Name: scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibe, R44 GM087784 ve R01 HL109505 tarafından kısmen desteklenmiştir. Yazarlar genişletilmiş teknik destek için, Gilson de INC teknik ve OEM ekibine teşekkür ediyorum.

96 gözlü plaka formatında geleneksel yapışkan kültür koşullarını korurken Aşağıdaki protokoller için Gilson en pipetmaX olan robot sıvı taşıma sistemi, ölçeklenebilir kök hücre kültürü ve otomatik kolaylaştırır. Geleneksel 6-çukurlu plaka kültürü gibi, iPSCs ayrı koloniler, bir tek tabaka olarak değil, 96 oyuklu bir plaka biçiminde, bu protokol ile yetiştirilmektedir. Her oyuk izogenik ya da ayrı olabilir ve robot her bir oyuğa ayrılmış devam çünkü yapılandırma da paralel kültürlenebilir. kültürler özelleştirilebilir bir zamanlama ve kullanıcı böylelikle ekim yoğunluğu ve ölçek oranını kontrol ayrışma yöntemi ve bölme oranını seçer bir geçit programı beslenen bir beslenme programı: Tipik robotik iPSC kültür rutin iki aşaması vardır. Aşağıdaki protokoller yeni bir kültür besleme ve geçit gerçekleştirilir nasıl başladı ve iPSC kültürünü kolaylaştıran ek programlar nasıl açıklar. 1. Hazırlama Ekstrasellüler matris jel kaplı 96 oyuklu levhalar <ol><li> Altı yeni RT 96 oyuklu plakalar ambalajını çıkartın ve pozisyonlar 2, 3, 5, 7, 8, 9 (yatak pozisyonları Şekil 1A bakınız) robot yatak taşıma sıvısı üzerine yerleştirin. </li><li> Yatak konum 6&#39;da bir önceden soğutulmuş, 4 ° C 4-çukurlu çukur yerleştirin. </li><li> Önceden soğutulmuş, 4 ° C 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12. </li><li> Steril tekniği kullanarak bir kısım dökerek 25 ml 4 ° C DMEM / F12 ile yatak pozisyonunda 6 iyi ilk (sol çoğu) çukur doldurun. Alternatif olarak, transferi tamamlamak için pipet kullanın. </li><li> (PLHR, Şekil 1A bakınız) 96-plaka kapaklarını çıkarın ve özel olarak tasarlanmış plaka kapağı tutan rafın içine her kaydırın. Temastan kaçınınplaka kapakları iç ile. Not: Bir tabak kapağın içini Taşıma veya bir kapağın içinde başka dışında bulaşma için mükemmel bir yoldur dokunan plaka kapakları istifleme. </li><li> Robotik kontrolü dokunmatik tabletin kullanılması, iyi ön ıslatma işlemini başlatmak için düğmeler aşağıdaki dizi basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Hücre dışı matris jel ön ıslatılmış&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Ön ıslatma işlemi (adım 1.6) sırasında 1.8 adıma geçin. </li><li> Büyüme faktörü buz bir 4 mg kısım üzerine çözülme 50 ml içinde bulunan hücre dışı matris jel (GFRM) azalırkonik tüp -80 ° C&#39;de saklandı. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde kısım tutun. Not: oda sıcaklığına gelmeye bırakılmış ve yararlı olmayacak eğer GFRM katılaşmaktadır. </li><li> 25 ml&#39;lik bir cam pipet ile 24 ml 4 ° C DMEM / F12 içinde 4 mg GFRM kısım yeniden süspanse edin. DMEM / F12 aktarırken, pipet GFRM kısım resuspending önce soğuması için 2-3 saniye duraklama. </li><li> Ön-ıslatma işlemi (adım 1.6) tamamlandığında, 1.11 adıma devam eder. </li><li> Yatakta pozisyonunda 6 çukur dördüncü kuyusuna DMEM / F12 GFRM karışımı 24 ml aktarın. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, hücre dışı matris jel kaplama işlemini başlatmak için düğmeler aşağıdaki dizi basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Hücre dışı matriks jel kısım&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: robot çalıştırmak ancak rathe değilr yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Adım 1.12 tamamlandığında, plaka kapaklarını değiştirin. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plakalar transfer ve plakalar kullanmak veya hafızaya hazır olacak bu noktada 24 saat orada tutun. Not: hafifletici koşullar altında, yeni kaplanmış hücre dışı matris jel plakaları önerilir inkübasyon, ancak 24 saatlik inkübasyon için O / N, 15-30 dakika sonra kullanılabilir. </li><li> Tekrarlama protokol 1.1, 1.3, GFRM ile DMEM / F12 tüm kadar 1,5-1,6, 1.10 ve 1,12-14 kullanılır adımları. </li></ol> 2. Saklama Ekstrasellüler matris jel kaplı 96 oyuklu levhalar <ol><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plakalar. </li><li> İsteğe bağlı: Ahücre-dışı matrisin llow jel kaplı 96 oyuklu plakalar 2.3 adımına devam etmeden önce, oda sıcaklığına gelmesi. Not: Bu isteğe bağlı bir adımdır plakaları 4 ° C&#39;de konulduğunda yoğunlaşma kurmak azaltacaktır. </li><li> Pozisyonlar 2, 3, 5, 7, 8, 9 (yatak pozisyonları Şekil 1A bakınız) sıvı kotarma robotu yatak plakaları yerleştirin. </li><li> RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12. </li><li> Yatak konum 6&#39;da dört çukur rezervuar yerleştirin. </li><li> (En sağdaki) RT DMEM / F12 ile rezervuarın kuyusunu 4 doldurun. </li><li> 96-plaka kapaklarını çıkarın ve PLHR içine her kaydırın. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Hücre dışı matriks jel kısım&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: Robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Tamamlandığında, plaka kapaklarını değiştirmek ve makine yataktan plakaları çıkarın. </li><li> 6 inç parafın film şeridi ile bir inç her hücre dışı matris jel (kapak plakası karşılayan) kaplı 96 oyuklu plakanın tüm yan etrafında sarılır. Hava geçirmez bir mühür oluşturmak için parafin filmi germek emin olun. </li><li> İsteğe bağlı: tamamlanan hücre dışı matriks jel kaplama tarih plakaları Etiket, hücre dışı matris jel lot numarası, kullanıcı adı ve diğer bilgiler. </li><li> Onlar kadar iki hafta boyunca kullanmak için iyi olacaktır 4 ° C&#39;de plakaları saklayın. Not: Tabaklar başarıyla ancak bu tavsiye edilmez, iki haftalık sınırın ötesine kullanılmıştır. </li></ol> 3. Kök Hücre Colony Yayımlama Yoğunluk SahneCanlı veya dondurulmuş Kültür 96-kuyu Plate Formatında Gradyan: Nasıl başlatın veya bir Kök Hücre Hattı Normal Passage Aralıkları Geri Yükleme <ol><li> Donmuş bir kültür ile başlayan varsa, 3.2 adıma geçin. Zaten bir plaka üzerinde canlı kök hücre kültürü ile başlayan, adım 3.5 başlar. </li><li> Buz sadece küçük bir yığın kalana kadar 37 ° C su banyosu içinde tüp dönen donmuş kültür çözülme. </li><li> İsteğe bağlı: 10 uM Y27632 ihtiva eden taze SCGM süpernatan ortamı aspire ve 7 ml kök hücre pelletini, 300 x g&#39;de 2 dakika süre ile hücre büyüme ortamı (SCGM), santrifüj kök R, 10 ml eritilmiş hücreleri ile seyreltilir. Not: Bu adım donma medya taşınmasını ortadan kaldırır. </li><li> 3.6 Adım geçin. </li><li> Canlı ile başlayan varsa, zaten kök hücreleri kaplama: geçit hücreleri normal olarak enzimatik veya non-enzimatik ayrışma kullanarak. 1,5-3000000 hücrelerinin toplam hasat etmeye çalışın; Genellikle, altı oyuklu plakanın bir de. Hasat hücreler santrifüj2 dk 300 xg&#39;de, süpernatant medya aspire ve 10 mM Y27632 içeren 7 ml taze SCGM kök hücre pelletini. 3.6 Adım geçin. </li><li> Hücreler sağlamak ya donmuş bir ya da canlı kültürden, 10 uM Y27632 7 mi RT SCGM içerisinde süspanse edilir. </li><li> RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda tek uç rafın yük sütunu 12. </li><li> Yatak 2 konumunda bir dört çukur rezervuar yerleştirin. </li><li> Yerleştirin yeni bir hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plaka yatağı 5 konumundaki 37 ° C&#39;ye kadar ön-ısıtılır ve PLHR yerleştirerek kapağı çıkarın. </li><li> Pipetlemeyin ile rezervuarın kuyuya 3 yeniden süspanse hücrelerin 7 ml aktarın veya steril dökün. <ol><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: </li><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Tohum Yoğunluk Gradient&quot; i seçin ve yanındaki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: select önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokununed programı. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li></ol></li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li><li> Seyreltme serisi tamamlandığında, aşağıdaki besleme kadar 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör plaka ve yeri yeniden kapsamaktadır. </li><li> İsteğe bağlı: Tarihe, gerilme bilgileri, kullanıcı adı, medya türü ve diğer ilgili bilgileri ile plaka etiketleyin. </li><li> Aşağıdaki Protokolü 4 kullanılarak gerektiği gibi önümüzdeki birkaç gün içinde, 96-plaka besleyin. Not: Tipik bir kök hücre plakası tam bir medya değiştireceğim kez her 24 saat gerektirir ve SCGM beslenmesi için Y27632 içermez; Sadece geçtikten sonra ilk tohumlama sırasında. Beslenme öncesinde, kirlenme ve koloni yoğunluğu plaka kontrol edin. Koloni yoğunluğu izleme konusunda daha fazla adım için 3.16 bakın. </li><li> C yakın Önümüzdeki birkaç gün içinde, çeşitli sütunlarplaka girmek (genellikle sütunlar 5-8) geçiş için ideal bir yoğunluk yaklaşım olacaktır; Bu yoğunluk tanımlamak için, akılda aşağıdaki bilgilerle Şekil 3B&#39;de gösterilen yoğunluk aralığında 96-plaka karşılaştırmak: <ol><li> Passage kolonilerin çoğunluk arasındaki boşluk bitişik koloni çapı yaklaşık% 25 olduğu zaman. Not: mantığı geçiş zamanı tanımlamak için beslenme ve büyüme başka bir döngü kaçınılmalıdır temas, yapım kolonilerde neden olduğunu ifade etti. </li></ol></li><li> Üniform seyreltilmiş plaka başlatmak ve düzenli kültürünü başlamak için ideal bir yoğunluk ve geçit olan bir sütun seçin. Geçişine Protokol 5&#39;e bakınız. </li></ol> 4. Besleme 96 oyuklu plaka Kök Hücre kolonileri Not: Aşağıdaki protokol, bir 96 oyuklu kök hücre koloni plakanın besleme tarif etmektedir. teknik, paralel toplam 6 plakaları barındıracak kadar ölçeklendirilebilir. <ol><li> 96-kuyu s kaldır37 ° C ile tem hücre kolonisi levha,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör. </li><li> Kirlenme ve hücre yoğunluğu için plaka kontrol edin. Beslemek için, koloni yoğunluğu ideal bir kanalı yoğunluğunun altında olduğundan emin olun. Yoğunluk hakkında bilgi için Şekil 3B bakın. Not: Kirlilik olarak bulanık ortamı sunabilir ve hoş olmayan bir koku eşlik. Küçük, tabii ki sigara iPSC agrega da mikroskobik denetimi altında görülebilir. Hücre yoğunluğu değerlendirmek için yukarıdaki adım 3.16.1 bakın. </li><li> Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun. </li><li> RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12. </li><li> Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin. </li><li> Steril dökmek veya pipet transferi yoluyla Y27632 olmadan 2 8 ml taze yatak pozisyonu, RT SCGM içinde çukur kuyusunu 3 doldurun. </li><li> PLHR yerleştirerek 96-iyi kök hücre koloni plakası kapağını çıkarın. </li><li> KullanmaRobotik kontrol touch pad, düğmeler aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Koloni Bir Plaka Yem&quot; ve yanındaki dokunun seçin. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; düğmesine dokunun. Not robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Besleme protokolü tamamlandığında, 96 oyuklu kök hücre koloni plaka yeniden kapak ve 37 ° C&#39;de geri dönmek için,% 5 CO2, aşağıdaki besleme ya da geçiş kadar nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı gereklidir. Bu, genellikle, 24 saat sonra, gereklidir. Not: Tarih, ortam türü, kullanıcı adı ve diğer ilgili bilgilerle plaka kapağında besleme olayı kaydetmek için tavsiye edilir. </li></ol> 5. Pasajlanması 96 oyuklu PlHücre Koloni Kök yedik <ol><li> Birkaç beslenme döngüsünden sonra 96 ​​de kök hücre koloni plaka geçişi için hazır olacaktır. Bu protokol, 01:12 bölme oranını temsil eden, tek bir 96 oyuklu plakaya bir sütun geçişini tarif etmektedir. Kullanıcı bölünmüş oranını tanımlar ve komşu olmayabilir kuyuları seçerek dahil, split kuyular veya sütun herhangi bir sayı seçebilirsiniz. </li><li> Olup kanalı belirlemek için 3B Şekil 96 oyuklu kök hücre koloni plakası yoğunluğu Karşılaştırması. kolonilerin çoğunda arasındaki boşluk, bitişik koloni çapı yaklaşık olarak% 25 ya da daha sonraki bir besleme birbirlerine büyüyen koloniler ile sonuçlanacaktır idealdir geçit yoğunluğudur. </li><li> Hiçbir kirlenme olmadığından emin olmak için mikroskop altında 96-iyi kök hücre koloni plakasını inceleyin. </li><li> Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun. </li><li> RT 200 ul pipet ile yatak pozisyonunda 1 ucu yükleme rafa Yük kolonlar 8-12ipuçları. </li><li> Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin. </li><li> Boş çukur kuyu 1 bırakın, kuyunun 2 8.5 ml SCGM + 10 uM Y27632 koymak kuyuya 3 3.5 ml 30% proteolitik ve kolajenolitik ayrışma ayıracı (veya EDTA bazlı ayrılma ayıracı) koymak, kuyunun 4 4.5 ml PBS koydu. Not: Bütün reaktifler oda sıcaklığında veya 37 ° C de olabilir. PBS ile seyreltildi% 30 RT proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktifi adipoz kullanıldı ve fibroblast iPSC kültürü burada tarif edilen. </li><li> Yatak 5 konumundaki yeni bir önceden ısıtılmış 37 ° C hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plaka koyun. </li><li> 96 oyuklu kök hücre koloni plakası kapağı, hem de yeni bir 96 oyuklu plaka kapağı çıkarın ve PLHR onları hem yerleştirin. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Koloni Bölünmüş 01:12 sütun 1&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: dokunun &quot;test sürüşü&quot; kullanmak içinadım-adım sihirbaz seçilen programı önceden test etmek için. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Geçit protokolü bittikten sonra, her iki plakaları yeniden kapsamaktadır. </li><li> İsteğe bağlı: Gerekli bilgilerle yeni plaka etiketleyin (örneğin, tarih, hücre hattı, geçit sayısı, ortam türü, kullanıcı adı, vb). </li><li> 37 ° C, her iki plakaları Dönüş,% 5 CO2, aşağıdaki besleme ya da geçiş kadar nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı gereklidir. Not: Bir sonraki beslenme 24 saat sonra tipik olarak. Not: Hücreler ve koloniler bölme 2-3 saat içinde plaka takmak ve çok yayılmış bakmak gerekir. Bu, Rho-kinaz inhibitörünün varlığı nedeniyle ve hücreleri (örneğin, parke taşı paketlendi koloniler wi karakteristik kök hücre morfolojisi yoğunlaştırmak ve sergileyecekİlk Rho-kinaz inhibitörü ücretsiz beslenme sonrası büyük çekirdek oranı küçük hücreli hacmi) th. </li></ol> Üretim 6. Hasat 96 gözlü levhalar Kök Hücreler Not: Hücre kolonileri kültürü sırasında herhangi bir noktada kullanım için hasat edilebilir Stem. Hücreler geçit hazır olduğunuzda Genellikle bu gerçekleşir (protokolü 5). Bu protokol, 96 oyuklu bir kök hücre koloni plaka on sütun hasat açıklamaktadır. <ol><li> Hiçbir kirlenme olmadığından emin olmak için mikroskop altında 96-iyi kök hücre koloni plakasını inceleyin. </li><li> Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun. </li><li> Yük sütunlar RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu yükleme raf 11 ve 12. </li><li> Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin. </li><li> Bırakın yalak kuyu 1 boş, kuyunun 2 8.5 ml SCGM put 3.5 ml% 30 proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktif (veya EDTA bazlı ayrılma reaktif) kuyuda3, kuyunun 4 4.5 ml PBS koydu. Not: Bütün reaktifler oda sıcaklığında veya 37 ° C de olabilir. </li><li> PLHR 96-de kök hücre koloni plaka kapağı ve yer çıkarın. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Koloni Hasat Sütunları 2-12&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. Not: toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hücreler yalak kuyuya 2 olması ve toplama için hazır olacaktır. </li></ol></li></ol>

Yazarlar MKC, MJG, EEB, NJD ve RO ya da burada açıklanan robotik protokolleri tasavvur ve gelişmiş InvivoSciences geliştirme çalışanlarının, INC zamanında idi. TW InvivoSciences INC CSO olduğunu. SH Gilson INC bir çalışanıdır.

Bu çalışmada küçültüyor ve aynı zamanda verimli ölçek yukarı sağlarken bir 96-plaka biçiminde beslenme ve geçit otomatik iPSC üretimi için robotik kültürün bir yöntem geliştirdi. Bir sıvı kotarma robotu rutin enzimatik ayrılma düzenli aralıklarla iPSC koloniler ve geçiş onları beslemek için kullanılmıştır. Robot, aynı zamanda hücre dışı matris jel kaplanmış plakalar üretilmesi ve tohum yoğunluğu gradyanı gerçekleştirmek için programlanmıştır. Fibroblast ve adipoz türetilmiş iPSCs daha büyük 20 pasajlar, yaklaşık 3 ay boyunca bu sistemde kültürlendi zaman stabil karyotipleri gibi, pluripotense, muhafaza edilmiştir. Her iki hücre dizisi kardiyomiyositlerde farklılaşma sahip idi. Birlikte, burada açıklanan protokollerin koleksiyon kültür kök hücrelere çok az kök hücre kültürü deneyimi veya özel kültür ekipmanına sınırlı erişimi olan kullanıcılar sağlar ve yüksek hücre üretimini ya da çok az emek ve maliyetle taşıma çoklu çizgi elde. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; burada ayrıntılı robot protokoller iPSC üretim ve kullanım, ekonomik olarak üretim için bir yöntem sağlar. Bir avantajı burada ortaya kurulmuş bir plaka bazlı biçimde ölçeklenebilir kök hücre kültürü ve önceden 44,47 - 49 pluripotensini korumak için. Ölçeklenebilir kök hücre kültürü verimi pluripotent hücrelerin diğer formatlar 20,23,29 bu plaka bazlı yöntem adaptasyonu gibi süspansiyon kültür biçiminde esasen hiçbir değişiklik, kimyasal madde veya Rho-kinaz inhibitörü 20 uzun süreli kullanımı köpük önleyici kullanımını gerektirir iken. Kültür koşulları benzer çünkü bu plaka bazlı yöntem, bu nedenle hızlı bir şekilde ve tahmin edilebileceği gibi, yeni çizgiler ağırlayacak. Hastalık modelleme iPSCs kullanımı 4,6,19,50 arttıkça, yeni iPSC çizgileri sürekli olarak üretilir. biçimine üzerine geçiş bariyer l çünkü burada açıklanan teknikler yüksek hacimli ve verimlilik orta kültür yeni hatlar için en uygunah. Bu aynı zamanda sömürgeleri korumak için gerekli emek ve ekipman için de geçerlidir. Biçimi ve taşıma elde ve yönlendirilmiş farklılaşma iPSC hatları, kültür performansını doğrulamak için kullanılan ortam benzer çünkü Son olarak, tahmin edilebilir olması muhtemeldir. Şekil 8, 96 oyuklu plakalar içinde kök hücre üretiminin olarak üretim için bir strateji göstermektedir. Bir tabak (Döngü 0) robot 12 yeni tabaklar, 12 kat artış (1 Çevrim 0) tohum kullanılır. Beslenmenin birkaç gün sonra, oniki plakaları on iki tabak (Döngü 2 Döngü 1) başka bir dizi tohum geçişli olduğunu. Geriye kalan on plakalar diğer kullanımlar için şimdi mevcuttur ve sistemin üretim bileşenini temsil etmektedir. Bu gidişle, bir plaka geçişi 11 tabak her döngü veya 3-4 günde sağlayacaktır. Döngü 3&#39;te Döngü 3. Döngü 2 geçişte görüldüğü gibi birden fazla plakalar geçişli Bu yöntem daha ölçeklendirilebilir, iki tabak vardırHer zaman koloniyi korumak ve 24 yeni plakaları tohum kullanılır. Geri kalan 22 plakaları, her geçiş çevriminden sonra kullanım için daha sonra kullanılabilir. Bakım döngüsü içinde herhangi bir noktada kullanıcı üretimini artırmak için daha fazla tabak tohum yapabilirsiniz. Bir örnek geçişine iki büyüme döngüleri için her sütun olacaktır. birinci geçit on iki plakalara bir plaka dönüştürür, ve on iki plakalarının her biri 144 plakaları tohum için kullanılır. Bu durumda, bir kullanıcı, bir plaka ile başlar ve iki geçit veya kültür yaklaşık 1.5-2 hafta sonra, 144 plakaları yer alır. Örneğin, fibroblast ve adipoz iPSC hatları geçide 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 25-75.000.000 hücre hazır olduğunda verim. 144 tabak nedenle yaklaşık 4-7 x 10 9 hücre temsil edebilir. Robotik 144, 96 gözlü levhalar taşıyan iş yükü nedir? Bu iş için amaçlarından biri hücre kültürü kök geleneksel (yani, 6 plaka) ile karşılaştırıldığında emek azaltılmış ölçeklenebilir kök hücre üretimi oldu. Robot accomplishes bu fiziksel beslenme ve Pasajlanması boyunca her plaka ele ihtiyacını azaltarak. Doğrusal bunun gibi 96-plaka üretim ölçekleri, geleneksel 6-kuyucuğu, bir teknisyen plakaları ile çalışan geçirdiği zaman robotik kültürü kullanarak önemli ölçüde daha az olduğu isterken. Robotik kültürünün üretim verimliliği bu fark (Şekil 9) elde edilir. Bu teknisyenler plaka yaklaşık 3.5 dakika, inkübatör 6 plaka çıkarmak mikroskop üzerinde kontrol, daha sonra aspire ve yem olabilir bulundu. Buna karşılık, teknisyenler yaklaşık 30 sn inkübatör 96 çukurlu bir plaka kaldırma ve robot üzerinde yerleştirmeden önce yoğunluğu ve kirlenme mikroskop üzerinde teftiş geçirirler. Yukarıda tarif edilene benzer genişletilmiş bir besleme protokolü ile, altı 96-yuvalı plakalar, yaklaşık 21 dakika ya da plaka başına 3.5 dakika sürer, yüklenip beslenebilir. Bir tabak beslemek için toplam geçen süre robot arasındaki karşılaştırılabilirTeknisyen robot için altı tabak (plaka başına 30 saniye muayene) işleme sadece 3 dakika harcıyor oysa ic ve manuel yöntemler, ancak elle beslemesine 6 tabak, bir teknisyen 21 dakika için gereklidir. Manuel 8 saat karşı ve robot bir hata plakaları kullanırken veya sıvı transferi yapmak asla Şekil 9 görüldüğü gibi, bir teknisyen robot kullanılarak 144 tabak taşıma geçirdiği zamanı yaklaşık 1.2 saattir. Burada açıklanan 96-kuyu iPSC kültür yöntemleri karmaşık tarama görevleri için uysal bir platform sağlamaktadır. Her bir göze, genetik olarak aynı ve aynı başlangıç ​​havuzu, aynı yoğunlukta ekildi olduğu için, değişken plaka boyunca dağıtılmış ve koşulları ayrılmasına ilişkin ticari olarak temin edilebilen rezervuarlı robot tarafından korunabilir. Bu gibi kök hücre büyüme ortamı gelişim 34,35,47, alt-tabaka ya da kültür durumu test ve kök hücreleri kullanılarak toksisite çalışmaları gibi deneyler için faydalı olacaktırHer kök hücre çizgisi optimum koloni büyüklüğü ve geçiş şartları açısından benzersiz olduğu için 51. Bir hasat sütunlar, geçişi sırasında mekanik ajitasyon ve besleme frekansı manipüle ederek ekim yoğunluğu, beslenme sıklığı ve geçit işleme modüle bu sistemi kullanabilirsiniz. Bu değişkenler yineleme kullanıcı hızlı bir şekilde yeni hat kültürü için uygun koşullar bir dizi bulmak ya da yeni kültür teknikleri geliştirmek için izin verecektir. Robotik sistem ayrıca 96 paralel ancak bağımsız kök hücre kolonileri korumak yeteneğine sahiptir. IPSC somatik hücrelerden köken veya genetik manipülasyon sonrasında klonlanmış zaman, birçok paralel klonlar potansiyel iPSC hatları elde etmek için taranır. Tek hücre 96 oyuklu plakalar içerisine ekilir sonra bu sistem besler ve her bir koloni tutma kanalı 96 oyuklu plakalar ayrılmış. Bu potansiyel klonları seçerken çok yüksek verim sağlayan ve fiziksel olarak 96 paralel çizgiler kültürleme zorluk ortadan kaldırır. Bu yöntem, aynı zamanda, birbu materyal paralel analiz için hazır böylece llows her klon üretimini büyütülüyor. Son olarak, biz ve tam otomatik kültürün sağlayan inkübatör plakaları sunan robotik plaka kaçakçılığı sistemi ile bu kültürü teknikleri entegre öngörülüyor. Bu, burada açıklanan temel protokoller diğer levha tabanlı sistemlere devredilemez beri büyük genişleme için izin daha karmaşık robotik ile gerçekleştirilebilir. protokollerde ele ilk kritik adımlar önlemek ve 1.5 ve 4.2 adımları gibi kirlenme kontrol olanlardır. Yukarıda ele alındığı gibi iyi steril bir teknik, genel anlamda kullanılmaktadır Eğer kirlilik, başarılı bir şekilde önlenebilir. Bu belirtilen adımlarda kirlenme ve bu protokolde bunu yapmak için operatör kontrol belirgin kirlenme riskini azaltacağını, ne olursa olsun kök hücre kültürü biçimi, zorunludur. Uygun hücre dışı matris jel uygulaması, ikinci bir ess olduğunuBu protokolün genel başarısı için ential adım. Düzgün 96-iyi plakaları kaplanması olmadan, kök hücreler büyüme olmaz. Bir ortak sorunu eksik kuyu kaplamadır. Deneyim hava kabarcıkları, elektrostatik çekim ve kılcal eylem tam kuyu kaplama engel olduğunu göstermiştir. Ön-ıslatma aşama (1.6) önemli ölçüde de alt kaplama arttırmak için geliştirilen ve atlanır olmamalıdır. Hücre dışı matris jel kaplama eşit şekilde iyi bir tabana ve kenarlara dağıtılmıştır uygulandığında bu ön ıslatma aşaması örneğin, plastik, 96 oyuklu plakanın belirgin hidrofobikliğini indirgemektedir. Ayrıca, bir kez yavaşça da hücre dışı matris jel çözeltisi dağılımını sağlamak için kaplanabilir temiz bir yandan karşı, 96 gözlü levhalar dokunun önerilir. ayrışma parametreleri de optimize etmek için önemlidir. Enzim veya EDTA göre ayrıştırma reaktifi ile genişletilmiş inkübasyon veya geçişi esnasında hedef olabilir de olmayabilir de tek hücreler ile sonuçlanacaktır. Bu nedenle operatörayrışma zamanı, öğütme gücü ve yıkama tekrarı koloni morfolojisi ve sağlığını etkileyebilecek ve buna göre ayarlamak nasıl özel dikkat etmelidir. Burada anlatılan teknikleri sınırlamaları anlamak başarılı çalışması için büyük önem taşımaktadır. Başka bir hücre kültürü ortamında olduğu gibi, 96 oyuklu plakaların kullanımı, nispeten yüksek bir kirlenme riski sunulur. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir teknisyenin besleme ve pasajlama boyunca her plaka taşıma olduğu; Örneğin, kapağını açarken robot yatakta plaka koyarak ve mikroskop plaka kontrol ederken. Adım 1.5 sonra belirtildiği gibi, bu nedenle, bu tür yatakta eğimli ısıtma blok veya dikey pimleri gibi herhangi bir plaka kapağın içini dokunmayın veya herhangi bir potansiyel kontamine yüzeye bu bölümü maruz değil zorunludur. Protokol gelişimi sırasında bu sınırlama keşfetti ve sterilite korumak için plaka kapakları tutmak için bir raf geliştirmek için itici güç oldu. Aynı şekilde, oluk rezervuarlar, pipet uçları ve oçevreye açık ve teknisyen tarafından ele çünkü sıvı taşıma robotu yatakta ther malzemeleri kontaminasyon potansiyel kaynaklarıdır. Bu nedenle, iyi steril bir teknik, maruz kalan kültür malzemeler veya açık sıvılar içinde hareketlerini azaltır gibi uygulanmalıdır. Diğer bir kısıtlama protokolü görsel&gt; 100 96-gözlü plakalar, her kuyu kontrol, şekilde ölçeklendirilir hantal olmasıdır. Bu şüpheli kuyu tespit etmek, görsel gibi bulanık medya gibi kontaminasyon belirtileri için bütün plaka incelenerek ele alınabilir. Gelecekteki olarak üretim için, otomatik bir mikroskop ve hücre büyümesi ve potansiyel kirlenme göstergesinin kullanımı dahil edilecektir. Özetle, burada açıklanan yüksek verimli 96-gözlü tabanlı platform bir tabak biçiminde kök hücre kültürü ve üretimi için tekrarlanabilir, yüksek sadakat yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, hücre kültürü süre kök adanmış gerekli deneyim, ekipman gerekli ve emek süresini azaltırGeleneksel yapışkan kültür avantajlarını muhafaza.

6 - İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) kullanımı bileşiği test rejeneratif tıp ve hastalık modelleme 2 2007 1 kendi türetme beri önemli ölçüde artmıştır. Bu talep, benzersiz bir miktarda somatik hücrelere ayırt edilebilir pluripotent hücreler, çok sayıda elde etmek için IPSC kapasitesi gelir. Yönlendirilmiş farklılaşma teknikleri 7 geliştirmek gibi - çok kaliteli iPSCs kitlesel üretim için gereksinimi yok, 14 - 10 ve insan hücre veya doku modelleme ve hücre tedavisinin geliştirilmesi 11 artar. 18 - Bu yaygın diğer hastalıklarda arasında, miyokard infarktüsü veya b-hücresi işlevsel değiştirme IPSC milyarlarca yüz milyonlarca gerektiren bedensel hücreleri 15 türetilmiş olacağı çağırılır. Ilaç keşfi ve t Dahası, giderek daha karmaşık 3D modelleme dokuherapy hücrelerin 9,13,19 çok sayıda talep edecek. Bu örneklerin tamamında, tanımlanan tek tip ve yeniden üretilebilir iPSCs mevcuttur ve üretilmesi kolay olması gerekir. Doku mühendisliği ve nakli için, hücre kaynaklı Biopharmaceutics ve kök hücreleri üretmek için, uygun maliyetli bir hücre üretim teknolojisi gereklidir. Bu teknikler, başarılı bir şekilde büyük ölçekli olmayan IPSC ökaryotik göre üretim için dağıtılan kısmen 28 - mikrotaşıyıcı alt tabakalar 26 kullanımı ile 25 veya süspansiyon - iPSCs ölçeklendirilmiş üretimi, süspansiyon kültüründe 20 odaklanmıştır. Çeşitli gruplar, pluripotent kök hücreleri 20,21,23,24,29 verim süspansiyon kültürü sistemleri göstermiştir. Ancak, bu yaklaşım, doku mühendisliği ve sürüş Laborat yapıyor, yeni farklılaşma programlarının geliştirilmesi araştırmacıların hazır değil pahalı ve karmaşık sistemleri kullananORY çaplı araştırma. Ayrıca, süspansiyon ve mikrotaşıyıcı iPSC kültürleri toplanmasını düzenleyen adaptasyon ve teknikleri ya da Rho-kinaz inhibitörü sürekli kullanımı gibi geleneksel yapışık iPSC kültüründe bulunmayan kimyasallar, köpük önleyici maddeler ve filtrasyon gerektirir. Hücrelere fiziksel stres mekanik ajitasyon yanı sıra mikrotaşıyıcı çarpışma sırasında tanıtıldı, süspansiyon kültüründe daha yaygındır. Bu sorunlar, hücre çizgileri süspansiyon içinde kültürlenebilir yeni kök üretilen hangi öngörülebilirlik ve hızını sınırlar. Diğerleri plaka kültürü teknikleri 30,31 taklit robotik plaka taşıma sistemlerini geliştirdik ama bu platformlar ekipman ve kök hücre kültürü ile ilişkili temel zorlukları yanında faaliyet uzmanlık için önemli yatırımlar talep ediyoruz. Aşağıdaki çalışma kendi kendine yeten, standart 8-kanal robot sıvıyı kullanan geliştirme ve ölçeklenebilir iPSC kültür sisteminin pratiğiişleyici 96 oyuklu plakalar. Bu yöntem laboratuar ölçekli iPSC kültürü ve yüksek hacimli iPSC üretimini köprü için tasarlanmıştır (örneğin, 10 7 - teknisyeni Haftada 1.5 x 10 9 hücre) yeni iPSC teknolojilerin geliştirilmesi olanlar sağlayan kolayca büyük donanım veya işçilik yatırımlar olmadan üretim büyütmek için. Bu yöntem, ayarlamak için nispeten pahalı olmayan bir kök hücre kültürü, bir programlama veya mühendislik deneyimi çok az gerektiren, özel bir hücre kültürü kaputu gerek kalmadan küçük bir ekipman alanına sahiptir, ve otomatik yüksek verimlilik orta sağlamak için standart hücre kültür teçhizatı kullanmaktadır Hücre üretimi. Amaç hücre kültürü kök yeni laboratuvarlar tarafından kullanılabilir ölçeklenebilir kök hücre kültürü yapabilen bir sistem geliştirmekti, manuel ekimi fikirlerini geliştirerek ya da kök hücrelerin çok sayıda üretmek için ekonomik bir vasıta isteyenler için bir engel bulanlar. Burada sunulan platform teknisyen etkisi kaldırırhücre kültürü kök ve tutarlı kök hücre üretimini sağlamak için besleme ve geçiş prosedürlerini normalleştirir.

<table><tbody><tr><td>96-well plates</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96-well; Well volume: 360&amp;nbsp;&amp;#956;l; Cell growth area: 0.32&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;; Individually wrapped</td></tr><tr><td>Seahorse Trough</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Gilson Tips</td><td>Gilson</td><td>F167023</td><td>10 racks gilson 96 tips D200 tips</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 powder.&amp;nbsp; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Referred to as, &quot;extracellular matrix gel&quot; in the text. Matrigel GFR, 10&amp;nbsp;ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>Referred to as, &quot;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&quot; in the text. Accutase 500&amp;nbsp;ml sterile cell solution</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS w/o Ca Mg 500&amp;nbsp;ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Pluripotent kök hücre kültüründe Devam ilerleme rejeneratif tıp, ilaç keşfi ve güvenlik testleri, bu hücrelerin kullanımı için tezgah ve Yatağımın arasındaki uçurumu kapatıyor. Doku mühendisliği ve nakli için, hücre kaynaklı Biopharmaceutics ve kök hücreleri üretmek için, uygun maliyetli bir hücre üretim teknolojisi gereklidir. Pluripotensin ve zamanla downstream uygulamalar (örneğin, hücre farklılaşması) hücrelerin istikrarlı performans Bakım büyük ölçekli hücresi üretimi için her şeyden önemlidir. Oysa o operatörün ciddi değişkenlik tanıtmak yanı sıra ölçek-up pahalı olabilir nerede hücrelerin elle kültüre, özellikle elde etmek zor olabilir. Minimal teknisyen katılımını veya deneyim gerektiren sıvı robot taşıma geliştirilen çok kanallı bir tezgah üstü kullanılarak operatör etkisi roman kök hücre kültürü protokolleri yüksek verimlilik, büyük ölçekli kök hücre üretimini etkinleştirmek ve kaldırmak için. IleBu protokoller, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doğrudan donmuş stoktan besleyici içermeyen koşullar kültürlendi ve 96 oyuklu plakalar içinde muhafaza. Ne zaman geçişine hücre hattı ve istenen ölçek büyütme oranına bağlı olarak, operatörün kolayca bölme için optimal koloni yoğunlukları gösteren görüntülerin bir dizi dayalı belirleyebilirsiniz. Sonra gerekli reaktifler, bir santrifüj aşaması olmadan yeni plakalara bir koloni bölünmüş gerçekleştirmek için hazırız. 20 pasajlar (~ 3 ay) sonra, iki iPSC hatları, kararlı karyotip tutulan kök hücre belirteçleri ifade ve yüksek verimlilik ile kardiyomiyositlere ayrışmıştır. Sistem 96 oyuklu plakalar için tasarlanmış yeni bir farklılaşma protokolleri veya genetik manipülasyon daha sonra, yüksek veri akışı taramasını gerçekleştirmek olabilir. Bu teknoloji uygulamaları sayısız için aynı kök hücrelerin çok sayıda üretmek için emek ve teknik yükünü azaltacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Bir Robotik Sıvı İşleme Sisteminin Kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi iPSC Kültür Bazlı Plaka ve Üretim

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.5K Görüntüleme.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

Video: Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetik

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Biyomühendislik

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Biyoloji

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Otomatik Kültür Sistemi Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Farklılaşması

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Tekrarlanabilirlik için iPSC Kültürünü Otomatikleştirme 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Gelişim Biyolojisi

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.

Bir Robotik Sıvı İşleme Sisteminin Kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi iPSC Kültür Bazlı Plaka ve Üretim

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen