Name: non-invasive imaging of the innate immune response in a zebrafish larval model of streptococcus iniae infection
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio per la cura e la manutenzione zebrafish. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 di EA Harvie e NIH R01GM074827 Anna Huttenlocher.

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	<li>Agnew, W., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+iniae:+An+aquatic+pathogen+of+global+veterinary+significance+and+a+challenging+candidate+for+reliable+vaccination.">Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination.</a> Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).</li><li>Danilova, N., Steiner, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+develop+in+the+zebrafish+pancreas.">B cells develop in the zebrafish pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hematopoiesis+and+Developing+Lymphoid+Organs+in+the+Zebrafish.">Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish.</a> Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo.">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).</li><li>Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus-Zebrafish+Model+of+Bacterial+Pathogenesis.">Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis.</a> Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).</li><li>Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+gene+family+and+TIR-domain+adapters+in+Danio+rerio.">Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio.</a> Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).</li><li>Meijer, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+the+Toll-like+receptor+and+TIR+domain+adaptor+families+of+zebrafish.">Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish.</a> Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).</li><li>Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complement+Factor+B-Like+cDNA+clone+from+the+Zebrafish+(Brachydanio+rerio).">A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio).</a> Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).</li><li>Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+respiratory+burst+assay+using+zebrafish+kidneys+and+embryos.">Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos.</a> J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).</li><li>Yoo, S. K., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+photolabeling+of+neutrophil+trafficking+during+inflammation+in+live+zebrafish.">Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Screen+for+Tuberculosis+Progression.">A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).</li><li>Veneman, W. J., Mar&#237;n-Juez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Optimization+of+a+High+Throughput+Setup+to+Study+Staphylococcus+epidermidis+and+Mycobacterium+marinum+Infection+as+a+Model+for+Drug+Discovery.">Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+signaling+mechanisms+mediate+neutrophil+attraction+to+bacterial+infection+and+tissue+injury.">Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury.</a> Cell. Microbiol. , (2012).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections.">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).</li><li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+S+Inhibits+Neutrophil+Recruitment+during+the+Early+Stages+of+Streptococcus+pyogenes+Infection.">Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li><li>Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+to+Probe+the+Divergent+Virulence+Potentials+and+Toxin+Requirements+of+Extraintestinal+Pathogenic+Escherichia+coli.">Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli.</a> PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).</li><li>Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Response+to+Streptococcus+iniae+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae.</a> Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).</li><li>Haddon, C., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Ear+Development+in+the+Embryo+of+the+Zebrafish,+Danio+rerio.">Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio.</a> J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).</li><li>Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+inner+ear.">Development of the zebrafish inner ear.</a> Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), (2009).</li><li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo:+unlike+macrophages,+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes.">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Il metodo di infezione usato qui è utile per lo studio della risposta immunitaria ad un&#39;infezione inizialmente localizzata in 2-3 embrioni DPF e larve. L&#39;obiettivo di uno stimolo infiammatorio, come l&#39;infezione, in una cavità chiuso come vescicola otica consente lo studio di neutrofili e macrofagi chemiotassi e fagocitosi. Un avvertimento di iniettare batteri nella vescicola otica è che la capacità dei neutrofili di fagocitare batteri efficientemente in cavità piene di liquido può dipendere dal particolare microbi. Sebbene Escherichia coli e Bacillus subtilis non sono facilmente fagocitati dai neutrofili nella vescicola otica 28, abbiamo trovato che i neutrofili sono in grado di fagocitare sia Pseudomonas aeruginosa e S. iniae in questa posizione 16, 24. Infezione localizzata è utile anche quando si studia l&#39;invasività dei vari agenti patogeni. Per causare un&#39;infezione sistemica i seguentinjection in una cavità chiusa, come vescicola otica, il microbo deve essere in grado di attraversare le barriere host fisici. In alternativa, diversi agenti patogeni possono contare su cellule ospiti per il trasporto e la diffusione dal sito iniziale di infezione. Questo rende le iniezioni localizzate utili per il confronto ceppi di virulenza alterata. Durante microiniezione, per eliminare i batteri sedimentazione e intasamento dei aghi, aghi di cambiamento sia dopo ogni condizione o dopo circa 50 larve. Ciò contribuirà a garantire la sospensione l&#39;ago è più uniforme. Se assestamento di batteri in dell&#39;ago sembra essere un problema, un mix di PBS, 2% PVP40, e il 10% di glicerolo può aiutare a mantenere una sospensione omogenea. Per garantire che ciascuna larva viene iniettato con approssimativamente lo stesso numero di batteri, controlla una conta omogeneizzando una larva immediatamente dopo l&#39;iniezione e l&#39;omogeneizzato placcatura sul CNA agar. CNA agar selezionerà per la crescita di batteri gram-positivi coltivabili, non soloS. iniae, ma fornirà un&#39;idea di quanto coerente le dosi di iniezione sono tra ogni individuo larva. Con un inoculo obiettivo di 100 CFU per larva, ci sono in genere tra 75-150 colonie su una piastra CNA. Il numero di non S. colonie gram-positivi iniae che crescono su un piatto CNA è probabilmente molto bassa, dal momento che la maggior parte dei pesci iniettato PBS solito comporta tra 0-20 colonie. Al più tardi momenti durante l&#39;infezione, non è raro che vi essere variazione fino a mezzo log nella conta delle colonie tra larve infettati con la stessa dose infettiva. Questo potrebbe rappresentare leggere differenze fra larva individuale nella loro capacità di controllare l&#39;infezione o potrebbe riflettere differenze nella quantità di batteri gram-positivi coltivabili in larve o E3 medie. Mentre iniettare nella vescicola otica, è importante non iniettare un volume eccessivo o con una pressione troppo alta poiché ciò potrebbe provocare la cavità rottura. Volumi di iniezione shoULD essere mantenuto a circa 1 NL. Se l&#39;ago è troppo grande, la microiniezione può causare danni al tessuto circostante, che possono influenzare il reclutamento dei leucociti ospitanti al sito di infezione o batteri possono consentire di fuoriuscire della vescicola otic. E &#39;anche importante confermare iniezione nello spazio corretta. Se l&#39;ago viene inserito troppo in profondità, può colpire attraverso la vescicola otica o può colpire i vasi sanguigni che scorre intorno vescicola otica. Questo può portare alla deposizione di batteri nel sangue o all&#39;esterno della vescicola, che possono alterare risposta dell&#39;ospite. È anche possibile che quando l&#39;ago viene estratto, alcuni batteri possono essere accidentalmente depositati fuori vescicola otica, come dimostrato da Colucci-Guyon et al. 28, ma troviamo questo solo il caso in meno del 5% delle iniezioni. Cercando di iniettare nel centro della vescicola otic può contribuire ad evitare questa situazione. In una infezione di successo, la vescicola otica dovrebbe riempire with il colorante rosso fenolo, ma il colorante non deve fuoriuscire nei tessuti circostanti. Qualsiasi larve mis-iniezione deve essere immediatamente scartata. Iniezione di batteri etichettati è un modo utile per confermare una iniezione di successo (Figura 1B). Uno degli svantaggi di usare un colorante CellTracker è che questo colorante diventerà diluito come i batteri dividono, eventualmente impedendo ai batteri vengano visualizzati sotto fluorescenza. Abbiamo scelto un colorante rosso perché abbiamo usato neutrofili etichetta verde e linee transgeniche macrofagi per la maggior parte dei nostri studi. Dendra2 è una proteina derivata da fotoconvertibile ottocorallo Dendronephthya sp. che può essere photoconverted da verde a uno stato fluorescente rosso con un laser 405 nm 29. Questo fotoconversione è un modo non invasivo per marcare le cellule e monitorare il loro destino nel corso dell&#39;infezione. I leucociti reclutati al sito di infezione possono essere photoconverted e seguiti nel tempo per monitorare il loro dissemination tutta tessuti dell&#39;ospite (Figura 3). In alternativa, leucociti potrebbero essere photoconverted prima infezione e poi monitorati post-microiniezione per determinare l&#39;origine delle cellule reclutate al sito di infezione. Etichettatura batteri e cellule immunitarie consente per lo studio delle interazioni leucociti-patogeno in vivo, tra cui l&#39;assunzione e la fagocitosi (Figura 1B e Figura 2). Distinguere la S. rosso marcato iniae dalla fluorescenza rossa di un leucocita photoconverted è difficile, quindi un diverso CellTracker colorante fluorescente potrebbe essere usato. Ciò sarebbe particolarmente utile per determinare quale delle cellule immunitarie photoconverted che lasciano la vescicola otica contiene S. iniae. Le future applicazioni del metodo dell&#39;infezione vescicola otica potrebbero includere la misurazione della velocità e direzionalità con cui neutrofili e macrofagi muovono in risposta a varie infezioni. Il k infezioneinetics può anche essere studiata per vedere quali cellule tipi sono i primi ad arrivare a un sito di infezione e quali tipi di cellule sono più robusta reclutati oltre a dove le cellule provengono o dove diffondere 30. Oltre a studiare l&#39;assunzione di un&#39;infezione inizialmente localizzata, questo modello infezione può essere usato per studiare la funzione dei componenti del sistema immunitario ospite durante l&#39;infezione iniziale. Oligonucleotidi antisenso morfolino mirati RNA specifici possono essere utilizzati per abbattere l&#39;espressione di accoglienza componenti del sistema immunitario, tra cui i recettori Toll-like, i recettori delle citochine e leucociti, e CRISPR-Cas o la tecnologia TALEN possono essere usati per creare mutanti genetici. Espressione genica utilizzando RNAseq o qPCR può anche essere utilizzato per caratterizzare l&#39;espressione di alcuni geni ospitanti in risposta alle infezioni.

Streptococcus iniae è un importante agente patogeno acquatica che è in grado di causare una malattia sistemica, sia di pesce e gli esseri umani 1. Mentre S. iniae è responsabile per le grandi perdite nel settore dell&#39;acquacoltura, è anche un potenziale patogeno zoonotico, in grado di causare malattie in ospiti umani immunocompromessi con patologie cliniche simili a quelli causati da altri agenti patogeni umani streptococco. Date le sue somiglianze con agenti patogeni umani, è importante studiare S. malattia iniae patogenesi nel contesto di un ospite naturale. Un modello zebrafish adulto di S. infezione iniae rivelato robusto infiltrazione di leucociti host al sito di infezione localizzata nonché un rapido time per ospitare la morte, un tempo troppo breve per coinvolge il sistema immunitario adattativo 7. Al fine di ottenere uno sguardo approfondito nella risposta immunitaria innata di S. iniae infezione in vivo, è necessario utilizzare un modello che è più suscettibile di non-invasive immagini dal vivo. Il pesce zebra larvale ha una serie di vantaggi che lo rendono un modello vertebrato sempre più interessante per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Zebrafish sono relativamente economico e facile da usare e mantenere rispetto ai modelli di mammifero. Immunità adattativa non è funzionalmente maturo fino 4-6 settimane dopo la fecondazione, ma larve hanno un sistema immunitario innato vertebrati altamente conservata con complemento, recettori Toll-like, citochine e dei neutrofili e macrofagi con capacità antimicrobiche tra cui la fagocitosi e burst respiratorio 2-6, 8-11. Inoltre, la trattabilità genetica e trasparenza ottica delle fasi embrionali e larvali di sviluppo consentono la generazione di linee transgeniche stabili con cellule immunitarie fluorescente rendendo possibile esaminare interazioni ospite-patogeno in tempo reale in vivo. La generazione di queste linee transgeniche utilizzando una proteina fotoconvertibile come Dendra2 consente il tracciamento di origine della cellula ospite individuale e destino nel corso di infezione 12. Nello sviluppo di un modello di infezione larvale zebrafish, il sito scelto di microiniezione determinerà se l&#39;infezione è localizzata inizialmente o sistemica. Infezioni del sangue sistemiche nella vena caudale o condotto di Cuvier sono più comunemente utilizzati per studiare patogeni microbici in zebrafish e sono utili per lo studio delle interazioni tra ospite e cellule microbiche, risposte citochine, e le differenze nella virulenza tra i ceppi patogeni. Per la crescita di microorganismi lenti, iniezione presto nel sacco vitellino di un embrione allo stadio 16-1,000 cella può essere utilizzato per generare una infezione sistemica 13,14, con lo stadio di sviluppo ottimale per microiniezione di un microrganismo a crescita lenta trovato essere tra la fase di 16-128 cellule 15. Tuttavia, tuorlo iniezioni sac di molti microbi nelle fasi successive di sviluppo accoglienza tendono ad essere letale per tegli ospitare dovuto l&#39;ambiente ricco di sostanze nutritive per il microbo e la mancanza di infiltrazione leucociti 16-18. Una infezione localizzata di solito si traduce nella migrazione dei leucociti diretto verso il sito di infezione che possono essere facilmente quantificata con imaging non invasivo. Questo tipo di infezione può permettere per la dissezione dei meccanismi che mediano la migrazione dei leucociti, nonché le ricerche delle diverse capacità migratorie e fagocitosi delle diverse popolazioni di leucociti. Infezioni localizzate sono utili anche quando si esaminano le differenze di virulenza tra ceppi batterici oltre a studiare i meccanismi di invasione dal microbo barriere host fisici devono essere attraversate per una infezione localizzata di diventare sistemica. Zebrafish sono tipicamente sollevato a temperature di 25-31 ° C 19, ma possono anche essere mantenuto a temperature di 34-35 ° C per studi di invasività di alcuni agenti patogeni umani con requisiti di temperatura severiper la virulenza 20, 21. Molti siti differenti sono stati utilizzati per generare un&#39;infezione batterica inizialmente localizzata compresa ventricolo hindbrain 22, dorsale coda muscolare 18, pericardio cavità 23, e vescicole otica (orecchio) 5, 16, 24. Tuttavia, si è trovato che l&#39;iniezione di batteri nel muscolo coda può causare danni ai tessuti e infiammazione indipendente dei batteri, che possono alterare i risultati in cui si esamina risposta leucocitaria 13. Anche se meno danno è associato iniezione nel romboencefalo e anche se inizialmente privo di leucociti nei giovani embrioni, il ventricolo hindbrain guadagna costantemente più cellule immunitarie nel tempo microglia prendono la residenza. Il ventricolo rombencefalo è anche una posizione più difficile da immagine. La vescicola otica è una cavità chiusa senza accesso diretto alla vascolarizzazione 25, 26. Normalmente è privo di leukocytes, ma leucociti possono essere reclutati per vescicola otica in risposta a stimoli infiammatori come l&#39;infezione. E &#39;anche un sito preferito per microiniezione di batteri in zebrafish età 2-3 giorni dopo la fecondazione (dpf) a causa della facilità di imaging e la visualizzazione di iniezione. Pertanto, abbiamo scelto la vescicola otica come il nostro sito di infezione batterica localizzata.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G x &amp;frac12; in. needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA agar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Disposable transfer pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Fine tweezers</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Gel comb</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4.2 mm width, 1.5 mm thick</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td></td><td></td><td>Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>High melt agarose</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>with FV-1000 system</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection system</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotmeter</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Protease peptone</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Small cell culture dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Thin wall glass capillary injection needles</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Fluka Biochemika</td><td>92144</td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive imaging of the innate immune response in a zebrafish larval model of streptococcus iniae infection

L&#39;agente patogeno acquatica, Streptococcus iniae, è responsabile di oltre 100 milioni di dollari di perdite annuali per il settore dell&#39;acquacoltura ed è in grado di causare la malattia sistemica sia di pesce e gli esseri umani. Una migliore comprensione del S. malattia iniae patogenesi richiede un sistema di modello appropriato. La trattabilità genetica e la trasparenza ottica delle prime fasi di sviluppo di zebrafish permettono la generazione e non invasiva di imaging di linee transgeniche con fluorescente contrassegnati cellule immunitarie. Il sistema immunitario adattativo, non è pienamente funzionale fino a qualche settimane dopo la fecondazione, ma larve di pesce zebra hanno un sistema immunitario innato vertebrati conservati sia con neutrofili e macrofagi. Così, la generazione di un modello di infezione larvale consente lo studio del contributo specifico di immunità innata nel controllo S. infezione iniae. Il sito di microiniezione determinerà se l&#39;infezione èsistemica o inizialmente localizzato. Qui, vi presentiamo i nostri protocolli di iniezione vescicola otica di zebrafish età 2-3 giorni dopo la fecondazione e le nostre tecniche per l&#39;imaging confocale a fluorescenza di infezione. Un sito di infezione localizzata permette l&#39;osservazione di invasione microbo iniziale, reclutamento di cellule ospiti e la diffusione di infezioni. I nostri risultati utilizzando il modello larvale zebrafish di S. infezione iniae indicano che zebrafish può essere utilizzato per esaminare i contributi diversi di neutrofili e macrofagi ospitanti in infezioni batteriche localizzate. Inoltre, viene descritto come photolabeling di cellule immunitarie possono essere utilizzati per monitorare il destino della cellula ospite individuale nel corso di infezione.

Microiniezione di S. iniae nella vescicola otica (Figura 1 e Figura 2) si traduce in una risposta dell&#39;ospite inizialmente localizzata. Quando iniettato correttamente, i batteri dovrebbero essere viste soltanto vescicola otica e non nel tessuto circostante o sangue. Questo può essere visualizzato durante microiniezione utilizzando colorante rosso fenolo (Figura 1A). In alternativa, se i batteri etichettati vengono iniettate, una rapida scansione delle larve infetti inviare immediatamente l&#39;iniezione in grado di confermare i batteri sono solo nella vescicola otica e non il tessuto circostante (Figura 1B). Anche se una dose non più di 10 CFU selvaggio tipo S. iniae è in grado di stabilire una infezione letale entro 24-48 ore dopo l&#39;infezione (HPI), iniezione di 1.000 UFC di un ceppo avirulent, CPSA, non comporta l&#39;infezione letale e che sforzo non sembra in grado di proliferare in accoglienza 24. Pertanto, questo modello di infezione localizzata può differentiate tra i ceppi batterici di virulenza alterata. Siti di microiniezione di infezione localizzata inizialmente sono utili per studiare chemiotassi dei leucociti. Il reclutamento dei leucociti può venire quantificato da uno nero Sudan colorazione di granuli neutrofili (Figura 1A) o la formaldeide la fissazione di linee transgeniche fluorescenti (Figura 1B). Per visualizzare il reclutamento e le capacità di fagocitosi delle cellule immunitarie, abbiamo utilizzato linee transgeniche che esprimono la proteina fluorescente verde Dendra2 particolare nei macrofagi Tg (MPEG1: dendra2) 24 o neutrofili Tg (mpx: dendra2) 12. Quando S. iniae viene iniettato nella vescicola otica di 3 dpf larve, sia neutrofili e macrofagi vengono rapidamente reclutati nei primi 2 HPI (Figura 1). Tuttavia, quando eseguito correttamente, microiniezione di PBS nella vescicola otica non comporta la stessa robusta reclutamento dei leucociti ospitanti ( <strong&gt; Figura 1). In aggiunta alle assunzioni, vivere confocale lasso di tempo di imaging di linee transgeniche fluorescenti iniettati con batteri fluorescenza marcata rivela le capacità di fagocitosi sia neutrofili e macrofagi. Dye-etichetta Red S. iniae si trova all&#39;interno di entrambi i neutrofili e macrofagi (Figura 2). Utilizzando la proteina Dendra2 fotoconvertibile etichettare neutrofili o macrofagi consente photolabeling non invasiva per il monitoraggio destino singola cella nel corso dell&#39;infezione. I macrofagi che sono stati reclutati per la vescicola otica a 5 HPI sono stati photoconverted e poi rintracciati sul 24 ore seguenti. Sebbene alcune cellule photoconverted rimangono nella vescicole o la testa regione otica, alcuni possono anche essere trovati diffusi in tutto il corpo delle larve (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52788/52788fig1highres.jpg" width="550" /> <strong&gt; Figura 1: il reclutamento dei leucociti all&#39;infezione vescicole otic con S. iniae. (A) neutrofili reclutamento S. infezione iniae. (I) l&#39;iniezione di successo di un inoculo rosso marcato fenolo nella vescicola otica. (Ii - iv) nero Sudan colorazione di larve per le indagini di neutrofili assunzioni a 2 HPI. PBS mock-infettate larve mostrano poco reclutamento dei neutrofili alla vescicola otica (ii), mentre l&#39;infezione con entrambi wild type S. iniae oi CPSA risultati mutanti in robusto reclutamento dei neutrofili (iii, iv). Bar Scala, 300 micron. (B) il reclutamento di macrofagi a S. infezione iniae. (I) microiniezione successo di rosso marcato S. iniae (rappresentato in magenta) nella vescicola otica. (Ii - iv) immagini confocale a fluorescenza di microiniezione mp transgenicoEG1: dendra2 larve fissato a 2 HPI. PBS mock-infettate larve mostrano poco macrofagi reclutamento (ii), ma larve infettati con CellTracker Red marcato (rappresentato in magenta) wild type S. iniae o il CPSA spettacolo mutante robusto macrofagi reclutamento vescicola otica a 2 HPI (iii, iv). Bar Scala, 30 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52788/52788fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52788/52788fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: fagocitosi di S. iniae dai fagociti nella vescicola otica mpx transgenici:. dendra2 (A) o MPEG1: dendra2 (B) larva infettato con il rosso marcato S. iniae (rappresentato in magenta) e ripreso al posto infezione 60 minuti utilizzando un scann lasering microscopio confocale. Bar Scala, 30 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52788/52788fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52788/52788fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: Fotoconversione dei macrofagi al otic vescicole 5 HPI con S. iniae. I macrofagi (raffigurati in verde) vescicola otica, designati dal cerchio (A), sono stati photoconverted (B) utilizzando un laser 405 nm su un microscopio confocale e tracciati nel tempo. Entro il 24 hpi, macrofagi photoconverted (rappresentato in magenta) sono migrati fino al tronco / caudale tessuto emopoietico (C); barra della scala, 50 micron. Ingrandimenti superiori delle regioni in scatola di C sono riportati in (i) e (ii), barra della scala 30 micron; frecce indicano photoconmacrofagi convertito. Cellule Photoconverted appaiono bianche a causa della risultante dalla fusione 543 nm fluorescenza rossa e qualsiasi residuo 488 nm fluorescenza verde. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52788/52788fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

10.8K Views.  University of Wisconsin-Madison. Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle. 

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Immunologia e infezioni

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Non invasiva Imaging di candidosi disseminata nelle larve Zebrafish

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Stabilimento di larvale Zebrafish come modello animale per indagare Trypanosoma cruzi motilità In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafish embrioni

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

Sviluppo di un modello di infezione del pesce zebra Larval per Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Un modello di embrione di Zebrafish per nel Vivo visualizzazione e analisi videomicroscopia del biomateriale-collegata dello stafilococco aureo infezione

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Bioingegneria

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Source: Harvie, E. A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52788">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes&#39; migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Tracciamento dei leucociti basato sulla fotoconversione in zebrafish transgenico infetto da batteri

1. Preparing Microinjection Needles

	Prepare thin wall glass capillary injection needles (1.0 OD/0.75 ID) using a micropipette puller device with the ...

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale

Riepilogo

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