doku toplanması periton boşluğunu açıldıktan sonra 5-10 dakika içinde gerçekleştirilmelidir ve bu dokuları buz üzerine yerleştirilmelidir: aşağıdaki faktörler göz önüne alındığında, başarılı sonuçlar elde etmek için, tarif edilen protokol uygulanması önemlidir izole edilen hücreler; 2) Mekanik doku homojenizasyon ince uçlu makas kullanılarak yapılmalıdır ve uzun süreler canlı hücrelerin verimi azaltmak için gösterilmiştir beri 2 dk geçemez; Aktivitesi bu süre sonrasında azalır çünkü 3) enzimatik solüsyon ile inkübasyon süresi en az 1 saat olmalıdır; 4) enzimatik solüsyon ile inkübasyon sıcaklığı bu enzim kokteyli optimal aktivitesi elde etmek üzere 37 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekmektedir; 5) Hücre peleti manipgirdap kullanımı hücrelerinin bütünlüğünü (izole hücreler kolayca canlılığını azaltabilir farklılaşmış ve ani manipülasyon vardır) zarar verebilir, çünkü ulation mikropipetler ile nazikçe yapılmalıdır; 6) tampon ve santrifüj sıcaklıkları hücre süspansiyonu olarak aynı sıcaklıkta tutulmalıdır; Onların canlılığı hızla azaltır 7) izole hücreler immünofenotiplendirme için işlenen veya hemen kullanılmalıdır; immünofenotıpleme yaparken ve 8), numune en iyi sonuçlar için sitometresi hemen akış kullanılarak elde edilmelidir. Bu protokolün bir sınırlama benzer fonksiyonları, örneğin, tripsin, dispase II ve kollajenaz ile diğer enzimler daha pahalı enzimatik çözümün maliyeti vardır. Ancak, bu enzimatik solüsyon üzerinde ve açıklanan enzimler üzerinde görüntüler avantajlar üstündür. Immünofentipleme ve hücre kültürü ve sıralama yanı sıra, bu protokolün gelecekteki uygulamalar nu vardıryanında bir çok ve çeşitlidir. Örneğin, izole edilmiş lökositlerin in vitro lökosit işlev (örneğin, fagositoz, sitotoksisite, T-hücresi çoğalması ve plastisite deneyleri, vb), ve reaktif oksijen türlerinin üretimi, DNA metilasyonu, hedef genlerin ekspresyonunu, tespit etmek mümkündür Maternal Fetal arayüzünde fare dokulardan. Gerçekten de, maternal-fetal arayüzünde sıçangil dokularda, yeni ve nadir lökositlerin tanımı da gerçekleştirilebilir.

Ayırt edici değişiklikler annenin bağışıklık sisteminde ortaya çıktığında gebelik bağışıklık tolerans bir dönemdir. Bu değişiklikler anne fetus, yarı allojenik greft 1 tahammül sağlar. Fetus baba büyük doku uygunluk kompleksi (MHC) 2 antijenleri ve fetal hücreler anne dolaşımında 3 bulunmuştur ifade eder; Ancak, fetus, 4,5 vazgeçmiş değiliz. Bu muamma tam olarak anlaşılmış değildir. En son hipotez maternal-fetal tolerans cinsel birleşme sırasında oluşturulan ve 6,7 döllenme ve tam süreli gebeliği 8-10 sürdürmek için muhafaza belirtiyor. Bu maternal-fetal tolerans dökümü gebeliğin 10-16 erken ve geç evrelerinde hastalık mekanizmasını kabul edilir. Maternal-fetal tolerans T hücreleri (düzenleyici T hücreleri, Th1 hücreleri, Th2 hücreleri ve Th17 hücreleri), mac dahil olmak üzere çeşitli lökosit alt popülasyonları, katılımını gerektirirrophages, nötrofiller, mast hücreleri, NK hücreleri, ve NKT hücreleri, dendritik hücreler ve B hücreleri, gebelik 15,17-19 boyunca yoğunluk ve lokalizasyon bu değişiklik. Annenin bağışıklık sistemi cenin antijenler 20,21 ile etkileşime anatomik sitede - Maternal-Fetal tolerans maternal-fetal arayüzü 20&#39;de zenginleştirilmiştir. Fetal extravillous trofoblastların rahim mukozası 22-24 istila ettiğinde maternal-fetal arayüz plasenta sırasında oluşturulur. Bu arayüz fetal tarafında, fetüsü çevreleyen zarlar plasenta içindeki özel bir epitel yüzey oluşturmak ve sinsityotrofoblast hücreleri anne kanındaki 22 ile doğrudan temas yoluyla besin alışverişini kontrol eder. Arayüzü maternal tarafında, Desidua farelerde bütün desidual hücrelerde% 50% 30&#39;unu lökositlerin heterojen havuz işe. MATERN katılımları yanı sıraEl immun tolerans, bu hücrelerin gebelik sırasında farklı süreçler, örneğin., enfeksiyonlar, döllenmenin gelen üreme sisteminde korunması, embriyo implantasyonu 7,25, desidual anjiyogenez 26 vasküler remodeling 24,27, trofoblast invazyonu 28, plasental anahtar sebeplerindendir kalkınma 24,25 ve nihayetinde, emek ve dağıtım 15,17. Bu nedenle, maternal-fetal tolerans katılan lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonların patogenezi aydınlatılması esastır. Immünhistokimyasal ve immünofloresan kullanımı doğrudan görselleştirme ve uterin, desidual veya plasental lökositlerin 29,30 lokalizasyonu için veri üretti ederken, ayrıca bu dokuların 31,32 her lökositlerin belirli alt kümelerini ortaya çıkarmıştır sitometri analizi akış. Ayrıca, sitometri yoğunluğu ve mater oranını belirlemek için kullanılır olmuştur akışNAL fetal arayüz hücre dışı ve hücre içi proteinlerin 8-10,34 33 ve ekspresyon seviyelerini lökosit. Maternal-fetal arayüzünde lökositlerin sitometrik akış analizi tek bir hücre süspansiyonu gerektirir. Desidual, rahim ve plasenta dokularından süzücü lökositlerin izole etmek için, doku ayrışma için iki yöntem kullanılmıştır: mekanik ve enzimatik. Her iki yöntem de, bu dokuların hücre dışı matrisin (ECM) ile ilgili infiltre lökosit ayrılmasını sağlar. Daha az kesme kuvveti ile ilişkili hasar 35 ile lökositlerin yüksek verim verir gibi enzimatik doku ayrışma mekanik doku ayrılma üstündür. Sonuç olarak, mekanik doku ayrışma örnekleri değişkenliği ve heterojenitesini artırabilir dokuların 36, havuzlama gerektirir. Bununla birlikte, mekanik ayrıştırma İlgi konusu antigen enzimatik ayrışma veya değiştirilebilir zaman seçim olabilir hücre işleviFaiz ihtiyacı s korunacak (örn., NK hücrelerinin sitotoksisite) 35. ECM aşağılamak özel enzimlerle proteoliz kullanımı mekanik ayrışma ile gözlenen düşük verim ortadan kaldırır. Çeşitli çalışmalar tripsin 32, kollajenaz 37, DNaz 31, 38 dispase ve çeşitli enzimlerin 32,39 ticari kokteyller kullanımını bildirmişlerdir. Bununla birlikte, doğal ve farklı enzim konsantrasyonu ve sindirim süresi titizlikle tanımlandığı gibidir ve immünofenotipleme için gerekli olan hücre yüzeyi antijenik epitopların bütünlüğünün korunmasını sağlamak için doğrulanması gerekir. Çeşitli yüzey yapıları bir çok monoklonal antikorlar tarafından tanınan lökosit yüzey epitoplarını sıyırma için ünlü olan tripsin gibi bazı enzimler ile, farklı enzimlerin yok farklı olarak duyarlı olan. Bu tarifnamede sunulan bir proteolyt kullanılan bir yöntem olupAccutase denilen ic ve kolajenolitik enzimatik kokteyl. Bu enzimatik solüsyon kadar anne-fetal arayüzünde sıçangil hücreleri ayrıştırma sırasında halen etkin nazik ve ayrışma reaksiyonu sonlandırmak için başka ayrışan reaktifler veya serum eklenmesini gerektirmez. Ayrışma zamanı doğrulanması gerekiyor, ancak Ayrıca, yukarıda belirtilen enzimler 40,41 daha sağlamdır, tedarik edildiği gibi kullanıma hazırdır ve. Doku ayrıştırma her iki tip bir kombinasyonunun kullanılması elde edilen hücrelerin kalitesi ve miktarı artırır; Böylece, çeşitli çalışmalar tatmin edici sonuçlar 31,32,37 ile mekanik ve enzimatik ayrılma kombine kullanımının hayata geçirdik. Burada tarif edilen bir protokol kurulmuş ve laboratuvarda doğrulandı; o sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif bir mekanik ayrışma bir arada kullanır. Bu protokol izolasyonu ve daha fazla çalışma izin verirmaternal-fetal arayüzünde fare dokularda sızan lökositler (rahim, desidua ve plasenta). Akış sitometrik analizi ile gösterildiği gibi, aşağıdaki protokol aynı zamanda, hücre yüzey belirteçleri ve aşağı doğru uygulamalar için verim kadar canlı hücre bütünlüğünü korur. Son olarak, bu protokol analizi ve maternal-fetal arayüz oluşturan farklı fare dokuların karşılaştırma için hücre hazırlama tutarlılığını korumaktadır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Magentic Cell Separation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m pre-separation filters</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Laboratory preparation</td><td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accutase enzymatic solution</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse extracellular antibodies</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD viability dye</td><td>Life Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Fixation buffer solution</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>Laboratory preparation</td><td>0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0.4%</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Additional Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Incubator with shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system</td><td></td><td></td><td>laboratory constructed</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubator 3307</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Precision</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td></td></tr><tr><td>Optical and fluorescence microscopes</td><td>Zeiss and Olympus</td><td>Zeiss LSM780 and Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

Gebelikte immün tolerans annenin bağışıklık sistemi gelişmekte fetusun kabul ve beslemek için ayırt edici değişikliklere uğrar gerektirir. Bu hoşgörü, cinsel birleşme sırasında başlatılan döllenmenin ve implantasyon sırasında kurulan ve gebelik boyunca korunur. Maternal-fetal hoşgörü Aktif hücresel ve moleküler arabulucular plasenta ve uterus ve desidual dokuları içeren maternal-fetal arayüzü olarak bilinen fetal ve maternal dokular arasındaki temas yerinde zenginleştirilmiştir. Bu arayüz, stromal hücreleri ve infıltre edici lökositler oluşur ve bunların bolluğu ve fenotipik özellikleri gebelik boyunca değişir. Maternal fetal arayüzünde infiltre eden lökositlerin gebeliği ayakta yerel mikro-ortam yaratmak nötrofiller, makrofajlar, dendritik hücreler, mast hücreleri, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve NKT hücrelerini içerir. Bu hücrelerin ya da herhangi bir inapprop arasındaki bir dengesizlikOnların fenotipleri de yaklaşımlarına yön değişiklik gebelikte hastalığın mekanizmasını kabul edilir. Bu nedenle, maternal-fetal arayüz sızmak lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonlara neden bağışıklık mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Burada tarif edilen bir proteolitik ve maternal-fetal arayüzünde fare dokulardan sızan lökositlerin izole etmek kolajenolitik enzimatik kokteyl ile sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif mekanik ayrışma bir arada kullanan bir protokoldür. Bu protokol, yeterince korunmuş antijen ve fonksiyonel özelliklere sahip uygun bir lökosit (&gt;% 70) yüksek sayıda izolasyon sağlar. İzole edilmiş lökositlerin daha sonra immunofenotip hücre sıralama, görüntüleme, immunoblotting, mRNA ekspresyonu, hücre kültürü, ve karışık bir lökosit reaksiyonları, proliferasyon, sitotoksisite veya tahlilleri gibi in vitro fonksiyonel deneyleri de dahil olmak üzere çeşitli teknikler ile analiz edilebilir.

maternal-fetal arayüzü fare dokuların diseksiyonu Şekil 1&#39;de gösterilmiştir; Bu prosedür, periton boşluğu (Şekil 1A, B), emplantasyon yerlerinin (Şekil 1D) içeren rahim boynuzları (Şekil 1C) ve uterus dokularının toplama (Şekil 1E), plasenta (Şekil 1F) ve desidual dokuları açıklığı kapsamaktadır 16.5 at (Şekil 1G) DPC. Şekil 2 izole makrofajlar morfolojisi göstermektedir (F4 / 80 +) manyetik hücre sıralama kullanarak 16.5 DPC de desidual ve rahim dokulardan topladı. İzole makrofajlar (veriler gösterilmemiştir) sitokinlerin serbest yeteneğini korur. desiduada, uterus ve plasentasından izole edilmiş canlı hücreler verimi, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir, ve hücre canlılığı, tüm dokularda daha fazla 70%&#39; dir. Şekil 4 polymorphonucle analiz etmek için yolluk stratejiyi gösterir<html> T hücreleri (CD45 +, CD3 +), nötrofil (CD45 + Ly6G +), makrofajlar (CD45 + F4 / 80 *), dendritik hücreler (CD45 + CD11c +) ve NK hücreleri de dahil olmak üzere tekli ve canlılık kapıları içindeki Ar ve mononükleer lökositler, (CD45 + 16.5 DPC&#39;de at CD49b +). Co-express CD11c makrofajlar yüksek bir oranda. Şekil 5 16.5 DPC de nötrofiller, makrofajlar ve T hücrelerini desidual, uterin ve plasental dokuların gösterir. 6 Şekil, singletlerin ve canlılık kapıları içinde lenfositlerin analiz de dahil olmak üzere yolluk stratejisini gösterir T hücreleri (CD45 +, CD3 +) ve 16.5 DPC de B hücreleri (CD45 + B220 +). T-hücreleri, CD4 + ve CD8 + T hücrelerini içerir. Maternal fetal arayüzünde Murin dokular aynı zamanda yüksek oranlarda CD3 + CD4-CD8- (gamma-delta T hücreleri) içerir. 7 desidual, rahim, T hücreleri ve B hücrelerini göstermektedir ve 16.5 DPC de plasental dokularda. jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Şekil 1. Doku diseksiyonu. Bir B6 fare 16.5 DPC (A) Rahim boynuzları. rahim boynuzları mezenter ve boşaltma gemilere bağlıdırlar. (B) Uterus boynuzları mezenter disseke ve hala serviks bağlı. Implantasyon siteleri ve serviks dahil (C) Uterus boynuzları. Bir implantasyon sitesinin (D) Diseksiyon. Implantasyon yeri uterus dokularının (E) Diseksiyon. Implantasyon sitesinden plasenta ve desidua (F) ayrılması. (G) Müfreze plasenta desidua (beyaz-gri tabaka) evi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52866/52866fig2highres.jpg" width="500" /><html> Şekil 2. Makrofajlar desidual ve rahim dokulardan izole. Makrofajlar (F4 / 80 + hücreler) manyetik hücre sıralama kullanarak 16.5 DPC de desidual ve rahim dokularından izole. 20X büyütme. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52866/52866fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil izole hücrelerin 3. Canlılık. Desidual, rahim ve plasenta dokulardan izole Canlı hücreler (oklarla temsil DAPI- hücreleri). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> &quot;/&gt; Polimorfonükleer ve mononükleer lökositler için Şekil 4. Yolluk stratejisi. Toplam lökosit nüfus singletlerin ve canlılık kapıları içinde Geçitli. T hücreleri (CD45 +, CD3 +), makrofajları (CD45 + F4 / 80 *), nötrofil (CD45 + Ly6G +), dendritik hücreler (CD45 + CD11c +) ve NK hücreleri (CD45 + CD49b +) (toplam-lökosit kapı içinde geçitlendi CD45 +). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg" width="600" /> Maternal fetal arayüzünde sıçangil dokularda Şekil 5. Nötrofiller, makrofajlar ve T hücreleri. Nötrofiller (CD45 + Ly6G +), makrofajları (CD45 + F4 / 80 *), ve T hücrelerinin (CD45 +, CD3 +) canlılığı olan geçitlendi ve toplam lökosit (CD45 +) izole desidual, rahim ve plasenta hücreleri kapıları.tps: //www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52866/52866fig6highres.jpg" width="600" /> Şekil 6. lenfositler için Yolluk stratejisi. Mononükleer hücreler singletlerin ve canlılık kapıları içinde kapı bulundu. T hücreleri (CD3 +) ve B hücreleri (B220 +) canlılık kapı içinde kapı edildi. CD4 + ve CD8 + T hücreleri, T-hücresi kapısı (CD3 +) bünyesinde kapılı bulundu. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig6highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52866/52866fig7highres.jpg" width="600" /> Maternal-fetal arayüzünde fare dokularda Şekil 7. Lenfosit alt popülasyonları. T hücreleri (CD3 +)ve B hücrelerinin (B220 +) izole desidual, rahim ve plasenta hücrelerinin canlılığı kapı içinde kapı edildi. CD4 + ve CD8 + T hücreleri, T-hücresi kapısı (CD3 +) bünyesinde kapılı bulundu. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig7highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hücre işaretleyici </td><td> Florokrom </td><td> Klon </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> CANLI / DEAD </td><td> DAPI </td><td> - </td><td> Life Technologies </td><td> L23105 </td></tr><tr><td> CD45 </td><td> Üzerine V450 </td><td> 30-F11 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560.501 </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> FITC </td><td> 145-2C11 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553.062 </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> APC </td><td> RM4-5 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553.051 </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> PE-CF594 </td><td> 53-6,7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 562.283 </td></tr><tr><td> B220 </td><td> APC-Cy7 </td><td> RA3-6B2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 552.094 </td></tr><tr><td> F4 / 80 </td><td> PE </td><td> BM8 </td><td> eBiosciences </td><td> 12-4801-82 </td></tr><tr><td> Ly6G </td><td> APC-Cy7 </td><td> 1A8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560.600 </td></tr><tr><td> CD49b </td><td> APC </td><td> DX5 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560.628 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> PE-Cy7 </td><td> HL3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 558.079 </td></tr></tbody></table> Antikorların Tablo 1. listesi lökosit alt kümesi immünofenotiplendirme için kullanılan

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.2K Görüntüleme.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

Video: Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Tıp

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

<meta charset="utf8"></head><body>Akış Sitometrisi için Fare Akciğerlerinden İmmün ve İmmün Olmayan Hücrelerin İzolasyonu

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu