Name: non-invasive imaging of the innate immune response in a zebrafish larval model of streptococcus iniae infection
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection at JoVE.com

Yazarlar Zebra balığı bakımı ve bakım için laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, EA HARVIE Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü A155397 ve Anna Huttenlocher NIH R01GM074827 tarafından desteklenmiştir.

Yetişkin ve embriyonik zebra balığı Wisconsin-Madison Araştırma Hayvan Kaynakları Merkezi Üniversitesi uyarınca tutuldu. 1. Mikroenjeksiyon İğneleri hazırlanması <ol><li> Çekme 5, hava zaman başında, hız 80, zaman 70, hava saati, hava basıncı 200, ısı 502 90 çekin: Aşağıdaki ayarlarla bir mikropipet çektirmesi cihazı kullanılarak ince duvar cam kılcal enjeksiyon iğneler (1.0 OD / 0.75 ID) hazırlayın çekme 5 sonunda. </li><li> Ucu açıklığı yaklaşık 10 mikron bir çapa sahip olacak şekilde çekilmiş iğne ucu kesiyorum, ince cımbız kullanarak. </li></ol> 2. hazırlanması Larva Enjeksiyon Yemekleri <ol><li> Steril su içinde yaklaşık 4-5 mm şerit genişliği ile bir jel tarağı durulayın ve kurumaya bırakın. </li><li> Çözelti berraklaşıncaya kadar E3 orta 19 ve mikrodalgada% 1.5-2, yüksek erime sıcaklığı olan agaroz çözelti hazırlayın. Soğutulmuş sonra, bir Petri kutusu (100 x 15 mm), girdap içine agaroz bazı dökünyeterli agaroz ekleyerek tamamen çanak alt kapsayacak. </li><li> Agaroz tabaka katılaşmış sonra olmayan penye sonu sadece Petri kabı üstünde dinlenme ve penye son agaroz dokunmadan böylece, üstüne durulanır ve kurutulur jel tarağı yerleştirin. Alt agaroz tabakası ile ilgili 30 ° açı oluşturarak, tarak mümkün olduğunca yatay olduğundan emin olun. </li><li> Taze agaroz katman petek kuyuları kapsayacak şekilde tarak ve alt katmanda agaroz arasındaki arayüzde agaroz ek bir miktar dökün. Tarağı çıkarmadan önce tamamen soğumasını bekleyin. Bir pipet ucu kullanarak, kuyulardan agaroz herhangi sarkan parçalarını çıkartın. </li><li> 4 ° C &#39;de enjeksiyon kalıp ve deponun üst E3 orta dökün. </li><li> Her kullanımdan önce, enjeksiyondan önce, en azından bir saat için 28.5 ° C&#39;da taze ortam ve sıcak enjeksiyon rampaları ile değiştirin. </li><li> Hemen önce enjeksiyonları, enjeksiyon rampası E3 yerine200 ug / ml, etil 3-aminobenzoat (tricaine) ihtiva eden E3 ortamı. </li></ol> 3. S. hazırlanması iniae Aşı <ol><li> % 0.2 maya ekstresi ve% 2 proteoz pepton (THY + P) ile takviye edilmiş, Todd Hewitt brotu ortamı hazırlamak ve otoklav: 30 g / L, Todd Hewitt, 2 g / L maya ekstresi, 20 g / L proteoz pepton. Agar plakaları için, 14 g / L agar ekleyin. </li><li> Kapalı bir 15 ml tüp içinde THY + U suyu 10 ml donmuş bakteri stokunun 100 ul kısım pipetleme enfeksiyonlar önce, bakteri kültürleri gece hazırlayın. 37 ° C&#39;de çalkalama olmadan gece boyunca inkübe edin. Büyüme 14-16 saat sonra, derin dondurucu stokları yapmak veya enjeksiyon kullanılmak üzere hazırlamak için ya gecede kültür kullanın. </li><li> 1.7 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde% 80 gliserol, 500 ul, gece boyunca kültürün 1 ml yerleştirerek dondurucu stokları olun. , Donma-erime döngülerinden kaçınmak -80 ° C&#39;de bu karışıma ve deposundan 100 ul tek kullanımlık alikotları sağlamak. </li><li> S. iniae infecti kullanılanTHY + U suyu 9.9 ml, gece boyunca kültürün 0.1 mi eklenerek 10 mi kültür toplam hacim 100: ons, gece boyunca kültürün 1 seyreltin. Yaklaşık 4-5 saat boyunca ajitasyon olmadan 37 ° C&#39;de büyür. Nanodrop spektrofotometre kullanılarak 600 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) Monitör ve OD600&#39;e nm 0,250-0,500 ulaştığında orta-logaritmik fazda bakteri hasat. 0.250 arasında bir OD600 nm yaklaşık olarak 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) / ml sine tekabül eder. </li><li> 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de 1,7 ml santrifüj tüpü içinde bakteri kültürü 1 ml Pelet. Taze PBS ve tekrarın 1 ml süspanse. PBS içinde bakteri OD600 nm ölçün, PBS içinde topak ve tekrar süspansiyon, istenen konsantrasyon elde etmek. </li><li> Mikroenjeksiyon görselleştirilmesine yardımcı% 0.1 bir son konsantrasyona için enjeksiyondan önce bakteriyel süspansiyonlar, kırmızı fenol ekleyin. </li><li> Isı ile öldürülmüş bakterilerin enjeksiyonunu içeren deneyler için, 30 dakika boyunca 95 ° C de PBS içinde bakteri ısıtın.Isı-öldürme işlemi katı THY + U agar plakaları üzerinde bir enjeksiyon hacmi (yaklaşık olarak 1 nl) kaplama ve 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilerek tespit edilemez seviyelere canlı bakteri sayısını azalttığını emin olun. </li></ol> 4. Etiketleme S. Bir CellTracker kırmızı bir floresan boya ile Inia E <ol><li> Bakteriyel canlı hücreler etiketlemek için, bir CellTracker flüoresan boya veya eşdeğer bir stok solüsyonu hazırlanır. Kullanılan bir boya tozunun 20 x 50 ug parçalar halinde gelir ve DMSO içinde yeniden süspansiyon haline getirildi gereken zamanda, bir 10 mM stok konsantrasyonu elde etmek üzere tüpe ul DMSO 7.3 ekleyin. </li><li> Hücreleri boyayan düşük optimal konsantrasyonunu belirlemek için bakteriler üzerinde boya konsantrasyonları (örneğin, 0,5-25 uM), bir dizi test edin. Hızla bölünen hücreler ve daha uzun deney boyanın daha yüksek bir konsantrasyon gerekebilir. <ol><li> (Bölüm 3) yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj ile 1.7 ml tüp içinde bakteri kültürü 1.0 ml pelet. 1 pelet yeniden süspanseTaze PBS ml ve bakteri kültürüne boya uygun hacim ekleyin. </li><li> 30 dakika süreyle 37 ° C&#39;de çalkalama olmaksızın inkübe edin. Önceden ısıtılmış THY + U suyu, 1 ml bakteri ve tekrar süspansiyon Spin ve 37 ° C&#39;de ek bir 30 dakika boyunca çalkalama olmaksızın inkübe edin. </li><li> Bakterileri aşağı spin ve OD600&#39;e nm ölçme ve (bölüm 3) Yukarıda ayrıntılı olarak mikroenjeksiyon için bakterileri seyreltilmesi önce PBS içinde iki kez yıkayın. Biz genellikle lökosit işe ve fagositoz bizim çalışmaları için 1 nl enjeksiyon hacmi yaklaşık 100 CFU enjekte. </li></ol></li></ol> Enfeksiyonlar için Zebra balığı Larva 5. hazırlanması <ol><li> Önceki gece üreyen kurmak ve enfekte hazır olana kadar 28.5 ° C E3 ortamında Rosen ve ark. 27 inkübe embriyolar tarafından açıklanan embriyolar toplamak. </li><li> Yansıması olacak Zebra balığı için, N-feniltiyoüre (PTU) ekleyerek pigment (melanizm) gelişimini önlemek0.2 nM&#39;lik bir son konsantrasyon için 24 saat sonra fertilizasyon (HPF) ile E3 ortamı. </li><li> Embriyoların içeren enfeksiyonlarında elle ince bir cımbız ile, dechorionate embriyolar 2 dpf yaş. Seçenek olarak ise, E3 ayrılması ve yaklaşık 5 dakika için ya da yumuşak pipetleme kadar Pronaz (2 mg / ml) ile değiştirerek dechorionate embriyolar koryon üzerinden embriyolar keser. Çoğu Larvalar 3 dpf&#39;e tarafından doğal yumurtadan olmalıdır. </li><li> 200 ug / ml tricaine ihtiva E3 ortam içine dechorionated larvaları yerleştirerek enfeksiyon öncesinde zebra balığı birkaç dakika anestezisi. </li></ol> S. 6. Kulakla Vesikül Enjeksiyon Üç Gün Eski Larva içine iniae <ol><li> Mikropüskürtücü açın ve &quot;milisaniye&quot; zaman aralığını ayarlayın. Hattına gaz izin karbondioksit tankı üzerindeki valfi açın. mikropüskürtücü basıncı yaklaşık 20 PSI okumalısınız. Artır siyah tırtıllı topuzu saat yönünde döndürülmesi ile mikropüskürtücü ünitesinde basıncını ayarlayınazalmış basınç dönüm yönünün tersine basınç veya hafifletti. </li><li> Hazırlanan S. vorteks fenol kırmızısı ve PBS ve Microloader ucu kullanın içinde iniae kültür çekti kılcal enjeksiyon iğne içine kültür 2-3 ul yüklemek için. </li><li> İğne mikroskop tabana göre 45-65 ° bir açı yaklaşık şekilde bir stereo mikroskop altında manyetik bir stand ve konum olarak bağlı bir mikromanipülatör yüklü iğne monte edin. </li><li> Mikropüskürtücü ayak pedalına basın iğne ucu üzerine inokulum bir damla dağıtmak için. Mikroskop göz lens ölçek çubuğunu kullanarak damla çapını ölçün. <ol><li> Seçenek olarak ise, bir ölçek çubuğu ile cam bir mikroskop lamı üzerine bir mineral yağ damla bir hacim enjekte edilerek damla çapı tahmin edilmektedir. damla çapı 1 Nl hacmi yaklaşık yaklaşık 0.10 mm olması gerekmektedir. </li><li> Ayarını süresini ayarlayarak damla boyutunu ayarlayınmikropüskürtücü veya ince cımbız ile iğne ucu daha kapalı kırpma yoluyla. Çok fazla doku hasarı oluşmasını önlemek için 35 msn - enjeksiyon süresi 20 arasında olması gerektiğini unutmayın. </li></ol></li><li> Plastik bir transfer pipeti kullanarak, nakil 12 enjeksiyon kalıbın her kuyuya larva anestezi. </li><li> Iyi sol tarafına karşı başları mikroskop ve yumurta sarısı kesesi arkasına doğru işaret böylece hafifçe larvaları konumlandırmak için bir cam çubuk, saç döngü veya plastik ucu kullanın. Tavana doğru larva kadar sol kulağını yöneltin. </li><li> Stereomikroskopta göz merceğinden bakıldığında, her iki görüş aynı alanda böylece otik vezikül ile yüklenen iğne sıraya mikromanipülatör düğmeleri kullanın. Pierce iğne ucu ile otik vezikül dış epitel tabakası böylece iğne ucu sadece vezikül içinde. </li><li> Ayak pedalına basın S. istenen dozu 1 nl enjekte iniae. Bir kullandığınızdan emin olunyeterince düşük basınç boşluğu yırtmak şekilde değil. Enjeksiyon başarılı olursa, kulak vezikül, ancak çevredeki doku, fenol kırmızı inokulum (Şekil 1 Ai) ile doldurmalısınız. Hemen enjeksiyon plakası herhangi bir yanlış enjekte balık çıkarın. </li><li> Dikkatle larva dışarı iğne geri çekin ve bir sonraki larva görünümünde böylece elle enjeksiyon plakasını taşıyın. 5X büyütme altında yapın. Not: iğne geri çekilme hayatta kalma ve lökosit işe sonuçlarını çarpık olabilir otik vezikül dışında bazı bakteri, birikimi neden olabilir. Bunu önlemek için, bu flüoresan boya etiketli bakteriler enjekte etmek ve görsel olarak meydana gelen herhangi bir larva kaldırmak için flüoresan mikroskop altında enjekte larvaları taranması tavsiye edilir. Doğru şekilde enjekte larvası (Şekil 1 &#39;Bi)&#39; de gösterilmiştir. </li><li> Enjeksiyon hacmi / inokulum deney boyunca aynı kalmasını sağlamak için, bakteriyel s damla enjekteHer 48. embriyo sonra steril PBS içinde 100 ul ihtiva eden bir 1.7 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne Askı. Enjeksiyon hacmi içinde CFU&#39;nun saptanması için bir gece boyunca 37 ° C&#39;de THY + U agar plakaları üzerinde 100 ul Plate. </li><li> Enjeksiyon rampası 12 larvaların tüm grup enjekte edildiğinde, dikkatle kuyulardan gelen larva kaldırmak ve yeni bir Petri kabı (35 x 10 mm 2) içine yerleştirmek için plastik bir transfer pipet kullanın. Tricaine çözüm çıkarın ve larva kurtarmak için izin yaklaşık 2 ml taze E3 ortamı ile değiştirin. </li><li> Pipet, 96 oyuklu bir plaka, tekli oyuklar içine larvaları enjekte edildi ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. Bu plakalar hayatta kalmak için zamanla larvaları Monitör veya görüntüleme veya CFU sayımları için daha sonra kaldırın. </li></ol> Nötrofiller 7. Sudan Black Boyama Not: Aşağıdaki adımlar yerine sürece orbital bir karıştırıcı üzerinde küçük bir petri kabının (35 x 10 mm 2) içinde, oda sıcaklığında yapılabilirherwise belirtti. Her bir aşama için kullanılan reaktif miktarı, tam larvaları kaplamak için yeterli miktarda bir sıvı ile tabak başına 2 mi, yaklaşık. <ol><li> Enfekte larva sabitlenmesi E3 orta kaldırmak ve PBS çözeltisi içinde bir buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit ile değiştirmek için bir cam Pasteur pipet kullanın. Hemen ötenazi 4 ° C &#39;de balık yerleştirin. 4 ° C de bir gece düzeltildi. </li><li> 5 dakika her biri için PBS içinde 3 kez yıkanır. </li><li> 5 saat 30 dakika boyunca Sudan Siyahı Leke (% 70 etanol,% 0.1 fenol, 5% 0.18 stok 1 seyreltilmiş). Nötrofil granüller leke almış olmadığını kontrol etmek için bir stereomikroskopta kullanın. </li><li> PBS içinde bir son yıkama olarak% 70 etanol ve PBS 1 oranında bir 1: tek yıkama olarak% 70 etanol içinde tek bir yıkama ile başlayan 5 dakika bir dizi yıkama yapın. </li><li> PBS artı% 0.1 tween (PBT) içine rehydrate. </li><li> Larvaları pigment temizlemek için, yaklaşık 6-10 dakika için% 1 potasyum hidroksit /% 1 hidrojen peroksit yıkayın. Örnek closel Monitöry ve yaklaşık 5 dakika sonra, temizlenmiş ne kadar pigment görmek için bir stereo mikroskop altında larvaları kontrol edin. Çözüm çok uzun kalırsa, yumurta sarısı keseleri şişer ve patlama olacaktır. </li><li> PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez her yıkayın. </li><li> Görüntü hazır olana kadar 1 hafta kadar 4 ° C de PBS veya PBT ya örnekleri saklayın ve sayılır. </li><li> Görüntü Sudan Siyah-lekeli larva için, PBT içine balık transferi ve daha sonra% 80 gliserol içine ve bir tek kavite depresyon slayt üzerine yerleştirin. Pozisyon bir pipet kullanarak bir stereo mikroskop altında larvaları sabit. Bir stereomikroskop üzerine (Şekil 1 Aii-iv) renkli dijital kamerayı kullanarak resim. </li></ol> Enfekte Larvalarına gelen geçerli Bakteri 8. numaralandırma <ol><li> İstenen zaman E3 ortamında tricaine bir buz soğukluğunda 200-300 mg / L, çözelti içinde enfeksiyondan en larvaları ile öldürülür. </li><li> Pipet 1.7 ml santrifüj tüplerine larvaları öldürüldü. Tricaine çözeltisini çıkarın ve% 0.2, 100 ul ile yerinePBS içinde Triton X-100 (PBSTx). </li><li> 27 G iğne ile yukarı ve aşağı 10 kez geçerek larvaları homojenleştirin. </li><li> Steril PBS homojenatlarının seri dilüsyonları hazırlayın. Örneğin, bulaşıcı dozu 100 CFU, pipetle 900 ul steril PBS içine homojenat 100 ul ise. Yeni bir pipet ucu kullanarak, 900 ul steril PBS içinde seyreltilmiş 100 ul homojenat aktarın. </li><li> Levha 100 gram-pozitif bakterilere seçici izolasyonu için Columbia CNA agarı üzerinde seyreltileri ul ve 48 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bu ortam, her ikisi de gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerin büyümesini destekleyecek THY + U agar plakaları, daha fazla seçim sağlar. </li><li> 500&#39;den daha az bireysel koloniler ile plakaları üzerinde, kolonilerin sayısını ve CFU sayısını belirlemek için seyreltme faktörü ile çarpın. </li></ol> Görüntüleme Larva 9. Sabitleme <ol><li> De olduğu gibi, PBS çözeltisi içinde bir buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid içinde larvaları saptamakbölüm 7 tarif. </li><li> Oda sıcaklığında, görüntüleme önce PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez her yıkayın. </li></ol> Canlı Görüntüleme Larvalarına 10. Hazırlanması <ol><li> Çözelti berraklaşıncaya kadar mikrodalga içinde ısıtılarak E3 içinde bir% 1.5 düşük erime noktalı agaroz çözelti hazırlayın. </li><li> Serin ama sertleşmesine etmeyelim için 55 ° C su banyosunda agaroz çözüm yerleştirin. </li><li> 0.016% bir nihai konsantrasyona kadar agaroza tricaine ekleyin. </li><li> Plastik bir transfer pipet kullanarak, bir stereomikroskopta aşamasında bir cam alt çanak 4-5 anestezi larvaları yerleştirin. </li><li> 55 ° C su banyosu tricaine ve agaroz çözüm çıkarın ve 1-2 dakika için oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Agaroz soğurken mümkün olduğu anestezi uygulanmış larvaları kadar sıvıyı ayırın. </li><li> Yüzeyinin yaklaşık yarısı kaplıdır kadar çanak içine agaroz soğutmalı dökün. Agarozun yaymak için çanak girdap. Not agaroz eğerçok sıcak, bu larvaları öldürür. Çok fazla agaroz çanak eklenirse agaroz ile odaklama Ayrıca, mikroskop objektif lens çanak dibe vurmak olabilir. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak, yemeğin yüzüne yüzmekte olan larva pick up ve merkeze geri içine pipetlemeyin. </li><li> Saç döngüsü, çok uzun bir pipet ya da bir cam çubuk ile arzu edildiği gibi stereomikroskop altında, yavaşça larvaları yerleştirin. Sol kulak vezikül çanak dibine düz böylece otik vezikül görüntüleme için, larva yerleştirin. </li><li> Çanak taşımadan önce yaklaşık 10 dakika agaroz soğuması. Agaroz katı değilse larva pozisyonları kayabilir. Hafifçe nemli tutmak için agaroz tabakanın en üstüne bir tricaine E3 çözelti pipetleme. </li></ol> Enfeksiyon 11. Konfokal Görüntüleme <ol><li> Bir FV-1000 lazer tarama confoca ile bir ters mikroskop sahneye larvaları ile cam alt çanak yerleştirinl sistemi. </li><li> 200-300 um iğne deliği ayarlayın ve bir sayısal diyaframı 3-6 mikron dilim z-yığınları set 0.75 / 20X objektif lens kullanarak. </li><li> Her kanal için lazer güç ve dedektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgili tarama kullanın. </li><li> Her floresan kanal için sıralı çizgi tarama kullanarak (örneğin, 488 ve 543 nm) ve diferansiyel girişim kontrast (DIC), nötrofiller tarafından ilk işe ve fagositoz gözlemlemek için 2-6 saat sol kulak vezikül bir zaman atlamalı film, her 3 dk yapmak ve makrofajlar. Uzun zaman kurslar için, agaroz dışarı buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için Petri kabı bir kapak yerleştirin. </li><li> 20X veya 40X büyütmede (Şekil 2) larvaları hala sabit (Şekil 1B) görüntüler elde veya canlı. </li></ol> Otik vezikül de Dendra2 etiketli lökosit 12. Fotoçevrim Not: Dendra2-kırmızı flüoresans yeşilden photoconverted edilebilir1 dakika faiz (ROI) bölgede bir 405 nm lazer (% 50-70 lazer güç yeterli olmalıdır) odaklanarak. Aşağıda FV-1000 lazer konfokal tarama sistemi için kullanılan adım adım protokol şöyledir: <ol><li> 488 nm ve 543 nm lazerler ile z-yığın tarama kullanarak örnek gözünüzde canlandırın. Lazer gücü ve dedektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgili tarama kullanın. Hiçbir yanlışlıkla photoconverted kırmızı floresan olduğundan emin olmak için kontrol edin. </li><li> &quot;Görüntü Alma Denetimi&quot; penceresinde, &quot;Uyaran Setting&quot; altında &quot;Use Tarayıcı&quot; aracını seçin ve &quot;ana&quot; seçiniz. 405 nm lazer seçin ve% 70 güçte ayarlayın. Daire seçeneği kullanarak, otik vezikül içinde yatırım getirisini tanımlar. </li><li> &quot;Uyarıcı Başlat Ayarlama&quot; altında 1 çerçevenin bir önceden etkinleştirilmesi ve 60.000 msn bir aktivasyon süresi ile &quot;serisinin Aktivasyon&quot; seçeneğini seçin. &quot;Başlığı Zaman Scan&quot; altında &quot;Acquisition Ayarı&quot; penceresinde, içinde 2 seçin00:01:00 (ön için ve biri sonrası Fotoçevrim için) ve aralıklarda. Not: Zaman atlamalı serisi Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, Dendra2 kırmızı floresan durumuna photoconverted olmalıdır. </li><li> Photoconverted kırmızı floresan yanı sıra kalan yeşil floresan (Şekil 3) görselleştirmek için 488 nm ve 543 nm lazerler kullanarak z-yığını ile örnek tarayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Agnew, W., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+iniae:+An+aquatic+pathogen+of+global+veterinary+significance+and+a+challenging+candidate+for+reliable+vaccination.">Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination.</a> Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).</li><li>Danilova, N., Steiner, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+develop+in+the+zebrafish+pancreas.">B cells develop in the zebrafish pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hematopoiesis+and+Developing+Lymphoid+Organs+in+the+Zebrafish.">Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish.</a> Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo.">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).</li><li>Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus-Zebrafish+Model+of+Bacterial+Pathogenesis.">Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis.</a> Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).</li><li>Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+gene+family+and+TIR-domain+adapters+in+Danio+rerio.">Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio.</a> Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).</li><li>Meijer, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+the+Toll-like+receptor+and+TIR+domain+adaptor+families+of+zebrafish.">Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish.</a> Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).</li><li>Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complement+Factor+B-Like+cDNA+clone+from+the+Zebrafish+(Brachydanio+rerio).">A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio).</a> Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).</li><li>Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+respiratory+burst+assay+using+zebrafish+kidneys+and+embryos.">Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos.</a> J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).</li><li>Yoo, S. K., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+photolabeling+of+neutrophil+trafficking+during+inflammation+in+live+zebrafish.">Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Screen+for+Tuberculosis+Progression.">A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).</li><li>Veneman, W. J., Mar&#237;n-Juez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Optimization+of+a+High+Throughput+Setup+to+Study+Staphylococcus+epidermidis+and+Mycobacterium+marinum+Infection+as+a+Model+for+Drug+Discovery.">Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+signaling+mechanisms+mediate+neutrophil+attraction+to+bacterial+infection+and+tissue+injury.">Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury.</a> Cell. Microbiol. , (2012).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections.">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).</li><li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+S+Inhibits+Neutrophil+Recruitment+during+the+Early+Stages+of+Streptococcus+pyogenes+Infection.">Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li><li>Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+to+Probe+the+Divergent+Virulence+Potentials+and+Toxin+Requirements+of+Extraintestinal+Pathogenic+Escherichia+coli.">Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli.</a> PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).</li><li>Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Response+to+Streptococcus+iniae+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae.</a> Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).</li><li>Haddon, C., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Ear+Development+in+the+Embryo+of+the+Zebrafish,+Danio+rerio.">Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio.</a> J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).</li><li>Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+inner+ear.">Development of the zebrafish inner ear.</a> Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), (2009).</li><li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo:+unlike+macrophages,+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes.">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada kullanılan enfeksiyon yöntemi 2-3 dpf embriyolar ve larvaların bir ilk lokal enfeksiyona konak bağışıklık tepkisinin incelenmesi için yararlıdır. Bu tür kulak kesecik gibi kapalı bir boşlukta enfeksiyon gibi bir enflamatuar uyarıcı, odak nötrofil ve makrofaj kemotaksisi ve fagositoz çalışma sağlar. Otik vezikülleri içine bakteri enjekte bir uyarı nötrofillerin yeteneği etkili bir sıvı dolu boşluklarında fagosite ederler bakteriler, özellikle bir mikrop bağlı olabilir olmasıdır. Escherichia coli ve Bacillus subtilis kolayca otik vezikül 28 nötrofiller tarafından fagosite değildir, ancak biz, nötrofiller, Pseudomonas aeruginosa ve S. hem fagosite mümkün olduğunu bulduk Bu konumda 16, 24 iniae. Çeşitli patojenlerin invazivliğini okuyan zaman lokalize enfeksiyon da yararlıdır. Sistemik bir enfeksiyon takip i neden olmak içinkapalı boşluğuna njection gibi kulak vezikül gibi, mikrop fiziksel ana engelleri çapraz gerekir. Alternatif olarak, farklı patojenler enfeksiyon ilk sitesinden ulaşım ve yayılması için konak hücreler güveniyor olabilir. Bu değişmiş virülansa suşları karşılaştırmak için yararlı yerelleştirilmiş enjeksiyonları yapar. Mikroenjeksiyon sırasında, yerleşme ve her koşul sonra veya yaklaşık 50 larva sonra ya iğne, iğne değişim tıkanma bakterileri önlemek için. Bu iğne süspansiyon daha düzgün sağlamaya yardımcı olacaktır. Iğne bakteri yerleşimi, homojen bir süspansiyon tutmaya yardımcı olabilir bir sorun, bir PBS karışımını,% 2 PVP40,% 10 gliserol gibi görünüyorsa. Her larva bakteri yaklaşık aynı sayıda enjekte ediliyor emin olmak için, hemen bir larva homojenize enjeksiyonunu takiben ve CNA agarda homojenatın kaplama ile CFU sayımları kontrol edin. CNA ağar, sadece, kültürlenebilir gram-pozitif bakterilerin büyümesi için seçecektirS. iniae, ancak enjeksiyon dozları her larva arasında nasıl tutarlı bir fikir verecektir. Larva başına 100 CFU bir hedef inokulum ile, bir CNA plaka üzerinde tipik 75-150 arasında koloniler vardır. olmayan S. sayısı En PBS enjekte balık genellikle 0-20 koloniler arasında neden bu yana CNA plaka üzerinde büyüyen iniae gram pozitif koloniler, muhtemelen çok düşüktür. Aynı bulaşıcı doz ile enfekte larva arasındaki koloni sayımları yarım günlüğüne kadar değişimini olması için enfeksiyon sırasında sonraki zaman noktalarında, bu nadir değildir. Bu enfeksiyon kontrol etme yeteneği bireysel larva arasındaki ufak farklar temsil edebilecek ya da larva veya E3 ortamında kültürlenebilen gram pozitif bakterilerin miktarı farklılıkları yansıtıyor olabilir. Otik vezikül içine enjekte ederken, bu boşluğu yırtılmasına neden olabilir çok büyük bir hacim veya çok yüksek bir basınç ile enjekte etmek önemlidir. Enjeksiyon hacmi shoYaklaşık 1 nl tutulabilir uld. İğne çok büyükse, mikroenjeksiyon enfeksiyon siteye ev sahibi lökositlerin işe etkileyebilir veya bakteri otik vezikül dışarı sızmasına izin verebilir çevredeki dokuya zarar görmesine neden olabilir. Bu nedenle, doğru boşluk içine enjekte teyit etmek için de önemlidir. İğne çok derin takılırsa, bu otik vezikül ile karıştırmak olabilir veya kulak vezikül etrafında akan kan damarları vurabilir. Böylece, ana yanıtları değiştirebilir kan akışına ya da vezikül dışındaki bakteri birikmesi, neden olabilir. Bu iğne çıkarıldığı zaman Colucci-Guyon ve diğ., 28 ile gösterildiği gibi, bazı bakteriler yanlışlıkla otik vezikül dışındaki tevdi edilebilir olması da mümkündür, ama sadece enjeksiyonları% 5&#39;ten daha az durumda olmasını bulabilirsiniz. Otik vezikül merkezine enjekte çalışılıyor, bu durumu önlemeye yardımcı olabilir. Başarılı bir enfeksiyon ise, otik vezikül w doldurmak gerekirfenol kırmızı boya i, ancak boya çevreleyen dokulara dışarı sızmaması gerekir. Herhangi bir yanlış enjekte larvalar hemen atılmalıdır. Etiketli bakteriler enjekte başarılı bir enjeksiyon (Şekil 1B) onaylamak için kullanışlı bir yoldur. Bir CellTracker boya kullanılarak dezavantajlarından biri bakteriler sonunda floresan altında görüntülendi olan bakterilerin önlenmesi, bölmek gibi bu boya sulandırılmış olacak olmasıdır. Yeşil etiketli nötrofil ve çalışmaların çoğunluğu için makrofaj transgenik hatları kullanılan çünkü kırmızı boya seçti. Dendra2 octocoral Dendronephthya sp.&#39;den türetilmiş bir photoconvertible proteindir. hangi bir 405 nm lazer 29 kırmızı floresan duruma bir yeşilden photoconverted edilebilir. Bu Fotoçevrim hücrelerini işaretlemek ve enfeksiyon boyunca kendi kaderini izlemek için invaziv olmayan bir yoldur. Enfeksiyon bölgesine işe lökositler photoconverted ve d izlemek için zaman içinde takip edilebilirev sahibi dokulardaki boyunca issemination (Şekil 3). Alternatif olarak, lökositler önce enfeksiyon photoconverted ve daha sonra enfeksiyon siteye işe hücrelerin kökenini belirlemek için post-mikroenjeksiyon takip edilebilir. Etiketleme bakteri ve bağışıklık hücreleri alımı ve fagositoz (Şekil 1B ve Şekil 2) da dahil olmak üzere, in vivo olarak lökosit-patojen etkileşimlerinin çalışma sağlar. Kırmızı-etiketli S. ayırt Bir photoconverted lökosit kırmızı floresans iniae zordur, bu nedenle başka bir floresan CellTracker boya kullanılabilir. Bu S. içeren otik vezikül terk photoconverted bağışıklık hücreleri belirlemek için özellikle faydalı olur, iniae. Otik vezikül bulaşma yönteminin Gelecek uygulamalar nötrofiller ve makrofajlar çeşitli enfeksiyonlara tepki olarak hareket ettiği hızı ve yönünü ölçmek içerebilir. enfeksiyon kinetics ayrıca hücre tipleri, en sağlam hücreler geldiği yerin ya da 30 yaymak nerede ek olarak işe alınırlar bir enfeksiyon yerinde ve hangi gelmesi ilk hangi hücre tipleri görmek için incelenebilir. Bir ilk lokal enfeksiyona işe incelenmesine ek olarak, bu enfeksiyon modeli, ilk enfeksiyonu sırasında konağın immün sistemi bileşenlerinin fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir. Belirli RNA hedef antisens morfolino oligonükleotitler Toll benzeri reseptörler, sitokin reseptörleri ve lökositlerin, ve de dahil olmak üzere konakçı bağışıklık bileşenlerinin sentezlenmesi yıkmak için kullanılabilir CRISPR-Cas veya TALEN teknolojisi genetik mutantlar oluşturmak için de kullanılabilir. Gen ifadesi RNAseq kullanılarak veya qPCR da enfeksiyona karşılık olarak belirli bir ev sahibi gen ekspresyonunu karakterize etmek için kullanılabilir.

Streptococcus iniae balık ve insanlarda 1 hem de sistemik hastalığa sebep olup büyük bir su patojendir. S. iken iniae su ürünleri sektöründe büyük kayıplar için sorumlu, aynı zamanda diğer streptokok insan patojenlerin neden olanlara benzer klinik patolojilerin ile bağışıklığı insan konaklarda hastalığa neden yeteneğine potansiyel zoonotik patojen olduğunu. Insan patojenleri ile benzerlikler göz önüne alındığında, bu çalışma S. önemlidir Doğal ev sahibi bağlamında iniae hastalığı patogenezi. S. Bir yetişkin zebrabalıkları modeli iniae enfeksiyonu enfeksiyon lokalize sitede yanı sıra ölümü barındırmak için hızlı bir zaman ev sahibi lökositlerin sağlam infiltrasyonu ortaya, çok kısa bir zaman adaptif bağışıklık sistemini 7 dahil etmek. Kazanmak için bir derinlemesine S. doğuştan bağışıklık yanıtı içine bakmak in vivo enfeksiyon iniae, bu n daha uygun bir model kullanmak için gerekli olanon-invaziv canlı görüntüleme. larva Zebra balığı bu konak-patojen etkileşimleri çalışmak için giderek cazip omurgalı modeli yapmak avantajları bir numarası vardır. Balığı kullanımı ve memeli modellere göre korumak için nispeten ucuz ve kolaydır. Adaptif bağışıklık 4-6 hafta sonrası döllenme kadar işlevsel olgun değil, fakat larva fagositozu ve solunum patlaması 2-6 olmak üzere antimikrobiyal özellikleri ile tamamlayıcısı, Toll benzeri reseptörler, sitokinler, ve nötrofiller ve makrofajlar ile yüksek oranda korunmuş omurgalı doğuştan bağışıklık sistemine sahip, 8-11. Buna ek olarak, genetik izlenebilirliği ve geliştirme embriyonik ve larva aşamalarında optik saydamlık ile floresanla işaretlenmiş bağışıklık hücreleri mümkün in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak konukçu-patojen etkileşimlerine incelemek için yapım kararlı transgenik hatların üretilmesine izin verir. örneğin Den bir photoconvertible proteini kullanılarak bu transjenik nesildra2 enfeksiyonu 12 boyunca bireysel konak hücre kökeni ve kaderi takibi sağlar. Bir Zebra balığı larva enfeksiyon modeli geliştirirken, mikroenjeksiyon seçilen site, enfeksiyon başlangıçta lokalize veya sistemik olup olmadığını belirleyecektir. Kaudal ven veya Cuvier ve Duct içine sistemik kan enfeksiyonları en sık zebrabalıkları mikrobiyal patojenlerin incelemek için kullanılan ve patojen suşları arasında virulenslikte ev sahibi ve mikrobiyal hücrelerin, sitokin yanıtları ve farklılıklar arasındaki etkileşimleri incelemek için yararlı olmaktadır. Yavaş gelişen mikroorganizmalar için, 16-1,000 hücre aşamasında bir embriyo yumurta sarısı kesesinin içine ilk enjeksiyon arasında olduğu bir yavaş büyüyen mikroorganizmaların mikroenjeksiyon için uygun gelişim aşamasında olan, sistemik bir enfeksiyon 13,14 oluşturmak için kullanılabilir 16-128 hücre aşaması 15. Ancak, ev sahibi gelişiminin sonraki aşamalarında birçok mikropların kesesi enjeksiyonları sarısı t öldürücü olma eğilimindedirO lökositler 16-18 sızma mikrop ve eksikliği için besin açısından zengin bir ortamda nedeniyle ev sahipliği. Bir lokalize enfeksiyon genellikle kolayca non-invaziv görüntüleme ile ölçülebilir enfeksiyon sitenin yönelik lökositlerin yönettiği göç sonuçlanır. Enfeksiyon Bu tür lökosit göçünü yanı sıra çeşitli lökosit popülasyonlarının farklı göçmen ve fagositik yetenekleri soruşturma aracılık mekanizmaların diseksiyon için izin verebilirsiniz. Bakteri türleri arasındaki virulenslikte farklılıkları inceleyen yanı sıra fiziksel ana engeller sistemik olmak için yerelleştirilmiş enfeksiyonu için geçti gerekir çünkü mikrop istilası mekanizmaları okuyan zaman lokalize enfeksiyonlar da yararlıdır. Balığı, tipik olarak 25-31 ° C 19 arasındaki sıcaklıklarda yetiştirilir fakat aynı zamanda sıkı bir sıcaklık şartlarına belirli insan patojen invaziflik çalışmaları için 34-35 ° C kadar yüksek bir sıcaklıkta muhafaza edilebilirvirülans 20, 21. Birçok farklı sitelerde Beyin ventrikül 22, sırt kuyruk kas 18, perikardiyal boşluğu 23 ve otik vezikül (kulak) 5, 16, 24 dahil olmak üzere bir ilk lokal bakteriyel enfeksiyonun oluşturmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, lökosit yanıtı 13 araştırılırken sonuçları çarpıtabilir bakteri, doku hasarı ve inflamasyon bağımsız neden olabilir kuyruk kas içine bakteri enjeksiyonunun bulunmuştur. Daha az hasar Beyin içine enjeksiyonu ile ilişkili ve genç embriyoların lökositlerin başlangıçta yoksun olmasına rağmen mikrogliya ikamet almak gibi, Beyin ventrikül giderek zamanla daha bağışıklık hücrelerini kazanır rağmen. Beyin ventrikül da görüntü bir daha zor bir konumdur. otik vezikül damar 25, 26 doğrudan erişimi olan kapalı içi boş boşluktur. Bu leu normal olarak yoksunkocytes ama lökositlerin enfeksiyon gibi iltihap uyarıcıya tepki olarak otik veziküle iyileştirilebilirler. Aynı zamanda, çünkü görüntüleme kolaylığı ve enjeksiyon görselleştirme Zebra balığı yaşlı 2-3 gün sonrası fertilizasyon (dpf) bakteri mikroenjeksiyon tercih edilen bir sitedir. Bu nedenle, biz lokalize bakteriyel enfeksiyon sitemizde olarak otik vezikül seçti.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G x &amp;frac12; in. needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA agar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Disposable transfer pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Fine tweezers</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Gel comb</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4.2 mm width, 1.5 mm thick</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td></td><td></td><td>Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>High melt agarose</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>with FV-1000 system</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection system</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotmeter</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Protease peptone</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Small cell culture dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Thin wall glass capillary injection needles</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Fluka Biochemika</td><td>92144</td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive imaging of the innate immune response in a zebrafish larval model of streptococcus iniae infection

su patojen, Streptococcus iniae, su ürünleri sektörü için yıllık kayıpları 100 milyon dolar sorumludur ve balık ve insanlarda hem de sistemik hastalığa neden yeteneğine sahiptir. S. daha iyi anlaşılması iniae hastalığı patogenezinde uygun bir model sistem gerektirir. floresan bağışıklık hücrelerini etiketli ile genetik tractability ve Zebra balığı erken gelişim evrelerinde optik şeffaflık transgenik hatları üretimi ve non-invaziv görüntüleme için izin verir. birkaç hafta döllenme sonrası dek adaptif bağışıklık sistemi tamamen işlevsel değil, ama Zebra balığı larvaları nötrofiller ve makrofajlar hem korunmuş omurgalı doğuştan gelen bağışıklık sistemi var. Böylece, bir larva enfeksiyon modelinin üretimi S. kontrol sırasında bağışıklık özel katkı çalışma sağlar iniae enfeksiyonu. Mikroenjeksiyon site bir enfeksiyon olup olmadığını belirleyeceksistemik ya da ilk olarak lokalize. Burada, biz otik vezikül Zebra balığı yaşlı 2-3 gün sonrası döllenme enjeksiyonu yanı sıra enfeksiyon floresan konfokal görüntüleme için teknikler bizim protokolleri sunuyoruz. Bir lokalize enfeksiyon sitesi ilk mikrop istilası gözlem, konak hücrelerin işe ve enfeksiyon yayılmasını sağlar. S. Zebra balığı larva modelini kullanarak Bulgularımız iniae enfeksiyonu zebra balığı lokalize bakteriyel enfeksiyonların konakçı nötrofil ve makrofajların farklı katkıları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, bağışıklık hücrelerinin photolabeling enfeksiyonun seyri sırasında bireysel konakçı hücre gelişmeyi izlemek için kullanılabilir açıklanmıştır.

S. Mikroenjeksiyon bir ilk lokal yanıtta otik vezikül iniae (Şekil 1 ve Şekil 2) oluşur. Doğru enjekte edildiğinde, bakteriler sadece otik vezikül ve değil çevredeki doku veya kanda görülmelidir. Bu fenol kırmızı boya (Şekil 1A) kullanarak mikroenjeksiyon sırasında görülebilir. Etiketli bakteriler enjekte edilir Alternatif olarak, enfekte larva hızlı bir tarama hemen bakteriler sadece otik vezikül ve değil çevredeki doku (Şekil 1B) olan teyit edebilirsiniz enjeksiyon sonrası. Her ne kadar 10 CFU yabani tip S. olduğunca az bir doz iniae 24-48 saat sonra enfeksiyonu (HPI), bir avirülan soyu, cpsA 1000 CFU enjeksiyon içinde ölümcül bir enfeksiyonun kurabilmektedir öldürücü enfeksiyona neden olabilir ve bu suş ana bilgisayar 24 prolifere mümkün görünmektedir değildir. Bu nedenle, bu lokalize enfeksiyon modeli differentiat edebilmektedirdeğişmiş virülansa bakteriyel suşları arasında e. Ilk olarak lokalize enfeksiyonun Mikroenjeksiyon siteleri, lökosit kemotaksisine çalışmak için de yararlıdır. Lökositin görevlendirilmesi, nötrofil granüller Sudan siyah boyama (Şekil 1A) veya floresan transgenik kuşaklar (Şekil 1B) formaldehit tespit ya ile ölçülebilir tarafından olabilir. Işe ve bağışıklık hücrelerinin fagositik yeteneklerini görselleştirmek için, biz özellikle makrofajlar yeşil floresan proteinini Dendra2 sentezleyen transgenik çizgiler kullanılan Tg (MPEG1: dendra2) 24 veya nötrofil Tg (mpx: dendra2) 12. Zaman S. iniae 3 dpf larvalarının otik kesecik içine enjekte edilir, her ikisi de nötrofiller ve makrofajlar hızla ilk 2 HPI (Şekil 1) içinde alınırlar. Doğru yapılan Ancak, otik vezikül içine PBS mikroenjeksiyon (ev sahibi lökositlerin aynı sağlam işe neden olmaz <strong&gt; Şekil 1). Işe ek olarak, nötrofiller ve makrofajlar hem fagositik özelliklerini ortaya floresan etiketli bakteriler enjekte edilmiş floresan transgenik hatların konfokal zaman atlamalı görüntüleme canlı. Kırmızı boya etiketli S. iniae nötrofiller ve makrofajlar (Şekil 2), hem içinde bulunabilir. Nötrofiller ya da makrofajlar etiket photoconvertible proteini Dendra2 kullanılması enfeksiyonun boyunca tek tek hücre kaderine izleme için invazif olmayan photolabeling sağlar. 5 HPI de otik vezikül için alındı ​​makrofajlar photoconverted ve sonra aşağıdaki 24 saat boyunca takip edildi. Bazı photoconverted hücreler otik vezikül veya kafa bölgesinde kalmasına rağmen, bazıları da larva vücuda yayılmış (Şekil 3) bulunabilir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52788/52788fig1highres.jpg" width="550" /> <strong&gt; Şekil 1: S. ile otik vezikül enfeksiyona lökosit işe iniae. (A) S. Nötrofil işe iniae enfeksiyonu. (I) otik vezikül içine fenol kırmızı etiketli inokulum Başarılı enjeksiyonu. (Ii - iv) 2 HPI de nötrofil işe soruşturma larva Sudan Siyah boyama. Ya da vahşi tipli S. ırkıyla enfeksiyon otik vezikül (ii) nötrofillerin PBS sözde-enfekte edilmiş larva göstermek küçük alımları iniae veya sağlam nötrofil alımında cpsA mutant sonuçları (iii, iv). Ölçek çubuğu, 300 mikron. (B) S. Makrofaj işe iniae enfeksiyonu. (I)-kırmızı etiketli S. Başarılı mikroenjeksiyon otik vezikül içine iniae (kırmızı tasvir). (Ii - iv) Mikroenjekte.edilm transgenik mp Floresan konfokal görüntüleriEG1: dendra2 larva 2 HPI sabit. CellTracker kırmızı-etiketli (kırmızı işaret edilen) vahşi tipli S. ile enfekte PBS sözde-enfekte edilmiş larva durumunda az makrofaj alımları, (ii), fakat larva iniae veya 2 HPI de otik vezikül için cpsA mutant göstermek sağlam makrofaj işe (iii, iv). Ölçek çubuğu, 30 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52788/52788fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52788/52788fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2: S. Fagositoz otik vezikül fagositler tarafından iniae Transgenik MPX:. dendra2 (A) ya da MPEG1: dendra2 (B), larva kırmızısı etiketli S. ile enfekte iniae (eflatun tasvir) ve lazer Scann kullanarak 60 dakika sonrası enfeksiyon görüntülendikonfokal mikroskop ing. Ölçek çubuğu, 30 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52788/52788fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52788/52788fig3highres.jpg" width="700" /> Şekil 3: S. ile otik vezikül 5 HPI de makrofajların Fotoçevrim iniae. daire (A) tarafından belirlenen otik vezikül (yeşil tasvir) Makrofajlar, bir konfokal mikroskop 405 nm lazer kullanarak (B) photoconverted ve zamanla takip edildi. 24 HPI olarak, (kırmızı işaret edilen) kadar gövde / kaudal hematopoetik doku (C) olarak göç eden makrofajlar photoconverted; Ölçek çubuğu, 50 mikron. C çerçeve içindeki bölgelerin yüksek büyütme (i) ve (ii), ölçek çubuğu 30 um gösterilmiştir; oklar Photocon işaretdönüştürülüyor ve makrofajlar. Photoconverted hücreler nedeniyle 488 nm yeşil floresan kalan birleştirilmiş 543 nm kırmızı floresan ve herhangi beyaz görünür. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52788/52788fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection at JoVE.com

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

non-invasive-imaging-innate-immune-response-zebrafish-larval-model

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

10.8K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle. 

Video: Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Gelişim Biyolojisi

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Biyomühendislik

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Source: Harvie, E. A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52788">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes&#39; migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Bakteriyel Enfekte Transgenik Zebra Balıklarında Fotokonversiyon Tabanlı Lökosit Takibi

1. Preparing Microinjection Needles

	Prepare thin wall glass capillary injection needles (1.0 OD/0.75 ID) using a micropipette puller device with the ...

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler